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小RNA干扰DDR2基因表达对肝星状细胞的影响
目的 探讨siRNA干扰大鼠盘状结构域受体2(discoidin domain receptor2,DDB2)基因对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的影响,评估DDR2在肝纤维化发生中的作用.方法 (1)化学合成3对针对DDR2基因的siRNAs,转染肝星状细胞株(HSC-T6),筛选抑制效率高的siRNA用于干扰实验;(2)将肝星状细胞株HSC-T6分为3组:正常组(normal,N组)、阴性对照组(negative control,NC组)和干扰组(siRNA-DDR2,SI组).将筛选的抑制效率高的siRNA以脂质体法转染HSC-T6细胞株,以RT-PCR检测其DDR2,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和I型胶原(collagen-Ⅰ)的mRNA表达,Western blot检测DDR2蛋白表达变化;同时四唑盐(MTT)法检测细胞增殖情况.结果 (1)868位点的siRNA抑制效率高;(2)与正常组相比,siRNA-DDR2转染组DDR2和α-SMA的mRNA表达均显著下降(分别t=6.43,t=7.34,均P<0.01),DDR2蛋白的表达亦显著降低(t=4.49,P<0.01),同时HSC的增殖能力也显著降低(t=18.32,P<0.01);相反,阴性对照组与正常组相比,DDR2、α-SMA的mRNA表达以及DDR2蛋白和HSC的增殖能力则无明显改变.结论 siRNA-DDR2能显著抑制HSC的活化与增殖,进而抑制纤维化发生,具有潜在的抗纤维化作用.
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盘状结构域受体2在肿瘤中的研究进展
盘状结构域受体2(DDR2)是盘状结构域受体家族成员之一,是一种与肿瘤发展进程密切相关的受体酪氨酸激酶.研究表明DDR2在多数肿瘤细胞和组织中高表达,能够促进肿瘤的增殖、侵袭和转移,其高表达往往作为不良预后的标志.此外,DDR2点突变后能够增强肿瘤细胞对小分子酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的敏感性,提示DDR2可以作为一个新的药物作用靶点,值得进一步探究.
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鼠盘状结构域受体真核表达载体的构建与表达
目的分别构建DDR2的野生型(FLDDR2)、嵌和体(FcDDR2)和截短体(ttDDR2)的真核表达载体,并在哺乳动物细胞表达,为进一步研究DDR2与类风湿性关节炎发病机制的关系奠定基础.方法 FLDDR2和ttDDR2通过RT-PCR的方法获得,测序正确后亚克隆入pCDNA3.1(+).FcDDR2是利用人IgG1的Fc段替代部分胞浆区,测序正确后亚克隆入pMKIT-Neo.重组产物经脂质体2000介导瞬时转入COS-7细胞,48h后收取蛋白,分别利用蛋白印迹法和免疫沉淀法检测重组产物的表达.转入重组质粒的细胞经胶原刺激3h后收取蛋白,利用免疫印迹和免疫沉淀法检测磷酸化水平的变化.结果所构建的三种真核表达载体均可在COS-7细胞中正确表达.将ttDDR2和FLDDR2共转染COS-7细胞并给予胶原刺激后FLDDR2的磷酸化水平有所下降,而FcDDR2在无胶原刺激时也可自身活化,其程度与FLDDR2经胶原刺激后的活化程度相仿.结论成功构建了FLDDR2、ttDDR2和FcDDR2三种真核表达载体,其中FcDDR2可以作为一种激活剂,而ttDDR2在一定程度上具有负性竞争的作用.
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同种异体脂肪干细胞移植治疗大鼠骨关节炎的实验观察
目的 探讨同种异体脂肪干细胞(ADMSCs)移植对前交叉韧带离断法诱导的大鼠骨关节炎的治疗价值及可能机制.方法 ADMSCs取自雄性SD大鼠腹膜脂肪组织,经过分离、培养并鉴定.40只SD大鼠均行膝关节前交叉韧带离断法建立骨关节炎模型,成模后一侧膝关节注射ADMSCs为治疗组,对侧膝关节注射磷酸盐缓冲液(PBS)为对照组.分别于注射后2、8周(即建模后4、10周)各取20只动物膝关节标本,观察其改变.通过QRT-PCR和Western印迹的方法初步验证ADMSCs改善大鼠骨关节炎模型的作用靶点.结果 以前交叉韧带、内侧副韧带离断并切除内侧半月板的方法成功建立SD大鼠膝骨关节炎模型.膝关节腔内移植ADMSCs后大鼠全部存活,未发生明显并发症.治疗组大鼠在建模后两周关节腔内注射ADMSCs,对照组则注射PBS,注射后2、8周,治疗组大鼠骨关节炎较对照组明显好转,滑膜增生减轻、骨赘形成和软骨破坏均减少,骨赘评分及滑膜炎评分亦显著改善.QRT-PCR和Western印迹显示治疗组Ⅱ型胶原蛋白表达明显上调.ADMSCs与原代软骨细胞共培养,能抑制基质金属蛋白酶13 (MMP-13);在体外培养条件下,正常原代软骨细胞被肿瘤坏死因子α激活后,盘状结构域受体2 (DDR-2)表达上升明显,但与ADMSCs共培养后,DDR-2表达明显下调,提示ADMSCs有抑制DDR-2表达的作用;ADMSCs抑制MMP-13其上游靶点可能是DDR-2.更生霉素D(DDR-2抑制剂)可解除IL-1β抑制的ADMSCs的软骨分化.结论 同种异体ADMSCs移植有助于改善大鼠骨关节炎;ADMSCs可能通过抑制MMP-13起作用,其上游靶点可能是DDR-2.
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盘状结构域受体2与软骨破坏程度的相关研究
目的 观察盘状结构域受体(DDR)2和基质金属蛋白酶(MMP)-13在膝骨关节炎(OA)大鼠不同时期软骨及滑膜中的表达,探讨DDR2与关节软骨破坏之间的关系.方法 采用改良膝关节腔内注射木瓜蛋白酶法制作OA大鼠模型,从蛋白水平检测造模后不同病理阶段关节软骨及滑膜中DDR2和MMP-13的表达规律和分布特点.结果 DDR2在各模型组关节软骨及滑膜中的表达较健康组增高(P＜0.01),并且各组中软骨表达高于相应滑膜,MMP-13表达呈现与DDR2相同的特点,二者相关系数r=0.93(P＜0.01).结论 初步证明"DDR2-MMP-13-软骨破坏"途径在OA病理过程中起重要作用.软骨和滑膜DDR2的表达升高共同促进软骨退变.
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miR-199 a-3 p通过DDR调控Wnt/β-catenin通路抑制卵巢癌细胞侵袭转移
目的:探讨miR-199 a-3 p调控卵巢癌细胞侵袭转移及机制.方法:QPCR技术检测22例卵巢癌组织及20例卵巢正常组织中DDR2 mRNA表达水平.采用miR-199 a-3 p mimics转染人卵巢癌SKOV3细胞,QPCR技术检测DDR2 mRNA表达,Western blot法检测DDR2、Wnt/β-catenin相关通路信号分子表达.结果:DDR2在卵巢癌组织中表达明显升高.较SKOV3细胞组,miR-199a-3p mimics组中DDR2 mRNA表达水平降低,DDR2、β-catenin、c-myc、c-JUN表达水平明显下调.结论:miR-199 a-3 p可能通过下调DDR和Wnt/β-catenin通路抑制卵巢癌细胞体外侵袭转移.
关键词： miR-199a-3p 盘状结构域受体2 卵巢癌 -
盘状结构域受体2及其在肿瘤中的表达和作用
盘状结构域受体2(DDR2)是一种受体酪氨酸激酶(RTK),可以被多种胶原(Ⅰ～Ⅲ、X型)激活.近年来研究发现DDR2在人类多种肿瘤中呈差异性表达,提示其可能参与肿瘤的发生和发展过程,DDR2将来可能作为肿瘤基因治疗的一个潜在靶点.
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PD98059抑制Peroxynitrite诱导人脑血管平滑肌细胞DDR2的表达
目的 探讨过氧亚硝酸盐(ONOO-)诱导人脑血管平滑肌细胞(HBVSMCs)盘状结构域受体2(DDR2)表达的机制.方法 体外培养HBVSMCs,用倒置相差显微镜、吖啶橙染色法和MTT比色法对PD98059预处理的细胞进行细胞形态学及细胞生存率检测,采用Western blot及Real-time PCR技术,检测ONOO-作用下HBVSMCs中DDR2表达及施加ERK1/2抑制剂PD98059后DDR2/MMP-9表达的变化.结果 10 μmol/L ONOO-诱导DDR2在蛋白及mRNA水平上呈现高表达(P＜0.05),随着ONOO-浓度的增加,DDR2逐渐呈现低表达(P＜0.05).PD98059预处理后的HBVSMCs,无明显形态学变化,对其进行生存率检测亦无显著影响(P＞0.05).PD98059显著抑制ONOO-诱导的DDR2/MMP-9表达(P＜0.05).结论 ERK1/2信号转导途径抑制剂PD98059可以抑制ONOO-诱导的DDR2/MMP-9表达,ONOO-诱导HBVSMCsDDR2的表达机制与ERK1/2信号转导途径有关.
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酒精性肝纤维化与DDR2关系及复方甘草酸苷治疗对其影响的实验研究
目的 观察酒精性肝纤维化与盘状结构域受体2(DDR2)的关系以及复方甘草酸苷(GGT)治疗对二者的影响.方法48只大鼠随机分为正常对照组、模型组、停酒组、未停酒组、停酒治疗组及未停酒治疗组(n=8).模型组酒精灌胃16周后,与正常对照组一起处死.其余4组于酒精灌胃16周后分别予以停酒、不停酒、停酒+GGT治疗、不停酒+GGT治疗4周,至20周末全部处死.检测各组血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)及Ⅳ型胶原(CⅣ)含量,取肝组织进行HE染色及Masson染色观察其组织病理学变化,实时荧光定量PCR和Western blot蛋白印迹法分别检测肝组织DDR2 mRNA和蛋白表达.结果酒精灌胃16周后,大鼠肝组织呈明显肝纤维化病理表现,血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平和肝组织胶原面密度及DDR2表达均较正常对照组升高(P<0.01).停酒治疗组与停酒未治疗组、未停酒治疗组与未停酒未治疗组比较,上述各指标均降低(P<0.05).结论CGT对酒精性肝纤维化具有一定的治疗作用,其作用可能与下调DDR2的表达相关.
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MEK/ERK和PI3K/Akt通路对大鼠脉络膜新生血管中DDR2和MMP-13表达的调控作用
背景 研究表明盘状结构域受体2(DDR2)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)在肿瘤新生血管发生中具有重要作用,是相关疾病治疗的关键靶点,但DDR2和MMP-13在脉络膜新生血管(CNV)发生中的作用尚不清楚.目的 探讨DDR2和MMP-13在大鼠CNV中的表达特点以及MEK/ERK和PI3 K/Akt通路对DDR2及MMP-13表达的调控作用.方法 采用532 nm倍频激光视网膜光凝法制备棕色挪威(BN)大鼠CNV模型,将78只BN模型鼠按照随机数字表法分为正常对照组(n=7)、模型对照组(n=39)、PD98059(MEK1抑制剂)组(n=16)和LY294002(PI3K抑制剂)组(n=16),PD98059组和LY294002组大鼠分别于光凝后1d、7d玻璃体内注射5 mmol/L PD98059 3μl或5 mmol/L LY294002 3μl.分别于光凝前和光凝后1、3、7、14 d用过量麻醉法处死动物并制备样本和切片,采用Western blot法检测各组大鼠眼杯中ERK、p-ERK、Akt和p-Akt蛋白的表达变化,采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测各组大鼠眼杯中DDR2 mRNA和MMP-13 mRNA的表达变化,采用组织病理学方法测定各组大鼠CNV厚度,采用免疫组织化学和免疫荧光染色法分别定位和测定大鼠CNV区域DDR2和MMP-13的表达.结果 光凝后3d,光凝局部细胞增生,光凝后7 d CNV形成,至光凝后14 d CNV趋于稳定.免疫组织化学染色结果显示,DDR2在正常大鼠视网膜血管内皮细胞层、视网膜神经节细胞(RGCs)层和内核层细胞中呈弱表达,但在CNV中呈强阳性表达;MMP-13在正常对照组大鼠视网膜内界膜层、光感受器层和巩膜层均呈强阳性表达,在模型对照组中呈强阳性表达.免疫荧光结果显示,CNV组织中DDR2和MMP-13共表达.RT-PCR结果显示,模型对照组光凝后1、3、7、14 d DDR2 mRNA相对表达水平分别为55.22±4.03、47.74±2.23、14.82±4.56和5.59±2.47,MMP-13 mRNA相对表达水平分别为25.54±3.83、43.51±4.36、10.90±4.00和5.23±3.23,与正常对照组相比,差异均有统计学意义(均P＜0.05).免疫荧光结果显示,模型对照组光凝后3、7、14 d大鼠CNV区DDR2相对荧光密度单位(RFU)值分别为2.73±0.53、5.21±0.31和3.22±0.33,MMP-13 RFU值分别为1.66±0.17、3.57±0.44和2.67±0.21,组间总体比较差异均有统计学意义(F=81.01,P＜0.05;F=40.31,P＜0.01);PD98059组和LY294002组光凝后14 d CNV区DDR2 RFU值分别为1.14±0.19和1.03±0.14,与模型对照组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05),MMP-13RFU值分别为1.37±0.25和1.24±0.20,与模型对照组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).Western blot结果显示,模型对照组光凝后7d眼杯中p-ERK和p-Akt水平升高,与正常对照组大鼠相比差异均有统计学意义(均P＜0.05);至光凝后14 d恢复至近正常水平,与正常对照组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).PD98058组大鼠眼杯p-ERK水平明显下降,注射后7d、14 d PD98058组大鼠眼杯中p-ERK表达的抑制率分别为71.58％和65.21％,PD98058组7d与模型对照组7d比较、PD98058组14 d与模型对照组14 d比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).LY294002组大鼠眼杯中p-Akt表达水平明显下降,LY294002注射后7d、14d大鼠眼杯中p-Akt表达的抑制率分别为65.62％和67.04％,LY294002组7d与模型对照组7d比较、LY294002组14d与模型对照组14 d比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).各组眼杯中ERK和Akt的表达水平总体比较差异均无统计学意义(F=0.62,P＞0.05;F=0.81,P＞0.05).模型对照组、PD98059组和LY294002组光凝后14 d大鼠CNV厚度分别为(119.19±18.03)、(51.00±11.29)和(59.18±9.00) μm,总体比较差异有统计学意义(F=29.376,P＜0.05),与模型对照组比较,PD98059和LY294002注射后CNV厚度分别减少57.21％和50.34％,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 DDR2和MMP-13在大鼠CNV中表达上调,参与CNV的形成;MEK/ERK和PI3K/Akt通路通过参与调控DDR2和MMP-13在CNV局部的表达而抑制CNV的发生和进展.
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DDR2和MMP-13在中耳胆脂瘤中的表达及意义
目的:研究在中耳胆脂瘤上皮组织中盘状结构域受体2 (DDR2)、基质金属蛋白酶13(MMP-13)的表达水平,探讨两者在中耳胆脂瘤骨质破坏中的作用及相互关系.方法:运用免疫组织化学SP法检测DDR2、MMP-13在30例中耳胆脂瘤上皮组织和10例外耳道正常上皮组织中的表达水平,并应用计算机图像分析系统对其表达进行定量分析,分析两者在中耳胆脂瘤上皮组织中的表达与骨质破坏程度之间的相互关系.结果:在中耳胆脂瘤上皮组织中DDR2及MMP-13表达的平均光密度值显著高于外耳道正常上皮组织(P＜0.05).DDR2和MMP-13在中耳胆脂瘤上皮组织的表达呈正相关(r=0.738,P＜0.01);且两者的表达与骨质破坏程度呈正相关,骨质破坏范围越广,二者的表达越高(P＜0.05).结论:DDR2和MMP-13在中耳胆脂瘤的骨质破坏中可能具有重要的作用.
关键词： 盘状结构域受体2 基质金属蛋白酶-13 胆脂瘤 中耳 -
盘状结构域受体2在大鼠酒精性肝纤维化模型中的表达
目的 观察盘状结构域受体2(DDR2)在大鼠酒精性肝纤维化不同病理阶段的表达情况,揭示DDR2在酒精性肝纤维化发生、发展中的作用.方法 橄榄油拌平衡饲料喂养大鼠的基础上给予60%(V/V)白酒胃内灌注,制备酒精性肝纤维化模型,分别于12、16、20周末观察肝脏病理学改变,并检测血清学指标和肝纤维化指标,荧光定量-PCR和Western blot检测肝组织DDR2基因和蛋白表达并与各项酒精性肝纤维化评价指标进行相关性分析.结果 (1)白酒灌胃后DDR2 mRNA和蛋白表达量随造模时间延长而增加,对照组DDR2 mRNA和蛋白表达分别为1.023±0.132、0.321±0.027,模型1组为3.644±1.686、0.476±0.046,模型2组为8.337±2.387、0.738±0.057,模型3组为15.730±4.569、0.997±0.049,四组之间DDR2 mRNA水平(F=21.74,P<0.01)及蛋白质表达(F=10.38,P<0.01)差异有统计学意义.(2)相关性分析显示酒精性肝纤维化形成过程中,DDR2与Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原面积及血清透明质酸、层黏连蛋白、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原蛋白水平等均呈显著正相关,其中与Ⅲ型胶原、透明质酸、Ⅳ型胶原蛋白关系为密切.结论 随酒精性肝纤维化进展,DDR2表达呈时间依赖性,提示其在酒精性肝纤维化的发生和进展中发挥重要作用.
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促炎分子盘状结构域受体2在泛素化修饰过程中与泛素分子的偶联方式
目的 研究泛素分子中哪些位点的赖氨酸(Lys)残基参与了具有促炎效应的膜受体盘状结构域受体2(DDR2)的多聚泛素化修饰.方法 将DDR2、Cbl-b及泛素分子不同位点Lys的突变体共转染HEK293T细胞,以胶原蛋白刺激细胞诱导DDR2发生活化.利用免疫沉淀方法分离细胞中的DDR2,Western blot法检测DDR2与不同泛素分子的偶联情况.结果 仅保留27位Lys的泛素分子偶联到DDR2分子上的能力与野生型泛素分子相接近,保留33位Lys的泛素分子有较微弱与DDR2偶联的能力.27位Lys突变可使泛素分子彻底丧失与DDR2相偶联的能力,而33位Lys突变使得泛素分子偶联DDR2的能力部分丧失.结论 Cbl-b介导的DDR2的多泛素化修饰主要是通过泛素分子的Lys27偶联的,Lys33可能也部分参与了DDR2的泛素化修饰.
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盘状结构域受体2在前列腺癌组织标本中的表达及临床意义
目的 探讨盘状结构域受体2 (DDR2 )蛋白在前列腺癌组织标本中的表达 ,分析其与其临床病理特征的关系 ,初步明确DDR2在前列腺中的作用 ,为探寻新的治疗靶点提供基础.方法 采用免疫组化检测46例前列腺癌和18例良性前列腺增生组织标本中DDR2的表达情况.结果 前列腺癌组织的DDR2阳性表达率(82 .61% )明显高于良性前列腺增生组织的DDR2的阳性表达率(11 .11% ,P<0 .05).Gleason 5~7分组和8~10分组前列腺癌组织的DDR2阳性表达率明显高于Gleason 2~4分组前列腺癌组织DDR2阳性表达率 (P<0 .05).DDR2蛋白阳性表达与 TNM 分期比较 ,TNM分期越晚 ,DDR2阳性表达率越高(P<0 .05).血清PSA水平≤20 μg/L组前列腺癌组织的DDR2阳性表达率明显低于 PSA>20 μg/L组(P<0 .05).而DDR2阳性表达率与患者的年龄因素无关(P>0 .05).结论 DDR2在前列腺癌中高表达 ,提示其在前列腺癌的发生发展中可能起重要作用.
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I型胶原对缺氧状态下RPE细胞DDR2和HIF-1α及VEGF表达的影响
目的:观察缺氧状态下人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中盘状结构域受体2(discoidin domain receptor 2,DDR2)的表达,观察Ⅰ型胶原缺氧刺激下RPE细胞中DDR2,缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,探讨Ⅰ型胶原和DDR2在脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)发生中的作用.方法:对照实验研究.将体外培养的人RPE细胞置于含终浓度为200μmol/L CoCl2的培养液中培养以建立RPE细胞化学缺氧模型.在缺氧后即刻(即常氧状态下)、2,6,12和24h终止缺氧,用免疫荧光、逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫蛋白印迹法(Western blotting)检测RPE细胞中DDR2的表达.缺氧条件下以Ⅰ型胶原(10μg/mL,50℃孵箱内孵育)刺激,在刺激后即刻(即常氧状态下)、2,6,12,24h终止缺氧,用RT-PCR和Western blotting检测RPE细胞中DDR2和HIF-1α的表达,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法观察RPE细胞培养上清中VEGF的表达.结果:随着缺氧时间延长,RPE细胞中DDR2 mRNA和蛋白表达降低.在缺氧状态下Ⅰ型胶原仍可以随时间迁移使得DDR2 mRNA和蛋白表达增加,激活DDR2.缺氧胶原刺激组相对于缺氧组HIF-1α mRNA和蛋白表达减少,VEGF蛋白表达减少.结论:缺氧条件下,RPE细胞中DDR2表达随时间推移逐渐降低.Ⅰ型胶原仍可以随时间迁移激活DDR2,缺氧胶原刺激可以抑制缺氧诱导的RPE细胞HIF-1α和VEGF表达上调.
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DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达
目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.
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盘状结构域受体2与EGFP融合载体的构建及细胞中的活性分析
目的: 寻找使盘状结构域受体2(DDR2)在细胞内的表达情况易于检测并能动态追踪其蛋白表达分布的途径. 方法: 采用PCR技术扩增获得DDR2编码区无终止码序列,通过限制性酶切将DDR2片段亚克隆入pEGFP-N3载体中,转染293T细胞后通过倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,并用免疫印迹技术检测融合载体的表达及胶原刺激后活化状况. 结果: 成功构建了DDR2/EGFP融合表达载体,进一步的分析也证明此融合表达载体能在细胞中正确表达并可以被配体所激活. 结论: DDR2/EGFP的成功构建及可进一步检测磷酸化,为深入研究DDR2的功能奠定了基础.
