基于协同氟康唑抗耐药真菌活性的小檗碱结构衍生化研究

前期研究发现小檗碱能显著提高氟康唑对耐药白念珠菌的敏感性,提示其具有协同氟康唑抗耐药真菌作用.通过结构修饰和改造等衍生化研究,可为研究其作用靶点和构效关系、提高成药性、获得新结构活性化合物提供依据.以13位引入苄基对小檗碱进行结构修饰;以胡椒乙胺为起始原料合成异喹啉类化合物,模拟打开小檗碱D环、保持其A、B、C、E环的方式,对小檗碱进行结构改造;对获得的化合物进行体外与氟康唑合用抗耐药白念珠菌活性测试.结果显示13-苄基取代小檗碱类衍生物1a～1e保持了协同氟康唑抗耐药白念珠菌的活性,提示可通过13位苄基取代的方式引入各种功能基团而不降低其活性.小檗碱结构改造类似物N-苄基异喹啉类衍生物活性总体不高,但化合物2b、2e、4b表现了一定的活性,说明其基本骨架D环可以打开,值得进一步优化研究.

念珠菌耐药相关基因研究

目的研究耐氟康唑热带念珠菌临床株Fc 30的基因突变耐药机制.方法对氟康唑靶酶基因erg11进行PCR扩增,DNA测序,对比分析临床耐药株与敏感株及标准株的靶酶基因DNA序列,确定耐药株基因一级结构上的突变点,并推测分析靶酶蛋白的氨基酸改变及与氟康唑耐药的相关性.结果氟康唑敏感株Fc 17的erg 11基因DNA序列与氟康唑敏感标准菌ATCC750完全一致,耐药株Fc 30出现+225、+264、+395、+461、+513处点突变,导致132、154位氨基酸突变.结论与敏感株相比,耐氟康唑热带念珠菌Fc30 erg11基因出现Y132F耐药相关突变.

伏立康唑静脉滴注致心律失常加重1例

伏立康唑具有广谱抗真菌作用用于治疗侵袭性曲霉、足放线病菌属、镰刀菌属、对氟康唑耐药的克柔念珠菌、光滑念珠菌、白色念珠菌耐药株等引起的感染.该药的不良反应主要包括:胃肠道反应、肝酶升高、幻觉、视觉异常、头痛及皮疹等.这些反应多属于轻度,严重反应停药较少见.因此多数认为使用伏立康唑较安全.我科在临床工作中发现伏立康唑致心律失常加重1例现报道如下.

新型隐球菌致脑脊液白细胞数假性升高一例

患者男，73岁，7年前确诊人类免疫缺陷病毒（HIV）阳性，并在当地县医院门诊规律性抗病毒治疗，于9d前开始无明显诱因出现畏寒、发热、头痛、头晕，在当地县医院住院治疗2 d，病情无好转，遂转诊我院，以“发热原因待查？”收住感染科。查体：体温38.2℃，发热无规律；实验室检查：白细胞5.94×109/L，中性粒细胞90.4%，淋巴细胞4.42%；红细胞沉降率（ESR）78 mm/1 h；血清超敏C反应蛋白（hs-CRP）15.26 g/L；脑脊液检查：蛋白2.97 g/L，糖0.01 mmol/L，氯化物113 mmol/L，IgG 761.09 mg/L，IgA 1.60 mg/L，IgM 0.50 mg/L；脑脊液常规：无色，微浊，罗-琼试验阳性，白细胞：人工计数0.014×109/L，中性粒细胞0.10，淋巴细胞0.90，脑脊液细菌培养有真菌生长，经鉴定为新型隐球菌，药物敏感试验结果：5-氟胞嘧啶、伏立康唑和两性霉素B敏感，氟康唑耐药，确诊为新型隐球菌性脑膜脑炎。在药敏结果未报告前，临床经验性治疗给予氟康唑抗真菌感染治疗，2 d后不祥原因患者自动出院。

体外氟康唑诱导光滑念珠菌和近平滑念珠菌耐药及相关机制研究

目的:研究光滑念珠菌和近平滑念珠菌对氟康唑耐药的易感性及其诱导耐药株的耐药机制.方法:选取对氟康唑敏感的光滑念珠菌、近平滑念珠菌临床株各1株以及对氟康唑敏感的光滑念珠菌标准株ATCC2001、近平滑念珠菌标准株ATCC22019,利用浓度递增法,在体外用氟康唑诱导使其成为耐药株,采用实时定量PCR检测外排泵相关基因、其转录因子和靶酶编码基因表达,并对光滑念珠菌PDR1转录因子、近平滑念珠菌MRR1转录因子和ERG11基因进行PCR扩增和测序.结果:光滑念珠菌较近平滑念珠菌更易被氟康唑诱导为耐药株,CDR1的过度表达为其主要的耐药机制,对PDR1转录因子测序后发现了新的突变位点Y932C、V847F.近平滑念珠菌诱导耐药株的MDR1表达显著增加,其MRR1转录因子中亦存在新的突变位点P295S、I799S.结论:光滑念珠菌和近平滑念珠菌对氟康唑的耐药易感性不同,耐药机制也存在差异.新发现的转录因子突变位点有待验证其功能.

白念珠菌CDR1基因上游调控序列与氟康唑耐药的关系初探

目的探讨白念珠菌耐药基因CDR1基因上游调控序列对氟康唑耐药的影响.方法分别抽提氟康唑耐药/敏感配对菌株DNA,通过特异性合成CDR1基因上游调控序列引物,分析该序列在氟康唑耐药/敏感配对菌株中是否存在基因突变.结果白念珠菌氟康唑耐药/敏感配对菌株中的CDR1基因上游调控序列未出现任何碱基突变和缺失.结论白念珠菌氟康唑耐药与CDR1基因上游调控序列是否突变无关.

123诱导白念珠菌对氟康唑耐药所伴随的毒力因子的改变

白念珠菌临床株FLU1基因表达与氟康唑耐药的关系

近年来,深部真菌感染发生率逐渐增高,其中以白念珠菌(Candida albicans)的感染为常见.由于氟康唑的生物利用度高(＞90%),不良反应小,常被作为首选药物,广泛用于念珠菌感染的预防和治疗.随着氟康唑的长期、大量使用,念珠菌耐药性的问题日益突出.白念珠菌主要耐药机制包括,细胞对药物外排能力的不断增强、药物作用靶点编码基因突变或高度表达等.本研究针对编码药物外排泵蛋白的FLU1基因,采用实时定量PCR技术检测白念珠菌氟康唑耐药株和敏感株的FLU1基因的表达差异,初步探讨FLU1基因表达与氟康唑耐药的关系.

热带念珠菌对氟康唑耐药机制的初步研究

25株临床分离的热带念珠菌通过ATB FUNGUS3试条分类为对氟康唑(FCA)敏感的菌株和耐药的菌株,使用ABI 7300荧光定量分析仪扩增外排基因CDR1、MDR1和靶酶基因ERG11,用2-△△CT法计算相对表达量,应用Fisher确切概率法统计分析敏感菌株和耐药菌株的高表达率.结果显示MDR1和ERG11基因的高表达率差异有统计学意义(P＜0.05),CDR1基因的高表达率差异无统计学意义(P＞0.05).热带念珠菌对FCA耐药与外排基因MDR1和靶酶基因ERG11的高表达相关.

热带假丝酵母菌ERG11基因突变与氟康唑耐药性的关系

目的 探讨热带假丝酵母菌氟康唑作用的靶酶编码基因(ERG11)突变与耐药性的关系.方法 根据ERG11序列设计引物.对氟康唑靶酶基因ERG11进行PCR扩增,DNA测序后对比分析耐药株与敏感株及标准株的碱基差异.确定耐药株基因一级结构上的突变点,并推测分析靶酶蛋白的氨基酸改变及与氟康唑耐药的关系.结果 氟康唑敏感株的ERG11基因DNA序列与氟康唑敏感标准株ATCC750完全一致.耐药株出现+395、+513、+783处点突变,导致132位氨氨酸改变.结论 ERG11基因突变所编码的氨基酸改变与氟康畔耐药有关.

没食子酸联合氟康唑抗耐药非白念珠菌作用的体外试验

目的:研究没食子酸与氟康唑联用对耐药光滑念珠菌和克柔念珠菌的体外抗真菌活性.方法:采用棋盘微量稀释法测定没食子酸与氟康唑单用及联用对耐药光滑念珠菌和克柔念珠菌的抗真菌作用,以部分抑菌浓度指数(FICI)评价其联用效果;并以CG2、CK8为目标菌株,采用时间-杀菌曲线进行验证;通过测定没食子酸对耐药株生物膜形成早期黏附性的影响,初步探讨药物联合抗真菌耐药的作用.结果:联用时8～16μg·mL-1没食子酸能将氟康唑的MIC值降为单用时的1/4～1/8,FICI值为0.375,呈现较好的协同作用,且量效关系呈正相关.时间-杀菌曲线表明,与氟康唑单用相比,没食子酸与氟康唑联用24 h时,CG2、CK8菌株CFU的lg值分别下降了2.1个单位和2.25个单位,均表现为协同作用.另外,研究发现没食子酸对生物膜形成的早期黏附有明显的抑制作用.结论:没食子酸与氟康唑联用对耐药光滑念珠菌和克柔念珠菌的浮游菌表现出体外协同抗真菌作用,且没食子酸能够明显抑制非白色念珠菌生物膜形成的早期黏附.

应用M13引物PCR指纹法分析假丝酵母菌氟康唑耐药性

目的探讨M13微卫星引物PCR指纹法用于假丝酵母菌氟康唑耐药性基因分型的可行性.方法采用纸片扩散法分析假丝酵母菌氟康唑耐药性,并进一步对41株假丝酵母菌进行M13引物PCR指纹分析,采用RAPD200软件邻接法(neighbour joining,NJ)聚类分析电泳带型模式.结果41例主要从痰液和阴道分泌物中分离的假丝酵母菌标本中中,氟康唑药物敏感11株(26.8%),依赖8例(19.5%),耐药22例(53.7%),PCR指纹分析至少可检测到12种不同的条带,条带数目从2条到12条不等,电泳带型模式与感染部位和氟康唑药物反应性有关.结论假丝酵母菌氟康唑耐药性菌珠所占比例较大,M13微卫星引物PCR指纹法可用于假丝酵母菌的分子流行病学调查和氟康唑耐药性基因分型.

热带念珠菌靶位酶基因变异与氟康唑耐药的关系

目的 探讨热带念珠菌靶位酶(ERG11)基因的改变与氟康唑耐药的相关性.方法 根据热带念珠菌ERG11基因序列设计引物,以标准株为对照,对临床分离的耐药株、剂量依赖株(S-DD)和敏感株进行靶位酶ERG11基因PCR扩增,测序之后比对分析标准株,耐药株、剂量依赖株和敏感株的序列差异,分析靶位酶基因改变与氟康唑耐药的相关性.结果 热带假丝酵母氟康唑敏感株与敏感标准株序列一致;而S-DD株中出现T783C和G1362A沉默突变;耐药株中出现碱基序列T225C、C461T、G1362A等3种突变点,并导致丝氨酸(S)154苯丙氨酸(F)氨基酸突变.结论 热带念珠菌靶位酶ERG11基因氨基酸序列的突变与氟康唑耐药有一定的相关性.

热带念珠菌外排泵耐药的研究

目的研究耐氟康唑热带念珠菌临床株Fc30的外排泵耐药机制.方法运用半定量RT-PCR技术研究外排泵基因mdr1 mRNA水平与耐药的相关性.结果耐药株Fc30的mdr1基因mRNA灰度比值约为敏感株Fc17的2.3倍.结论与敏感株相比,耐氟康唑热带念珠菌Fc30外排泵基因mdr1过度表达与耐药相关.