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离体灌注溶液快速置换法及其在细胞内记录中的应用
应用离体制备进行科学研究,是神经生理学、药理学等学科中常用的方法之一.药物的加入及溶液的置换是离体实验的一个重要环节.原有的置换方法一般存在置换时间偏长(几分钟或更长),直接向灌注槽内压力注药易造成浓度不均及液面波动,从而影响实验结果等不足.这些不足,在细胞内记录中显得尤为突出.国外在膜片钳技术中采用了药物快速供给方法并取得满意实验结果[1] .但国内尚未见到有关报道.
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一氧化氮对大鼠背根神经节神经元膜电位的作用
目的:观察一氧化氮对大鼠背根神经节神经元的作用及有关离子机制,并探讨一氧化氮在痛觉信息传递过程中的作用.方法:在分离的大鼠背根神经节标本上,应用细胞内记录技术,给予灌流一氧化氮供体硝普钠,观察硝普钠诱导的神经元膜反应.结果:大部分神经元对硝普钠敏感(79/102,77.45%),滴加硝普钠(10～100 mmol/L)后可引起浓度依赖性的超极化反应,剩余神经元没有反应.硝普钠(100 mmol/L)可使神经元膜电导由(21.06±1.94)nS增加到(23.08±0.92)nS.L-NAME(非选择性一氧化氮合酶抑制剂,1 mmol/L)、CdCl2(非选择性钙通道阻断剂,0.1 mmol/L)、无Na+平衡盐液对硝普钠引起超极化反应无明显影响.四乙基碘化铵(非选择性钾通道阻断剂,10 mmol/L)明显抑制硝普钠引起的超极化反应.结论:硝普钠在大鼠背根神经节神经元上可引起浓度依赖的超极化反应,且此超极化反应是钾电导介导的.
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甘丙肽对幼鼠三叉神经主核突触传递的抑制
甘丙肽是Tatemoto于83年从猪小肠提取物中发现的一种29肽,其N和C端分别为甘氨酸和丙氨酸残基.研究表明,甘丙肽广泛分布于中枢和外周组织,具有调节胃肠平滑肌收缩、抑制胰岛素分泌、加强吗啡镇痛效应和参与记忆等功能,尤其在损伤组织的修复过程中发挥了重要作用,因而受到越来越广泛的重视,在国际神经学界出现了研究热潮.损伤初级感觉神经元末梢后,残存的感觉神经元内甘丙肽浓度显著增加.为了了解该浓度增加的生理作用及其意义,我们运用细胞内记录和全细胞膜片钳的方法,以三叉神经主核(PrV)神经元为受试对象进行了探索.
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缩宫素对大鼠背根神经节神经元胞体膜的作用
应用细胞内记录技术,观察了缩宫素(OXT,10 -8～10-5 mol/L)对2～3周龄大鼠背根神经节神经元的作用.在受检的92个细胞中,有71个神经元滴加缩宫素产生明显的超极化反应.在滴加10-5mol/L缩宫素后, 膜电导由平均的3.68×10-7S增加约21.43%.灌流平衡液中的NaCl以氯化胆碱置代或用C d2+阻断Ca2+通道后,OXT引起超极化反应的幅值无明显变化.当灌流平衡液中含10-2 mol/L四乙基碘化铵后,OXT引起的超极化反应幅值明显减小.
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青蛙前视盖与视顶盖间神经传导的细胞内记录和电流源密度分析
目的 电生理研究已经证实青蛙前视盖对同侧视顶盖细胞有强烈的抑制作用,但其与对侧视顶盖间神经活动的特性目前尚不清楚.本研究旨在探讨青蛙前视盖与视顶盖之间复杂的神经活动机理,并对这种神经活动的时空方式进行分析.方法 用细胞内记录方法,通过电刺激前视盖的神经细胞核来记录对侧视顶盖细胞的神经活动.通过电流源密度分析方法解析细胞外记录的视项盖细胞的神经活动.结果 前视盖的电刺激只引起了对侧视顶盖的一种应答,即抑制性突触后电位(inhibitory postsynaptic potential,IPSP),且大多数的IPSPs是通过多突触方式进行神经信息传递的.此外,电流源密度分析结果显示,前视盖刺激在同侧视顶盖上唤起了非常微弱的兴奋性神经活动,这与以前的细胞内研究结果相一致.结论 前视盖的神经细胞能强烈抑制双侧视顶盖细胞的神经活动.细胞内记录和电流源密度分析结果有助于进一步揭示前视盖传入在视顶盖层的传导情况.
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猫胸脊髓交感节前神经元对电刺激头端延髓腹外侧区的反应
目的:观察电刺激猫的头端延髓腹外侧区(RVLM)在胸脊髓交感节前神经元(SPNs)上引起的反应.方法:用充灌3 mol/L KCl的玻璃微电极在11只麻醉后行人工通气猫的第3胸髓做细胞内记录,电刺激白交通支,逆行鉴定SPNs.结果:共记录了24个SPNs,其静息膜电位为-45～-90 mV,逆行动作电位的阈值和潜伏期分别是(2.86±0.37) V和(6.48±0.89) ms.用单个方波(0.2 ms,50～300 μA)刺激RVLM,在所有SPNs上都引起一组潜伏期为4～47 ms的早发快速兴奋性突触后电位(eEPSPs);在11个SPNs上还记录到一组潜伏期为70～140 ms的迟发EPSPs(lEPSPs).多数eEPSPs和一些lEPSPs都具有恒定的潜伏期.结论:RVLM的一些交感兴奋性神经元单突触地投射到胸脊髓SPNs上,RVLM的胸脊髓投射按传导速度可分为两类,即快传导和慢传导纤维,其传导速度分别是5～25和0.78～1.60 m/s.
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血管升压素对大鼠背根神经节神经元膜的作用
为研究血管升压素(arginine vasopressin,AVP)对大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元的作用及其机制,用细胞内微电极记录技术记录离体灌流DRG神经元的膜电位.结果如下:(1)在受检的120个细胞中,大多数(81.67%)在滴加AVP后产生明显的超极化反应.(2)滴加AVP(10μmol/L)后膜电导增加约19.34%(P＜0.05).(3)灌流平衡液中的NaCl以氯化胆碱(CH-C1)置代和用Cd2+阻断Ca2+通道后,AVP引起超极化反应的幅值均无明显变化(P＞0.05),而加入K+通道阻断剂四乙铵(TEA)后,AVP引起的超极化反应幅值明显减小(P＜0.05).(4)AVP引起的超极化反应可被AVP V1受体拮抗剂阻断.结果提示,AVP可使DRG大多数神经元膜产生超极化,DRG神经元膜上存在AVP V1受体,且AVP引起的超极化反应是通过神经元膜上AVP V1受体介导的K+外流所致,AVP 可能参与了初级感觉信息传入的调制.
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胞内记录猫体感皮层内脏伤害性感受神经元的电生理特性
为了从细胞水平探讨皮层内脏伤害感受的特性及机制,本文应用细胞内电位记录技术,观察了猫体感皮层内脏大神经皮层代表区的851个神经元对电刺激内脏大神经的诱发反应及电生理特性.其中412个单位为内脏伤害性感受神经元,其自发放电有多种形式,根据诱发反应现象分为特异性和非特异性伤害感受神经元,内脏伤害性诱发反应分为兴奋性反应(51.7%)、抑制性反应(31.31%)及混合性反应(17%)三类.在形式上具有潜伏期长、反应形式复杂等特点.实验发现85个神经元为内脏及肋间神经的会聚反应细胞.部分神经元用神经生物素进行细胞内电泳标记以显示功能细胞所在层次及形态.结果说明皮层体感神经元具有内脏伤害性感受的作用,并从细胞及突触后电反应特点上探讨了内脏痛的感受机制.
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猫皮层体感Ⅱ区内脏伤害感受神经元的电生理特性及形态特征
应用胞内记录和标记技术, 观察了猫皮质第Ⅱ感觉区(the second somatosensory cortex, SⅡ)内脏大神经代表区的神经元对电刺激内脏大神经的诱发反应及形态特征. 结果表明, 在251个记录单位中, 有109个为内脏伤害性感受神经元, 其诱发反应分为兴奋性(占总数的38.53%)、抑制性(42.20%)及混合性(19.31%)三类. 在形式上IPSP及EPSP-IPSP序列反应较多. 对其中21个神经元用神经生物素进行细胞内电泳标记, 显示细胞的形态特点是胞体较小, 分布于皮质Ⅱ、Ⅲ及Ⅴ层, 其中兴奋性神经元形态多为复杂的锥体神经元, 抑制性神经元多为星型细胞. 实验证明, 体感SⅡ区存在内脏伤害性感受神经元.
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电生理学特性得到确定的大鼠脊髓背根神经节细胞内谷氨酸和P物质的共存
在离体灌流带脊髓和坐骨神经的标本上,对脊髓背根神经节(DRG)细胞的电生理学特性、对P物质(SP)受体激动剂的反应及谷氨酸(Glu)/SP共存的特点进行了研究.(1)对135个细胞进行了细胞内记录,并依纤维传导速度将其分为Aα/β(＞12 m/s)和C(＜1.3 m/s)两大类,它们的动作电位的快速后超极化(fAHP)有明显区别,C类的fAHP幅度小、时程长,Aα/β类的fAHP幅度大、时程短;(2)SP受体激动剂Sar-SP(10-6mol/L)诱导42%(5/12)的Aα/β细胞和80%(8/10)的C细胞发生去极化反应;(3)后向给予SP受体激动剂的22个细胞内电泳biocytin,固定、切片后进行磷酸激活的谷氨酰胺酶(PAG)和SP免疫荧光组织化学染色并同时显示biocytin,观察到biocytin标记并呈PAG样和SP样阳性的三标细胞在Aα/β类为25%(3/12),C类为80%(8/10),两者差异显著(P＜0.05).结果提示DRG中Aα/β细胞与C细胞的化学解剖和电生理特性不同,SP可能通过作用于节细胞上的自身受体易化冲动的发放.
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杜鹃花总黄酮对豚鼠心室肌细胞生物电的影响
目的 观察杜鹃花总黄酮(total flavones of rhododendron,TFR)对离体豚鼠右心室乳头肌细胞生物电的影响,以探讨其抗心肌缺血的作用机制.方法 采用标准玻璃微电极技术记录心肌细胞的静息电位以及动作电位.结果 25、50mg·L-1的TFR可明显缩短动作电位复极50%、90%时程(APD50、APD90),但100、200、400mg·L-1却可明显延长APD50和APD90,200、400mg·L-1的TFR可明显降低0期的动作电位峰值(APA)及动作电位去极化大速率(Vmax),400mg·L-1的TFR使静息电位减小,200mg·L-1TFR能延长心室肌细胞有效不应期(ERP).结论 低浓度的TFR可能有钙阻滞作用,高浓度的TFR可能对钾通道有一定的阻断作用,200mg·L-1TFR能延长心室肌细胞有效不应期.
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成年大鼠伏隔核脑片神经元的细胞电生理特性
目的:观察成年大鼠伏隔核(nucleus accumbens,NAc)脑片神经元的细胞电生理特性,为研究药物成瘾和神经精神性疾病提供一种离体伏隔核细胞模型.方法:对取自成年大鼠的伏隔核脑片神经元进行细胞内记录,并检测膜电学特性和局部电刺激诱发的突触反应.结果:测定记录稳定的10个NAc神经元的静息电位、膜斜率电阻和动作电位幅度分别为(-70.9±12.9)mV、(59.3±19.8) MΩ和(86.5±14.1)mV.在其中4个神经元观察到放电频率随刺激强度增大而升高,在6个NAc细胞观察到异常整流现象.对NAc神经元的背侧局部电刺激(0.1 Hz)可诱发刺激强度依赖性去极化突触反应(EPSP,n=5).对5个NAc细胞灌流10 mmol/L的L-谷氨酸,产生去极化反应,而且灌流0.5 μmol/L的河豚毒素可逆性取消动作电位和EPSP.结论:结果表明成年大鼠伏隔核脑片神经元细胞内记录技术稳定可靠,可用于相关脑功能和神经精神性疾病的细胞电生理和药理学分析.
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对侧腹外侧索电刺激在新生大鼠脊髓切片运动神经元诱发的突触反应
目的:探讨对侧腹外侧索(cVLF)下行激活对离体脊髓运动神经元(MN)活动的突触调制作用.方法:应用新生大鼠(8～14d)脊髓切片MN细胞内记录技术,观察cVLF或同侧VLF(iVLF)电刺激在MN所诱发的突触反应.结果:在32个测试的MNs,观察到cVLF电刺激可在21个MNs上诱发去极化反应(即cVLF性兴奋性突触后电位,cVLF-EPSP),在1个MN上诱发超极化反应(即cvLF性抑制性突触后电位,cVLF-IPSP).在4个MNs上诱发cVLF-EPSP后复合有cVLF-IPSP的反应.cVLF-EPSP具有刺激强度依赖性、被低钙高镁溶液取消的特性,与iVLF性EPSP相比.有潜伏期较长的特点(P＜0.001).cVLF-IPSP呈膜电位依赖性.并被印防己毒素(30 μmol/L)及士的宁(1.0μmol/L)取消.结论:cVLF的下行激活可通过兴奋性和抑制性突触传递调制MN的活动,其cVLF-IPSP可能由γ-氨基丁酸A受体和(或)甘氨酸受体介导.
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离体下丘脑视上核神经元的突触反应
目的:了解下丘脑视上核(SON)神经元活动的突触调制机制.方法:应用成年大鼠下丘脑冠状切片SON细胞内记录技术,观察电刺激SON背外侧区域诱发的突触反应.结果: 下丘脑视上核神经元兴奋性突触后电位(EPSP)和抑制性突触后电位(IPSP)具有等级性的特点,并呈现明显膜电位依赖关系,即膜超极化时EPSP幅度增大,去极化时减小,而IPSP则相反.细胞旁压力喷射外源性谷氨酸能诱发伴有膜电阻减小的去极化反应.结论:下丘脑冠状脑片中突触联系通路有较好的保存,SON神经内分泌细胞的活动受到兴奋性和抑制性突触传入的调控.
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大鼠初级听皮层神经元迟发型听觉反应的电生理特征
目的 探讨声刺激诱发大鼠初级听皮层反应的电生理特征及机制.方法 运用场电位记录、细胞贴附式膜片钳记录和细胞内记录技术,在麻醉大鼠初级听皮层分别从整体水平和单细胞水平分析声诱发的迟发型反应特征,并从膜电位特征分析其产生的可能机制.结果 在给予白噪声刺激的条件下,我们在大鼠初级听皮层记录到起始相onset反应之后的长潜伏期场电位活动,其反应的潜伏期(152±18)ms显著长于起始相反应(9.2±0.4)ms,属于迟发型听觉反应.单细胞胞外记录显示迟发型听觉反应的动作电位发放潜伏期(144±ll)ms与场电位水平的迟发型活动相似.在体细胞内记录共记录到29个神经元,其中10个神经元在声刺激后表现出长潜伏期(137±ll)ms和长时程的迟发型活动.结论 大鼠初级听皮层神经元迟发型反应的潜伏期远长于起始相onset反应,且反应特征(潜伏期、时程)与on-off双相反应神经元的offset反应明显不同,其产生机制可能与突触前输入以及神经元本身的兴奋性改变有关.
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单侧液压脑损伤对大鼠双侧海马GFAP表达和CA1区突触传递的影响
目的 研究单侧液压脑损伤(FPI)对大鼠双侧海马区胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达和CA1区突触传递的影响.方法 建立大鼠单侧液压脑损伤模型,脑标本分为对照组(包括正常对照和假手术对照)、FPI损伤同侧组和FPI损伤对侧组.免疫组化法检测海马水平切片GFAP表达,对海马CA1区锥体神经元进行细胞内记录.结果 FPI大鼠双侧海马齿状回门区和CA1区GFAP表达均比对照组明显增强.FPI损伤同侧组兴奋性输入-输出关系曲线的斜率比其他两组显著增大(P＜0.05);FPI损伤同侧组和对侧组双脉冲易化(PPF)比值和抑制性突触后电位(IPSP)幅值均比对照组显著减小(P＜0.05);FPI损伤同侧组和对侧组双脉冲抑制(PPD)比值均比对照组显著增大(P＜0.05).结论 大鼠单侧液压脑损伤对双侧海马均可产生影响,导致双侧海马CA1区兴奋性突触传递增强,抑制性突触传递减弱.
