首页 > 文献资料
-
邻苯二甲酸二丁酯对成年大鼠睾丸Leydig细胞中Cx43蛋白表达及睾酮分泌的影响
目的:观察邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对成年大鼠睾丸Leydig细胞中连接蛋白43 (Cx43)的表达及睾酮分泌的影响,探讨DBP对睾酮的调节是否与Cx43有关联.方法:将SD大鼠无菌脱臼处死,原代培养纯化Leydig细胞,将细胞分为溶剂对照组(0.1％DMSO)、DBP组(50 mg.L-1 DBP)、Cx43增强剂组(50 mg.L-1 DBP+10 μmol.L-1 PGE2)和特异睾酮阻断剂组(40 μmol.L-1氟他胺),分别处理细胞24 h;放射免疫法测定Leydig细胞睾酮水平;细胞免疫荧光和Western blotting法检测细胞中Cx43蛋白表达.结果:细胞染毒24 h后,与DMSO组比较,DBP组Leydig细胞中Cx43蛋白表达水平和睾酮水平均降低(P＜0.05);与DBP组比较,DBP+ PGE2组Leydig细胞中Cx43表达水平升高(P＜0.05),但睾酮水平变化不明显(P＞0.05);与DMSO组比较,氟他胺组Leydig细胞中睾酮水平和Cx43蛋白表达水平均明显降低(P＜0.05).结论:DBP对睾酮分泌及Cx43表达均有影响,Cx43对睾酮合成无抑制作用,而睾酮可反向调节Cx43表达;DBP对Leydig细胞睾酮合成抑制作用并不一定以Cx43为靶点.
-
邻苯二甲酸酯类生殖内分泌毒性
近年来,有多篇文献报道了人类的生育能力特别是精子的质量和数量已发生了显著的下降[1].究其原因,可能与人类长期暴露于环境中的某些化学物质有关,尤其是在机体内对正常内分泌功能具有干扰作用的化学物质,即环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptors,EEDs).其中邻苯二甲酸酯类(phthalic acid esters,PAEs)已被确认为EEDs.在动物实验中,已证明PAES能干扰正常的生殖功能.本文对PAEs生殖内分泌毒性作一综述.
-
活化T细胞核因子参与皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞凋亡
目的:研究皮质酮诱导大鼠Leydig细胞凋亡过程中活化T细胞核因子的激活及其功能.方法:经免疫印迹和免疫组织化学技术检测活化T细胞核因子在大鼠Leydig细胞中的表达.通过观察环孢菌素A处理对皮质酮诱导Leydig细胞凋亡的影响评价活化T细胞核因子参与此凋亡的潜在可能性.以激光共聚焦技术监测皮质酮处理Leydig细胞后胞质内钙离子浓度的变化.皮质酮单独或与环孢菌素A共同处理Leydig细胞12小时后,经免疫印迹技术检测活化T细胞核因子在胞质及核内表达水平的变化.通过观察过表达活化T细胞核因子2和环孢菌素A抑制活化T细胞核因子活化对凋亡和FasL表达的影响,进一步评价活化T细胞核因子2在皮质酮诱导大鼠Leydig细胞凋亡中的作用.结果:发现Leydig细胞主要表达活化T细胞核因子2.环孢菌素A可阻断皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞凋亡.皮质酮处理使胞质内钙离子浓度显著升高.皮质酮处理使活化T细胞核因子2在胞质内的表达水平下降,在核内的表达量增加.环孢菌素A可阻止此核的转移过程.过表达的活化T细胞核因子2可促进皮质酮诱导的Leydig细胞凋亡,上调FasL表达;相反,环孢菌素A可阻止皮质酮处理的大鼠Leydig细胞中的FasL表达上调,抑制细胞凋亡发生.结论:在皮质酮诱导大鼠Leydig细胞凋亡过程中,活化T细胞核因子2被激活,活化T细胞核因子2通过上调FasL表达促进细胞凋亡.
-
Cox7a2和ATP50在原代培养小鼠Leydig细胞和人体不同器官的表达研究
目的 研究线粒体呼吸链相关基因Cox7a2,ATP50在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞和人体各器官组织中的表达特征.方法 原代培养小鼠睾丸Leydig细胞并鉴定,利用RT-PCR方法 研究Cox7a2,ATP50在Leydig细胞中的表达.利用PCR方法 研究Leydig在人体各重要脏器组织的表达谱.结果 Cox7a2,ATP50在原代小鼠睾丸Leydig细胞中表达,Cox7a2和ATP50在各个脏器旱现出不同的表达特征.结论 Cox7a2,ATP50表达在原代小鼠睾丸Leydig细胞中,研究Cox7a2,ATP50在人体各器官的表达特点,为基因的功能研究奠定了前期基础.
-
Atp50和coxⅦa在大鼠Leydig细胞中的表达与鉴定
目的前期研究发现呼吸链相关酶cox7A2和Atp合成酶亚单位Atp50在青年和老年睾丸组织中存在明显表达差异.本研究观察两者同源序列Atp50和coxⅦa在原代培养的大鼠Leydig细胞中的表达情况,为其在雄激素合成和睾丸衰退中的作用研究奠定基础.方法分离培养大鼠Leydig细胞,提取细胞总RNA,通过RT-PCR扩增目的片断,PCR产物进行TA克隆、测序鉴定.结果RT-PCR可见Atp50和coxⅦa表达,目的片段大小分别是438bp和358bp.PCR产物片段TA克隆测序结果与原序列一致率分别为99.7%和99.8%.结论RT-PCR和TA克隆测序结果证明大鼠睾丸Leydig细胞中存在coxⅦa和Atp50表达,对于其可能参与调节睾酮合成过程则有待于进一步研究.
-
FasL启动子调控的报告基因表达质粒的构建及活性分析
目的扩增FasL启动子并构建带有FasL启动子的荧光素酶报告质粒,并评价在皮质酮(啮齿类动物体内的糖皮质激素)作用的睾丸Leydig细胞中,由FasL启动子调控的荧光素酶的表达活性.本研究将为进一步分析Leydig细胞中FasL启动子转录调控的作用机制奠定基础.方法采用DNA重组技术构建由FasL启动子调控的荧光素酶报告基因的表达质粒.此重组质粒经阳离子脂质体LipofectAMINE介导,瞬时转染入Leydig细胞中,36h后细胞经皮质酮处理,并于48h时收集细胞.测定荧光素酶的相对表达活性.结果(1)酶切及测序证实成功扩增FasL基因启动子并构建了带有FasL基因启动子的报告基因表达质粒;(2)皮质酮处理的Leydig细胞中FasL启动子调控的荧光素酶表达质粒的表达活性显著增高.结论构建成功的带有FasL启动子的荧光素酶报告质粒可准确地评价FasL启动子在凋亡过程中的作用.
-
Egr参与调控皮质酮处理的睾丸Leydig细胞中FasL启动子的活性
目的观察转录因子Egr(early growth response factor,早期生长反应因子)是否参与调控皮质酮处理的Leydig细胞中FasL启动子的活性.方法经RT-PCR检测皮质酮处理的Leydig细胞中Egr-2及Egr-3的mRNA的水平,采用双荧光素酶报告基因系统评价Egr-2和Egr-3表达载体对eyydig细胞中FasL启动子活性的影响.结果Leydig细胞经皮质酮处理后,细胞内Egr-2及Egr-3在转录水平呈显著上调.双荧光素酶报告基因检测发现,Egr-2及Egr-3表达载体均可上调皮质酮处理的Leydig细胞中FasL启动子的活性,并以Egr-3的作用为显著.结论Egr-2及Egr-3参与调控皮质酮处理的Leydig细胞中FasL启动子的活性.
-
Ca2+和CaN凋亡信号通路参与皮质酮诱导的Leydig细胞凋亡中FasL的表达
目的观察在皮质酮诱导的大鼠Leyydg细胞凋亡中,Ca2+和钙调神经磷酸酶(CaN)依赖的信号通路是否参与FasL表达的调控.方法利用钙定性探针Fluo-3/AM检测皮质酮作用下的Leydig细胞中Ca2+浓度变化.通过酶底物法测定CaN活性.以Western blot检测FasL表达.用Annexin-V-FITC和PI双标评价Leydig细胞凋亡率.结果经超生理剂量皮质酮处理的Leydig细胞中出现Ca2+浓度升高,CaN活性增加及FasL表达增加.环孢菌素A可抑制CaN活性,使FasL表达下调,细胞凋亡率下降.结论 Ca2+和CaN依赖的信号通路参与了皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞凋亡;CaN介导了由Ca2+引发的FasL表达,Ca2+和CaN在大鼠Leydig细胞凋亡过程中起重要作用.
-
邻苯二甲酸二乙基己酯对小鼠胚胎Leydig细胞毒性作用研究
目的 探讨邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)对小鼠胚胎睾丸间质细胞(Leydig细胞)的毒性作用.方法 小鼠胚胎Leydig细胞体外原代培养.观察DEHP导致的Leydig细胞形态及超微结构改变,用MTT法和Annexin-V/PI流式细胞术分别检测DEHP在培养基内终浓度为25、50、100和200mg/L时对Leydig细胞活力影响及毒性作用.结果 Leydig细胞活力随着DEHP浓度增加和作用时间延长而明显下降.Annexin-V/PI流式细胞术检测提示:死亡细胞比例随DEHP浓度升高和作用时间延长而显著增加,同时细胞增殖速度变慢,甚至增殖停止,伴随一系列细胞形态学及超微结构改变,呈剂量、时间依赖关系.结论 DEHP能降低Leydig细胞的活性并促进其死亡,有明显细胞毒性.
关键词： 邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP) 胚胎 Leydig细胞 -
皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞凋亡中caspase-3活化途径的研究
目的我们新近的研究表明,超生理剂量的皮质酮(大鼠体内的糖皮质激素)可通过激活caspase-3诱导大鼠Leydig细胞凋亡.本研究拟评价在皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞凋亡过程中,caspase-3的激活是否有其上游的caspase-8和caspase-9的参与.方法采用荧光分光光度法检测经皮质酮处理的大鼠Leydig细胞中caspase-8活性,以DNA梯状电泳条带作为评价细胞凋亡的指标,观察caspase-8抑制剂是否能够抑制细胞凋亡,采用RT-PCR检测皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞中caspase-9的mRNA水平.结果在皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞中出现caspase-8活性增高,以12h为显著,升高的caspase-8的活性可被caspase-8抑制剂抑制,并导致Leydig细胞的凋亡过程被阻断.Leydig细胞中caspase-9的mRNA水平在皮质酮作用下上升,同样以12h为显著.结论皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞凋亡与caspase-8和caspase-9有关.
-
皮质酮诱导大鼠Leydig细胞凋亡是一经caspase-3激活的过程
目的超生理剂量的皮质酮(大鼠体内的糖皮质激素)能诱导大鼠Leydig细胞凋亡.但有关皮质酮诱导Leydig细胞凋亡的细胞内机制尚不清楚.本研究旨在观察皮质酮是否经caspase-3激活的途径诱导大鼠Leydig细胞凋亡.方法采用Western Blot方法检测不同时间点上经皮质酮处理的大鼠Leydig细胞中caspase-3酶原及裂解的caspase-3酶表达情况.运用荧光发光法检测不同时间点上经皮质酮处理的大鼠Leydig细胞中caspase-3酶活性.结果caspase-3酶原表达水平在皮质酮处理6h时开始上升,12h及24h时表达量下降,而具生物活性的、裂解的caspase-3酶于12h时开始出现,24h时的表达水平为显著.caspase-3酶活性在皮质酮处理12h时明显升高,以24h时为显著.Caspase-3抑制剂DEVD-CHO对经皮质酮处理12、24及48h的Leydig细胞中的caspase-3酶活性均具有明显的抑制作用,加caspase-3抑制剂的处理组其细胞基因组DNA电泳未见有凋亡特征性的梯状条带.结论皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞凋亡是一经caspase-3激活的过程.
-
转醛酶与青春期小鼠Leydig细胞生成睾酮的相关性研究
目的研究青春期小鼠Leydig细胞中转醛酶活性、蛋白表达水平与睾酮生成的相关性.方法原代培养Leydig细胞,加入HCG刺激,酶联免疫法测定培养2、8小时细胞上清睾酮浓度,同时测定转醛酶活性,Western blot检测转醛酶蛋白表达水平.结果 (1) 刺激组Leydig细胞上清睾酮浓度明显高于对照组,组间存在显著性差异(2小时P<0.01,8小时P<0.001).(2) 刺激组Leydig细胞转醛酶活性明显高于对照组,组间存在显著性差异(2小时P<0.05,8小时P<0.001).(3) Leydig细胞刺激组和对照组间转醛酶蛋白表达水平无显著差异(P>0.05).结论 HCG促进小鼠Leydig细胞生成睾酮的同时,转醛酶活性同步提高,证实转醛酶活性与小鼠Leydig细胞合成睾酮密切相关.
-
11β-HSD控制糖皮质激素对睾酮合成抑制的研究--11β-HSD mRNA的表达
已往的研究发现,大鼠Leydig细胞中的11β-羟类固醇脱氢酶(11β-HSD)通过控制细胞内皮质酮(大鼠体内的糖皮质激素)浓度调节睾酮合成.本研究通过观察11β-HSD活性可调的大鼠动物模型中Leydig细胞内11β-HSDmRNA的表达情况,以明确这些表达是否和酶活性测定结果具有一致性.结果表明,大鼠Leydig细胞中的11β-HSDmRNA的表达量和其酶活性水平具有明显的一致性.在大鼠体内,生理水平或高浓度的皮质酮调节Leydig细胞中11 β-HSD活性是通过调节细胞中稳定性mRNA的表达实现的.
关键词： Leydig细胞 11β-羟类固醇脱氢酶 糖皮质激素 mRNA表达 -
衰老的Leydig细胞中睾酮合成降低的机制
睾酮是男性体内主要的雄激素.老年男性体内睾酮水平下降使机体呈现肌肉松弛、骨质疏松和性欲减退等衰老现象,这与睾酮合成减少及其分泌节律改变密切相关.除了肾上腺皮质有少量分泌以外,睾酮主要由睾丸间质中的Leydig细胞生成.对于衰老Leydig细胞中睾酮合成减少的机制的研究已有不少报道,影响Leydig2细胞雄激素合成的因素可以分为两个方面:一是细胞外环境的改变,另一方面是Leydig细胞合成睾酮的功能减退.
-
睾丸间质内巨噬细胞对Leydig细胞发育与功能的影响
在哺乳动物体内,95%的雄激素由睾丸间质中的Leydig细胞分泌.间质中的内含物主要包括Leydig细胞、臣噬细胞、淋巴管和血管等.成年大鼠Leydig细胞与臣噬细胞的比例约为4:1左右.巨噬细胞与Leydig细胞混杂在一起,彼此紧密相邻,Leydig细胞的指状突起被巨噬细胞的胞质内陷包埋.
-
Leydig细胞睾酮合成的调节
睾丸由间质和生精小管两部分组成.间质中的内含物主要包括Leydig细胞、巨噬细胞、淋巴管和血管等;生精小管由支持细胞(Sertoli细胞)和不同发育期的生精细胞共同组成生精上皮,其外包有基膜和类肌细胞.哺乳动物体内的雄激素95%由睾丸Leydig细胞分泌,肾上腺皮质的网状带仅分泌少量雄激素.
-
Leydig肿瘤细胞中GR表达量改变与皮质酮诱导的细胞凋亡的相关性
目的 以小鼠Leydig肿瘤细胞(MLTC)为细胞模型,探讨细胞中糖皮质激素受体(GR)表达量改变与应激水平皮质酮(CORT)诱导的细胞凋亡的相关性.方法 GR过表达实验分为GR质粒组、空载质粒组和空白对照1组,采用基因克隆技术使GR质粒组MLTC中的GR呈过表达状态,Western blotting检测验证；GR低表达实验分为空白对照2组、脂质体对照组、GRsiRNA组和对照siRNA组,采用RNA干扰技术使GR siRNA组MLTC中的GR呈低表达状态,Western blotting检测验证.以应激水平的CORT(终浓度200 nmol/L)处理两种实验分组的MLTC(GR过表达+CORT组、空载质粒+CORT组、空白对照1组和GR低表达+CORT组、对照siRNA+CORT组、空白对照2组),分别以CORT处理的空白对照1、2组MLTC作为单纯CORT处理1,2组；流式细胞术检测各组MLTC细胞凋亡率,分析GR表达与细胞凋亡率的相关性.结果 GR过表达+CORT组、空载质粒+CORT组、单纯CORT处理1组和空白对照1组的细胞凋亡率分别为(36.6±0.6)％、(23.8±0.8)％、(24.3±0.6)％和(4.1±0.5)％,GR过表达+CORT组细胞凋亡率显著高于其他各组(P＜0.01)；GR低表达+CORT组、对照siRNA+CORT组、单纯CORT处理2组和空白对照2组的细胞凋亡率分别为(12.2±0.6)％、(22.5±0.6)％、(22.3±0.9)％和(4.1±0.5)％,；GR低表达+CORT组细胞凋亡率显著低于对照siRNA+CORT组和单纯CORT处理2组(P＜0.01).MLTC中GR表达量与细胞凋亡率呈显著正相关(r=0.947,P＜0.05).结论 Leydig细胞中GR表达量的改变与应激水平CORT诱导的细胞凋亡率改变呈显著正相关,由应激导致的Leydig细胞凋亡可能是糖皮质激素直接作用的结果.
-
衰老雄性大鼠雄激素缺乏与睾丸间质细胞中Perilipin基因表达间关系的研究
目的 探讨Perilipin基因差异表达与雄激素缺乏之间的关系.方法 采用D-半乳糖注射的方法建立大鼠亚急性衰老雄激素缺乏动物模型,检测血清总睾酮(TT)、超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平判断造模成功,采用Percoll非连续密度梯度离心法分离睾丸间质细胞(Leydig),原代培养72h后提取大鼠Leydig细胞总RNA,基因芯片筛选差异表达基因,后半定量RT-PCR验证芯片结果.结果 与对照组比较,模型组(低剂量组和高剂量组)血清TT浓度、SOD活力下降,MDA含量升高,差异有统计学意义；基因芯片结果显示,脂类代谢途径与雄激素缺乏为相关,差异表达基因分别为Perilipin,Fabp4,Mgll;半定量RT-PCR结果发现,Perilipin基因及其两个亚型表达显著下调.结论 在RNA水平Perilipin基因表达与雄激素缺乏可能有关.
-
膜联蛋白5刺激大鼠Leydig细胞增殖过程中RhoA、Rock Ⅰ的表达
目的 研究RhoA、Rock Ⅰ促进大鼠Leydig细胞增殖的机制,探讨膜联蛋白5调控Leydig细胞增殖的新途径.方法 用1 nmol/L膜联蛋白5处理原代培养大鼠Leydig细胞12、24、48 h后,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,western blot检测RhoA和Rock Ⅰ的蛋白质表达情况.结果 MTT法结果显示,1 nmol/L膜联蛋白5呈显著的时间依赖的促进Leydig细胞增殖作用,且24h组细胞增殖能力与对照组差异为显著(0.251 ±0.019 vs 0.207±0.009,t=4.380,P＜0.01);流式细胞分析发现,1 nmol/L膜联蛋白5作用于Leydig细胞,以作用24 h时对细胞周期的影响为显著,可使G2+M期比例比对照组升高(12.24±0.84 vs 7.79±1.15,t =5.407),G0/G1期比例下降(67.61±0.37 vs 74.49±0.73,t=-14.64),P均＜0.01;western bolt结果表明,膜联蛋白5作用12、24、48 h后Leydig细胞RhoA表达结果分别为1.39±0.29、2.21±0.38、1.46±0.19,与0h组结果0.89±0.41比较,均有升高(t=2.028,P＜0.05;t=4.736,P＜0.01;t =2.550,P＜0.05);膜联蛋白5作用24、48 h后Leydig细胞Rock Ⅰ表达结果分别为1.14±0.18、1.03±0.17,与0h组结果0.72±0.22比较均升高(=2.944,P＜0.01;=2.246,P＜0.05).结论 RhoA、Rock Ⅰ可能参与膜联蛋白5促进细胞周期G0/G1进程,终促进Leydig细胞的增殖.
-
体外诱导人脂肪干细胞向Leydig细胞定向分化的研究
目的:探讨体外诱导脂肪干细胞(ADSCs)向Leydig细胞分化的可能性和条件. 方法:应用Ⅰ型胶原酶消化法分离人皮下脂肪组织中ADSCs,原代培养,适时传代.免疫组化方法检测波形蛋白的表达.以人绒毛膜促性腺激素(hCG)不同浓度及不同作用时间进行诱导后,实时荧光PCR检测类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)基因的表达.MTT法测定hCG诱导下的细胞增殖情况.在hCG、DMSO诱导1周后行3β-HSD免疫组化染色,并采用放射免疫法检测其培养上清及细胞裂解液的睾酮水平. 结果:ADSCs增殖迅速,ADSCs波形蛋白呈黄褐色阳性表达；ADSCs中StAR基因的表达在一定范围内与hCG诱导浓度的增加成正相关,hCG 10 U/ml达到高峰,该浓度诱导1周内StAR表达随时间延长而增加；hCG诱导增加ADSCs细胞增殖；hCG 10 U/ml、DMS0 3.2×10-6mol/L条件下诱导1周后细胞中3β-HSD免疫组化染色可见胞质呈浅褐色弱阳性,且该条件下细胞裂解液睾酮测定值明显高于其它组. 结论:①hCG在一定范围内促进ADSCs的StAR基因表达；②hCG可以促进ADSCs增殖；③在hCG 10 U/ml、DMS0 3.2×10 -6mol/L诱导下,人ADSCs有向Leydig细胞分化的可能.
