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FABP5促进RAW264.7细胞氧化LDL的初步研究
目的:探究RAW264.7细胞中脂肪酸结合蛋白5(FABP5),磷脂酶A2 (PLA2),不饱和脂肪酸(UFAs)在低密度脂蛋白(LDL)氧化中的作用.方法:培养RAW264.7细胞,利用UFAs中的不同浓度的油酸(OA)、亚油酸(ALA)、花生四烯酸(AA)刺激后利用Western Blot检测细胞FABP5蛋白质水平;用LDL刺激RAW264.7细胞不同时间,分别用PLA2总活性分光光度法定量检测试剂盒测定细胞内PLA2活性变化,Real-time PCR及WesternBlot测定FABP5基因的表达;LDL刺激细胞后分别测定脂质筏和非脂质筏FABP5蛋白质水平,探究FABP5的转位.结果:不同浓度的OA,ALA,AA长时间刺激RAW264.7细胞后,FABP5的蛋白表达量出现不同的变化;LDL短时间刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7后,细胞内PLA2活性升高;LDL刺激RAW264.7细胞较长时间后,FABP5的mRNA和蛋白质水平均较对照组上升;提取脂质筏后发现,LDL刺激15 min的巨噬细胞的脂筏中FABP5水平较对照组的升高,而非脂筏部分则出现相反的结果.结论:推测LDL刺激会激活PLA2,而PLA2水解甘油磷脂产生UFAs,这些UFAs招募并结合FABP5,激发氧化应激通路,促进LDL的氧化.
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脂筏在CB2受体介导的内源性大麻素AEA抑制大鼠肝星状细胞增殖活性中的作用
目的 探讨脂筏在内源性大麻素受体2(CB2)介导的内源性大麻素(AEA)抑制大鼠肝星状细胞(HSC)增殖活性中的作用及作用机制.方法 构建大麻素受体2 shRNA(Cnr2-shRNA)转染HSC细胞,干扰CB2受体的表达,采用MTT法检测转染前后不同浓度的AEA和甲基-β-环糊精(MCD)对HSC的作用效应;采用Western blot检测不同浓度AEA及MCD作用后HSC中P38 丝裂原活化蛋白激酶(p-P38MAPK)和c-Jun氨基端激酶/应激活化蛋白激酶(p-JNK)的表达量;采用激光共聚焦法检测HSC上的脂筏(LRs)以及CB2受体的表达;蔗糖密度梯度离心法提取脂筏,Western blot鉴定脂筏并检测脂筏中CB2受体的表达.结果 成功构建Cnr2-shRNA转染筛选Cnr2-单克隆细胞株,MTT检测发现转染后CB2受体的减少能减弱AEA对HSC细胞增殖的抑制作用,然而用MCD预处理HSC细胞后CB2受体的减少对AEA的效应无明显影响.p-P38MAPK和p-JNK的表达与AEA浓度有依赖关系,且可以被MCD部分拮抗.CB2受体在HSC膜脂筏和胞质中均有表达,但用蔗糖密度梯度离心法提取AEA刺激前HSC细胞脂筏,发现未受AEA刺激时脂筏中含有的CB2受体量很少,CB2受体大部分存在于HSC细胞胞质中.结论 CB2受体参与AEA 抑制HSC细胞增殖的过程与脂筏相偶联,通过脂筏这个信号平台AEA的刺激可能使CB2受体聚集或增多从而发挥级联放大效应,且这一效应与细胞中p-P38MAPK和p-JNK信号途径的激活有关.脂筏和CB2受体介导的信号传导途径可能成为治疗肝纤维化有效的作用靶点.
关键词： 内源性大麻素 脂筏 肝星状细胞 内源性大麻素CB2受体 -
STIM1及其相关蛋白在脂筏介导的细胞内钙信号中的作用机制
脂筏是膜脂双层内富含特殊脂质(胆固醇和鞘脂)和蛋白质的微区,脂筏作为独特的信号转导平台不仅可以为内部分子提供一个"交流"的环境,也有助于加快信号传递.Ca2+作为重要的信号分子,参与调控细胞许多生理功能.细胞内Ca2+浓度受各种信号分子,钙泵和钙池操纵的Ca2+内流等多种因素调节.新研究发现:瞬时受体电位通道的一些成员、基质相互作用分子1以及Orai1在钙池操纵的钙通道介导的Ca2+内流过程中发挥着重要的作用.大量Ca2+通道和蛋白质(包括钙信号途径的关键蛋白)在脂筏微区集聚,脂筏功能越来越受到人们的关注.
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哺乳动物腺苷酸环化酶亚型的研究进展
腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase,AC)作为G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)下游的关键信号分子,参与了多种生理和病理进程.由于存在多种AC亚型(AC1～9及sAC),且各个膜型AC亚型在组织及不同细胞膜微区(脂筏)的分布、定位、活性及表达水平不尽一致,目前对AC的研究越来越深入.本文将对各个AC亚型的分布、定位及调控特性的研究进展作一综述.
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脂筏在高血压发病机制中的作用
原发性高血压的发病机制尚未完全明确,随着脂筏结构与功能的不断阐明,它与高血压之间的关系越来越密切.脂筏与细胞的许多重要功能有关,高血压的多种信号转导事件的发生是通过定位于脂筏及caveolae的细胞膜受体,所以脂筏在高血压的发生发展过程中起了重要的调控作用.与高血压发病机制相关的因素,如内皮型一氧化氮合成酶、细胞外钙受体、NADPH氧化酶、Rho激酶、胰岛素受体、Ca2+以及转化生长因子和丝裂原蛋白激酶信号转导通路等,这些蛋白和信号分子都定位于脂筏或者受脂筏调控,从而为脂筏与高血压发病机制之间的关系提供了更加充分的证据.本文将对各相关蛋白和信号转导与高血压的形成原因作一综述.
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脂筏蛋白与Cb1相关蛋自在葡萄糖转运中的信号转导机制
目前发现至少有两条胰岛素刺激葡萄糖转运蛋白4易位的信号转导通路:PI3K途径和Cb1相关蛋白(CAP)/Cb1途径.在CAP/Cb1途径中,CAP是关键性信号分子,这一信号途径依赖于脂筏上的特定蛋白共同参与完成.脂筏蛋白是存在于脂质筏上的一类特殊蛋白,包括小窝蛋白、浮舰蛋白等,有特殊的结构和功能,参与葡萄糖转运中的信号传递.
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老年人淋巴细胞亚群和脂筏GM1与胆固醇水平的相关性
目的 研究老年人淋巴细胞亚群、脂筏标志分子单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)和细胞活化与血清胆固醇水平的相关性,探讨高胆固醇水平调节淋巴细胞功能的分子机制以及与动脉粥样硬化的关系.方法 样本采用在时间上随机抽样的方法选取2012年8月至2014年9月在天津医科大学总医院体检者60例,年龄60～ 80岁,其中女30例,男30例.采用抗体染色、流式细胞仪检测外周血中总B淋巴细胞(CD19+)、记忆B淋巴细胞(CD19+ CD27+)、初始B淋巴细胞(CD19+ CD27-)、总T淋巴细胞(CD3+)、CD3+ CD4+和CD3+ CD8+T淋巴细胞亚群比例以及神经节苷脂GM1水平;采用细胞内染色方法检测活化细胞内磷酸化Stat3的水平,并与胆固醇水平和动脉粥样硬化的发生进行相关性分析.结果 CD19+B淋巴细胞比例与低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)水平、CD19+ CD27+B淋巴细胞比例与极低密度脂蛋白胆固醇(VLDLC)水平呈显著正相关(P＜0.05);CD3+T淋巴细胞、CD3+ CD4+和CD3+ CD8+T淋巴细胞比例与胆固醇水平无相关性(P＞0.05);记忆B淋巴细胞GM1水平与总胆固醇(TC)和VLDLC、CD3+ CD8+T淋巴细胞GM1水平与高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)均呈显著正相关(P＜0.05).与正常胆固醇组比较,在BCR抗体刺激后,高胆固醇组记忆B淋巴细胞中磷酸化Stat3水平显著升高(P＜0.01).结论 高胆固醇水平是老年人动脉粥样硬化发生的重要危险因素,同时高胆固醇水平与B淋巴细胞比例、脂筏GM1水平、Stat3的活化以及CD3+ CD8+T淋巴细胞GM1水平的相关性,提示其可能调节淋巴细胞增殖、活化、炎症因子的产生,从而促进动脉粥样硬化的发生和发展.
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神经元细胞膜脂筏结构原子力显微镜研究
目的测定小鼠神经元细胞膜脂筏纳米尺度三维结构.方法应用原子力显微镜(AFM)测定纯化的小鼠神经元膜脂筏.结果可见神经细胞单个脂筏的凹陷盘状圆形三维结构,周围高,边缘不完整,中间凹陷,直径在117～120 nm左右.结论神经细胞膜脂筏结构为直径100nm左右的扁圆形中间凹陷结构.AFM可以在纳米水平对细胞器进行三维结构测定.
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系统性红斑狼疮患者外周血B细胞脂筏表达变化及地塞米松对其的影响
目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血B淋巴细胞脂筏表达及糖皮质激素对其的影响.方法 用霍乱毒素B亚单位(CTB)对B细胞脂筏染色,采用流式细胞仪检测SLE患者(SLE组)及健康对照者(健康对照组)外周血B细胞亚型(CD5)及脂筏的表达.分离B细胞,地塞米松(DEX)干预培养活动期SLE患者B细胞1h,流式细胞仪及共聚焦显微镜检测B细胞脂筏及其调控蛋白F－actin.同时记录受试患者的临床资料.结果 SLE组外周血B细胞脂筏表达较健康对照组明显增高,活动期 SLE组高于缓解期SLE组(P均＜0.01).与健康对照组对比,CD5 +B细胞比例未见异常,但SLE组CD5 +B细胞脂筏表达增多.活动期SLE患者脂筏呈荧光强度增加及异常聚集,F－actin表达下调.同时,B细胞脂筏表达率与狼疮活动积分(SLEDAI)呈正相关.地塞米松干预后,B细胞脂筏表达率及荧光强度均明显下降(P均＜0.05),伴随着F－actin表达的增加.结论 脂筏异常表达和分布可能对B细胞过度活化具有重要作用,糖皮质激素对活动期SLE B细胞脂筏的表达存在一定的下调作用.
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ECRG4蛋白与细胞膜上胆固醇之间的相关性研究
目的 探讨ECRG4在脂筏中分布及与细胞膜胆固醇含量的相关性.方法 通过RT-PCR及Westernblot鉴定ECRG4阳性表达细胞株,用甲基-β-环糊精去除细胞膜上的胆固醇,超速离心的方法分离细胞膜,Western blot检测ECRG4蛋白含量变化.密度梯度离心制备脂筏,通过Western blot检测ECRG4蛋白水平.结果 ECRG4在DU4475细胞中高表达,降低细胞膜上胆固醇后,ECRG4水平未发生明显变化；同时Western blot结果证实ECRG4未分布于脂筏.结论 ECRG4蛋白未定位于脂筏,且与细胞膜胆固醇之间无相关性.
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脂筏结构在细胞内蛋白质运输中的作用
在细胞膜中存在由胆固醇、鞘糖脂以及蛋白质等成分组成的液态有序的结构,叫做脂筏.从内质网到高尔基体再到细胞质膜,脂筏结构在细胞膜中所占的比例越来越高.脂筏在高尔基体到细胞质膜的物质转运以及细胞内吞、再循环过程中发挥着重要的作用.本文将就脂筏结构在物质从高尔基体到质膜的转运和细胞内吞过程中的作用及其分子机制做一综述.
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脂筏对跨膜型TNF-α信号的影响
目的 构建仅定位在脂筏内或外的tmTNF-α突变体,研究脂筏与tmTNF-α生物学功能的关系.方法 通过重组PCR,构建C-47A-tmTNF-α-pIRES2-EGFP,cav-tmTNF-α-pIRES2-EGFP重组质粒.采用激光共聚焦观察定位、蔗糖密度梯度离心法提取脂筏、MTT比色法检测胞毒.结果 获得了预期突变,且无任何其它点突变,移码及缺失突变的突变体.tmTNF-α部分定位在脂筏内,效应细胞的胞毒与tmTNF-α定位在脂筏内外无关,而破坏靶细胞脂筏结构导致胞毒效应下降,且与I-CAM-1相关.结论 效应细胞的胞毒与脂筏无关,而靶细胞与脂筏密切相关,该研究有助于进一步认识tmTNF-α介导的生物学功能与脂筏间的关系.
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细胞膜"脂筏"的研究进展及相关疾病
细胞膜主要由脂质双分子层及膜蛋白组成,脂筏是膜脂双层内含有特殊脂质和蛋白质的功能微区,不仅参与细胞的信号转导和跨膜转运,而且与一些疾病的发生密切相关.
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p57与细胞膜上胆固醇的相关性分析
目的:检测生理状况下p57蛋白与细胞膜上的胆固醇之间的相关性.方法:使用不同工作浓度的mβCD抽提U937细胞膜上的胆固醇,再利用超速离心分离细胞膜组分,并利用Western blot技术检测细胞膜上p57蛋白含鼍的变化.利用非连续蔗糖密度梯度离心制备脂筏,并利用Western blot技术检测脂筏上的p57蛋白含量.结果:在mβCD降低细胞膜上胆固醇含量之后,p57在膜组分中的含量的变化不大.此外,在脂筏中未检测到p57的存在.结论:与病原性分枝杆菌等所导致病理状态不同,在生理状态下p57蛋白与细胞膜上的胆固醇之间尚未观察到相关性.
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凋亡诱导配体TRAIL与细胞膜脂筏形成的关系
目的: 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与细胞膜微结构域脂筏的关系.方法: 采用间接免疫荧光流式细胞术, 分析K562细胞表面TRAIL分子的表达.用FITC标记的霍乱毒素B亚单位(CTx)对K562细胞的脂筏进行染色; 用抗FITC单克隆抗体(mAb)交联脂筏后, 以兔抗TRAIL分子抗体及Cy3标记的羊抗兔抗体进行间接免疫荧光染色, 激光共聚焦显微镜分析TRAIL分子与脂筏微结构域的关系.结果: FITC-CTx和抗FITC mAb可使脂筏发生交联.脂筏交联的同时TRAIL分子发生聚集.动态观察表明, 抗FITC抗体作用20 min后, 脂筏发生交联, 作用30 min时交联明显; 随着脂筏的交联, TRAIL分子发生聚集. 抗FITC抗体作用40 min后, 脂筏交联程度减弱, 且TRAIL分子逐渐被排除于脂筏之外.结论: 抗FITC抗体可用于CTx-FITC脂筏染色后脂筏交联的研究.TRAIL分子可能与细胞膜脂筏微结构域有关.
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Flot2基因与恶性肿瘤的关系
脂筏是生物膜上具有重要生物学功能的微结构域,近年来有越来越多的研究发现其特征蛋白Flot2基因在鼻咽癌、乳腺癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤等肿瘤中存在异常表达,体内外实验表明其与肿瘤的增殖、侵袭和转移密切相关.本文就Flot2基因的结构、功能及其与恶性肿瘤关系的研究进展做一综述.
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泛素连接酶cbl家族蛋白调控死亡受体信号通路的研究进展
死亡受体信号通路是引起细胞凋亡,维持细胞稳态的重要途径,对监视机体肿瘤具有重要意义.死亡受体通路主要包括三条:TNFα及其受体途径,FasL/Fas途径,TARIL及其受体DR4/5途径.近年来,关于cbl家族蛋白调控死亡受体通路的研究越来越多.cbl家族蛋白作为泛素连接酶Ring-finger结构域家族的重要成员之一,通过调节蛋白的泛素化,参与体内的多种生理过程.本文就死亡受体、脂筏、生存通路及其它分子四个方面,综述cbl家族蛋白调控死亡受体信号通路的研究进展.
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表阿霉素提高胃癌BGC823细胞对TRAIL的敏感性
目的:研究表阿霉素对TRAIL诱导胃癌细胞BGC823细胞凋亡的影响,探讨脂筏和死亡受体4(DR4)在TRAIL诱导细胞凋亡中的作用.方法:采用MTT法测定细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡,免疫荧光显微技术检测脂筏和DR4在细胞膜的分布.结果:(0.1-50)μg/ml表阿霉素处理BGC823细胞24h,抑制细胞增殖50%的药物浓度(IC50)为(4.61±0.62)μg/ml.在BGC823细胞中,100ng/ml的TRAIL导致轻度的增殖抑制和细胞凋亡,TRAIL(100ng/ml)联合表阿霉素(4.61μg/ml)引起明显的增殖抑制和细胞凋亡(P<0.05).与对照组相比,100ng/ml的TRAIL作用BGC823细胞24 h,没有引起明显的脂筏聚集或DR4聚集.表阿霉素(4.61μg/ml)明显促进脂筏聚集和DR4聚集,同时观察到DR4和脂筏的共定位.表阿霉素和TRAIL联合作用24 h,同样观察到DR4定位在聚集的脂筏内.结论:表阿霉素通过促进DR4在脂筏聚集增强TRAIL诱导的胃癌BGC823细胞凋亡.
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脂筏在GDNF与其受体相互作用中的意义
目的:探讨脂筏对于GDNF与其膜受体相互作用的影响.方法:MN9D细胞和SD大鼠随机分成三组:GDNF组、PBS组、空白对照组.两种方式处理三组样品:破坏和不破坏细胞膜上的脂筏.通过免疫共沉淀和免疫印迹检测破坏脂筏前后GDNF及其配体结合受体GFRα1与四种膜受体(RET,NCAM140,integrinβ1和N-cadherin)之间的结合情况.结果:细胞膜上的脂筏未被破坏前,四种膜受体都能够与GDNF结合发生免疫共沉淀.脂筏被破坏后,GDNF只能与RET和N-cadherin结合发生免疫共沉淀,并且这种结合在GDNF组中多;而GFRα1只能和RET结合发生免疫共沉淀.结论:膜受体介导的GDNF生物学作用均可发生在脂筏这一平台上,脂筏在GDNF与其受体相互作用中扮演着重要角色.
关键词： 脂筏 GDNF 膜蛋白 RET NCAM140 Integrinβ1 N-cadherin -
脂代谢紊乱在阿尔茨海默病发病机制中的作用
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年期痴呆常见的疾病之一.AD临床隐袭起病,表现为认知功能和日常生活能力持续恶化,病理上以老年斑、神经原纤维缠结、神经元丢失及淀粉样血管病等为特征.其病因学和发生机制目前仍然知之甚少.近年来越来越多的研究证实脑内胆固醇代谢紊乱和AD的发病有密切的关系.本文就AD患者脑内胆固醇代谢的改变,探讨胆固醇代谢紊乱在AD发病机制中的意义,这将对研究阿尔茨海默病的病理生理机制以及探索其预防治疗方法具有重要意义.
