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巢式序列特异性引物PCR方法检测HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合的临床应用研究
目的 探索临床应用巢式序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)方法 检测HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合状态的可行性.方法 选取25对拟行HLA单倍体相合造血L干细胞移植治疗的实体肿瘤患者及其供者,供受者为母子关系15例,父子关系10例.采集供受者外周血提取基因组DNA,采用巢式PCR-SSP方法 检测患者外周血中供者来源的HLA-DRB1位点,并计算母胎微嵌合阳性率.随机选取经巢式PCR.SSP证实嵌合刚性和阴性且供受者性别不同的患者各4例,采用荧光原位杂交(FISH)技术进行重复检测,并与巢式PCR-SSP方法 的检测阳性率进行比较,同时采用噻唑蓝法检测这8例患者分别与其亲缘供者和HLA完全不相合无关第3人之间的混合淋巴细胞增殖反应(MLR),并计算增殖指数(SI).结果 巢式PCR-SSP方法 灵敏度町高达0.001%,并具有较好的特异性.巢式PCR-SSP检测显示,在母子移植关系患者中母胎微嵌合阳性检出率为40%(6/15),而在父子移植关系患者中母胎微嵌合阳性检出率为0.巢式PCR-SSP方法 的检测灵敏度与FISH技术相比明显增高,其检测阳性率分别为50%(4/8)和12.5%(1,8).MLR检测显示,嵌合阳性患者对其亲缘供者和无关第3人外周血单个核细胞(PBMC)的S1分别为(0.949±0.023)、(1.320±0.095),嵌合阴性患者对其亲缘供者和无关第3人PBMC的SI分别为(1.133±0.036)、(1.245±0.069);嵌合阳性患者对其亲缘供者PBMC的增殖反应强度与嵌合阴性患者相比明显降低(P=0.001),并且也显著低于其对无关第3人PBMC的增殖反应强度(P=0.003).结论 巢式PCR-SSP方法 灵敏度高、特异性好,适用于临床HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合状态的快速检测.
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1例肾移植术后应用激素诱发精神异常的护理
尿毒症患者在接受同种异体肾移植手术时.为防止器官移植后的排斥,除了手术前进行组织相容性试验等检查外,术后还需要应用免疫抑制剂,其中包括术中、术后大剂量糖皮质类固醇激素(500mg左右)的静脉给药.糖皮质激素可使患者发生欣快、激动、失眠等症状,个别病例可诱发精神病[1].
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HLA-Cw基因常规检测区外第1、5、6、7外显子核苷酸序列测定的研究及临床应用
目的 研究中国人群HLA-Cw基因第1、5、6、7外显子的分子遗传多态性,探讨增加第1、5 6 7外显子核苷酸序列测定在临床组织配型工作中的重要性及意义.方法 应用PCR-SBT法,对324份样本的HLA-Cw基因第2、3、4外显子作常规测序分型.对检出的模棱两可结果,设计HLACw第1、5 6 7外显子序列测序引物并优化测序反应条件,增加第1、5、6、7外显子核苷酸序列分析.结果 对HLA-Cw基冈第2、3、4外显子常规检测,一次性获得等位基因前4位数分型结果 的样本占23.8%(77/324);出现模棱两可结果的样本数占76.2%(247/324),检出的模棱两可等位基因组合有73种;增加HLA-Cw基因的第1、5、6、7外显子多态性检测,可解决Cw* 030201/030202、030301/0320N、Cw* 040101/0409N/0430、Cw* 070201/0750、Cw* 0403/0409N/0430和Cw* 080101/0822等10种常见的模棱两可等位基因组合.结论 在临床HLA-Cw基因配型中增加第1、5、6、7外显子多态性检测,有助于解决测序分型中的模棱两可的结果 和提高HLA-Cw基因分型精确度,对临床组织配型工作具有重要意义.
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提高输血疗效必须首先完善输血前血液的相容性试验
血型鉴定与相容性试验直接关系到输血疗效.为避免严重的输血反应,有较多新的免疫血液学技术与方法正逐步应用于输血实验室,如凝胶试验、单核细胞单层分析试验以及血型基因分析等.在这些技术中,有些可提高检测的灵敏度和自动化水平,有些则可更为准确地预示输血后红细胞在体内存活状态.运用这些技术,可使输血的相容性明显提高.虽然在解决疑难血型问题时,并没有通用的方法,但医务工作者可通过选择不同免疫血液学技术进行组合,也可及时为患者提供合适的血液.
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2005年至2008年全国HLA低分辨基因分型检测室间质量评价结果分析
目的 总结并分析2005年至2008年全国医院I临床实验室HLA低分辨基因分型检测室间质量评价(EQA)结果,为进一步提高临床实验室HLA基因分型检测水平提供有价值的参考.方法 根据HLA低分辨基因分型检测的特点,用常规统计方法归纳了连续4年EQA活动的结果,分析了近4年EQA活动中回报结果的错误率以及导致错误结果的可能原因.结果 2005年至2008年,参与HLA低分辨基因分型检测EQA项目的 临床实验室从22家增加到61家;连续4年EQA活动中回报数据共计2 844份,总体错误率为1.05%(30/2 844);每年出现错误的实验室比率分别为13.6%(3/22)、10.7%(3/28)、10.6%(5/47)、16.4%(10/61);连续4年EQA活动中错误数据共计30份,错误类型主要包括HLA基因分型错误25份、人为错误5份.结论 目前我国临床实验室HLA低分辨基因分型检测错误的比例过高;由于错误类型以基因分型错误和人为错误为主,反映了从业人员在HLA基因分型技术上存在不容忽视的问题.
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同种异体肢体移植配型的初步探讨
目的研究组织配型在同种异体肢体移植中的意义和潜力。方法对准备接受同种异体手移植的10例单手或双手缺失准备接受异体手移植的患者和潜在的供者进行ABO血型和Rh血型、群体反应抗体（PRA）检测及混合淋巴细胞培养试验，采用聚合酶链反应(PCR)方法测定人类白细胞抗原（HLA）。结果为其中2例患者各找到1名ABO血型（A-A、O-O）、Rh血型相符，PRA和混合淋巴细胞培养试验均为阴性，人类白细胞抗原（HLA）配型半相合的供者。手术后联合应用免疫抑制剂，移植手顺利成活，免疫监测和皮肤活检证实无排斥反应发生。结论理想的组织配型是避免异体手移植发生排斥反应的前提条件；异体手移植理想的组织配型条件是ABO血型、Rh血型相符，淋巴细胞毒性交叉配合试验为阴性；PRA水平越低、HLA位点配合的越多，越能提高异体手移植的成功率和存活率。
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HLA配型不合造血干细胞移植GIAC方案100例临床分析
目的研究人类白细胞抗原(HLA)配型不合造血干细胞移植(HSCT)治疗恶性血液病的新移植方案.方法100例恶性血液病患者,56例为高危病例,进行HLA配型至少1个位点不合的亲缘供者HSCT.采用GIAC移植方案,即G-CSF动员供者干细胞,强化、延长的免疫抑制促进植入及预防移植物抗宿主病(GVHD),使用抗胸腺细胞球蛋白,以及骨髓及外周血干细胞联合移植.结果所有患者均达完全供者植入.发生Ⅱ～Ⅳ度急性GVHD(aGVHD)45例,累积发生率48.39%,发生Ⅲ～Ⅳ度aGVHD12例,累积发生率12.90%.61例可评估的患者中,发生慢性(c)GVHD 38例,广泛型11例.复发12例,11例为高危患者,3例经供者淋巴细胞输注达再次完全缓解.死亡22例,6例死于复发,16例死于移植相关合并症.72例患者无病存活,1年预期无病生存率,高危组为(47.63±8.49)%,标危组为(83.52士7.41)%.结论GIAC方案适用于HLA配型不合的HSCT,是治疗恶性血液病比较安全、有效的方案.
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6965名汉族骨髓供者HLA多态性分析
目的分析中国汉族骨髓供者的人类白细胞抗原(HLA)多态性,并寻找和鉴定新的HLA等位基因.方法采用序列特异性引物聚合酶链反应、DNA测序技术以及分子克隆等以DNA为基础的HLA基因分型技术.结果共鉴定6965人份无关汉族骨髓供者的HLA-A、B、DRB1座位上的等位基因,其中4707人份为南方汉族个体,2258人份为北方汉族个体.在受检群体中共检出72种HLA特异性,包括过去很少在汉族人群中被检测到的HLA-A25、A34、A74、B41、B42、B53、B73、B81等.HLA-A、B、DRB1座位上尚未被检测出的空白基因频率分别小于0.20%,0.25%和0.70%.发现3个新等位基因,已被WHO命名为HLA-A*0253N,HLA-A*1114和HLA-B*5610.结论在骨髓供者HLA分型中使用以DNA为基础的基因分型技术,可以得到精确可靠的基因频率以及发现新的等位基因.一些HLA基因在南北汉族人群中的分布有明显的差异,为了能大限度地募集到带有不同HLA分型的骨髓供者,有必要在我国南北多个地区筛选骨髓供者.
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角膜移植术前HLA氨基酸残基配型的应用
目的探讨眼外伤后角膜盲患者在角膜移植术前进行人类白细胞抗原(HLA)氨基酸残基配型的临床意义.方法 66例(67眼)眼外伤后角膜盲患者,按角膜新生血管程度分2组:新生血管组51眼,术前视力眼前手动～指数;角膜白斑组16眼,术前视力眼前指数～0.1.HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原分别由一步单抗法和DNA法检测.根据HLA氨基酸残基的相配数分为HLA低错配组(2错配、3错配)和高错配组(4错配、5错配).角膜移植术式:单纯穿透性角膜移植术、(深)板层角膜移植术或联合羊膜移植、角膜缘上皮移植手术、带板层巩膜瓣的全角膜移植术.结果新生血管组排斥反应率明显高于角膜白斑组(P<0.05).新生血管组中HLA高错配组排斥反应率高于低错配组(P<0.01),相对危险度RR=1.772,高错配组发生排斥反应的危险性是低错配组的1.772倍;而且低错配组的术后视力高于高错配组(P<0.01).角膜白斑组中HLA高错配组排斥反应率高于低错配组(P>0.05);术后视力两组差异无显著性(P>0.05).结论眼外伤后角膜新生血管丰富者,排斥发生率高,其中HLA高错配组的排斥反应率明显高于低错配组,术前进行HLA配型有临床指导意义;单纯角膜白斑组术前HLA配型无特别意义.
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白血病患者与非亲缘造血干细胞供者的HLA-Cw基因高分辨分型
目的 对白血病患者与非亲缘造血干细胞供者进行HLA-Cw基因高分辨分型,探讨供、受者的相合几率.方法 用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)联合序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)方法进行HLA高分辨分型,依据分型结果将78例白血病患者与来自中国造血干细胞捐献者资料库中的126名供者进行配对,选择配合佳者.结果 21例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中,HLA-Cw高分辨分型的常见基因型为Cw*0102、Cw*0304、Cw*0302、Cw*0702和Cw*0801,其表型频率分别为0.57、0.33、0.19、0.14和0.14;ALL患者的Cw*0102和Cw*0304的表型频率明显高于捐献者(P＜0.05);7例患者(33.3%,7/21)的10个等位基因与捐献者全相合,HLA-Cw全相合常见的基因亚位点依次为Cw*0102(4/7)、Cw*0702(2/7).34例慢性粒细胞白血病(CML)患者中,HLA-Cw高分辨分型的常见基因型为Cw*0702、Cw*0102、Cw*0304、Cw*0801、Cw*0401和Cw*0303,其表型频率分别为0.44、0.38、0.21、0.18、0.15和0.12;与捐献者相比,CML患者各基因型的表型频率的差异均无统计学意义;8例患者(23.5%,8/34)的10个等位基因与捐献者全相合,HLA-Cw全相合常见的基因亚位点依次为Cw*0702(5/8)、Cw*0304(3/8).23例急性髓系白血病(AML)患者中,4例的10个等位基因与捐献者全相合,其原发病均为AML-M2型.结论 ALL患者和捐献者的Cw*0102和Cw*0304基因表型频率较高,有利ALL患者寻找到HLA-Cw相合的供者.
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致敏肾移植患者体内预存抗H LA抗体的特异性及HLA配型
目的 探讨致敏肾移植患者体内预存抗HLA抗体的特异性及其HLA配型.方法 以酶联免疫吸附试验动态监测136例群体反应性抗体(PRA)阳性的肾移植患者手术前后IgG型抗HLA抗体的水平及其特异性.应用抗HLAⅠ类单克隆抗体湿板进行供、受者HLAⅠ类抗原分型,微量序列特异性引物法进行供、受者HLAⅡ类基因分型,根据HLAⅠ类抗原交叉反应组(CREGs)配型标准和Ⅱ类抗原可接受性错配原则进行供、受者选配.结果 136例中,104例存在抗HLAⅠ类IgG抗体,76例存在抗HLAⅡ类IgG抗体,44例同时存在抗HLAⅠ类和Ⅱ类IgG抗体.按照传统HLA抗原配型标准,136例中,供、受者HLA抗原无错配、1个抗原错配、2个抗原错配、3个抗原错配、4个抗原错配者分别为7例(5.1%)、26例(19.1%)、47例(34.6%)、39例(28.7%)和17例(12.5%);而按照CREGs配型标准,HLA抗原无错配、1个抗原错配、2个抗原错配、3个抗原错配者分别为31例(22.8%)、53例(39.0%)、36例(26.5%)和16例(11.7%),没有4个抗原错配者.按照CREGs配型原则,HLA抗原无错配者的急性排斥反应发生率明显低于2个和3个抗原错配者(P＜0.05),其移植肾1、3、5年存活率明显高于2个和3个抗原错配者.结论 根据CREGs配型标准能够显著提高供、受者的相配率;良好的HLA配型可降低排斥反应的发生率,提高移植肾的存活率.
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心脏移植的组织配型与早期存活分析
目的观察9例心脏移植供、受者组织配型,分析其与心脏移植早期存活的关系.方法应用国际标准方法,对9例心脏移植供、受者进行血型、HLA抗原、淋巴细胞毒及群体反应性抗体等检测,并用氨基酸三联体及交叉反应组方法对供、受者匹配程度进行评价.结果 9例心脏移植,存活6例,死亡3例.其中综合评价配合好的2例及差的2例中各有1例死亡.术后活检证实,存活及死亡病例均未发生排斥反应.结论在有效的免疫抑制剂治疗下,HLA配型结果不影响移植物的早期存活.
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交叉反应组配型在高致敏患者肾移植中的应用
目的探讨交叉反应组(CREG)配型在高致敏患者肾移植中的临床意义.方法动态监测肾移植受者体内群体反应性抗体(PRA)的水平及其特异性,按照CREG配型原则选择匹配的供者.结果60例受者术前PRA超过11%,均有单纯性或混合性升高;按照CREG配型,0～1个抗原错配、2个抗原错配、3～4个抗原错配者术后肌酐恢复正常的时间平均为6.5 d、7.0 d、12.7 d,发生肾功能恢复延迟的例数分别为0、7例、3例,各组间的差异具有显著性(P＜0.05).结论高致敏受者在肾移植时采用CREG配型,可避开受者预存的HLA抗体特异性所对应的抗原,对于提高肾移植人/肾存活率具有重要意义.
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HLA空间构象的模拟比较
通过对两对骨髓移植后发生移植物抗宿主病(GVHD)的供受体有差异的HLA Ⅰ类抗原的结构模拟和比较,发现差异HLA抗原在空间构象上存在明显差异,并表现在分子表面上,这种蛋白质分子表面空间构象上的差异是移植后GVHD的引发因素.研究结果提示移植供受体差异HLA蛋白质的模拟比较可以用于预测GVHD的发生.
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神经母细胞瘤组织分型的生物特性与临床意义
目的探讨不同神经母细胞瘤组织分型的生物特性和预后评估意义.方法按Shimade分型将61例神经母细胞瘤分为组织结构良好型(FH)和组织结构不良型(UH),应用免疫组化检测Trk-A、N-myc、NSE、CD44表达,统计分析FH和UH型的生物标记表达和生存率差异.结果 61例分型为FH型40例、UH型21例;UH型的Trk-A阳性率(6/14)明显低于FH型(27/32)、N-myc阳性率(8/14)则高于FH型(10/32), NSE和CD44检测无明显差异.FH型的3年和5年生存率(57.6%和27.3%)均高于UH型(18.8%).结论神经母细胞瘤的组织分型对肿瘤生物特性、临床诊治和预后评估有指导意义.
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HLA半相合造血干细胞移植治疗恶性血液病的临床观察
背景与目的:异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是目前治疗恶性血液系统疾病的有效手段.但仅有25%～30%的患者能找到人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)相合的亲缘供者;在无关人群中找到相合供者的概率是1/5万～1/10万,甚至更低.若进行HLA半相合造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT),则有90%的患者能找到供者,本文旨在探索HLA半相合HSCT治疗恶性血液病的可行性.方法:25例恶性血液病患者进行HLA半相合(其中单倍体20例)的亲缘供者HSCT.采用延长、强化联合免疫抑制促进植入及使用抗胸腺细胞球蛋白(antithymocyte globulin,ATG)和/或加舒莱(抗CD25单抗)加强预防移植物抗宿主病(graftversus-host disease,GVHD),粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulatin factor,G-CSF)动员的骨髓(bone marrow,BM)或加外周血干细胞(peripheral blood stem cell,PBSC)混合移植方案.结果:所有患者均获得造血重建及达完全供者植入.21例(21/25)发生急性GVHD(aGVHD),其中Ⅰ度8例,Ⅱ度6例,Ⅲ度2例,Ⅳ度5例(其中3例为同胞部分相合),Ⅱ～Ⅳ度和Ⅲ～Ⅳ度aGVHD累积发生率分别为48.0%和28.6%.12例(12/25)发生慢性(c)GVHD,均为局限性.16例患者无病生存,1年预计无病生存率(disease-free survival,DFS)为(64.00±2.98)%,1年预计总生存率(overall survival,OS)为(64.0±3.08)%.9例死亡,其中1例死于复发,8例死于移植相关合并症,其中肺部感染4例,Ⅳ度GVHD 3例,白质脑病1例.结论:HLA配型半相合的HSCT是治疗无亲缘和无关供体全相合的高危恶性血液病的有效方法,但风险较大,需在严密监测下慎重使用.
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HLA氨基酸残基配型在免疫致敏受者肾移植中的应用探讨
[目的] 探讨人类白细胞抗原( HLA)氨基酸残基配型( Res M)在免疫致敏尤其是高敏受者肾脏移植中的临床意义.[方法] 对 47例致敏受者采用酶联免疫吸附法( ELISA)检测体内预存的群体反应性抗体-IgG( PRA-IgG)的水平及特异性;采用一步法单克隆抗体技术和微量序列特异性引物聚合酶链反应( Micro-PCR-SSP)技术进行 HLAⅠ类和Ⅱ类分型.[结果] 47例致敏受者的 PRA-IgG水平为 8.3%～ 96.4%,平均为 38.8%,供受者间按传统的 HLA抗原错配( MM)原则, 0-1错配( MM)、 2 MM的患者分别为 5例( 10.6 %)、 9例( 19.1%),而按 Res M的原则, 0-1 MM、 2 MM患者分别提高到 22例( 46.8%)、 17例( 36.1%)( P< 0.001);其中 PRA≥ 50%的 18例高敏受者中, 0-1MM 13例( 72.2%),而 PRA< 50%的 29例受者中, 0-1MM 9例( 31%),两者间差异有统计学意义( P< 0.001); 47致敏受者肾移植术后 3个月内排斥反应的发生率为 35%,在 18例 PRA≥ 50%的高敏受者中,仅有 4例( 22.2%)发生排斥反应, 29例 PRA< 50%的受者中, 11例( 37.9%)发生排斥反应 (P > 0.05).[结论] HLA氨基酸残基配型可显著提高供受者的相配率,良好的 HLA配型对减少高敏受者肾移植的排斥反应、提高移植物的存活率具有重要意义.
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活体亲属肾移植患者HLA配型配合率的分析
目的 研究亲属肾移植供受者人白细胞抗原(HLA)配合率,为临床选择良好的供受者HLA配型提供参考.方法 收集本院2006年1月至2008年5月106例亲属肾移植患者进行HLA配合率分析.结果 (1)父母供肾组:42例大于或等于HLA抗原半相合.(2)子女供肾组:2例HLA抗原半相合.(3)兄弟姐妹间供肾组:26例HLA完全相合9例,13例为半相合,其余为低于半相合.(4)其他亲属供肾组:HLA抗原配合呈多样性.(5)夫妻间供肾组:HLA配合率均小于或等于3个抗原.结论 父母、子女及兄弟姐妹间的肾移植供受者HLA配合率高于其他亲属.
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急性白血病缓解前后HLA分子血清学分型和分子生物学分型的比较
目的 比较急性白血病(AL)患者缓解前后HLA血清学分型以及分子生物学分型的结果,以确定能否在缓解前进行HLA配型.方法 对20例AL患者缓解前后外周血标本分别应用微量淋巴细胞毒(CDC)和序列特异性引物聚合酶链反应技术(PCR-SSP)进行HLA血清学和分子生物学分型.对HLA Ⅰ类分子CDC反应强度进行NIH计分,进行缓解前后配对t检验;对缓解前后HLA Ⅰ、Ⅱ类分子等位基因特异性进行比较.结果缓解前后所有病例HLA Ⅰ、Ⅱ类分子等位基因特异性均未出现缺失或改变.缓解前后HLA-A、B基因座位抗原及Bw6超型的CDC反应强度差异有统计学意义(P＜0.05),缓解前表达明显下调;Bw4超型在缓解前后的CDC反应强度差异无统计学意义(P＞0.05).HLAⅠ类分子表达下调或缺失与外周血幼稚细胞含量无明显相关性.结论对AL患者,可以在确定诊断时即进行HLA的分子生物学分型,从而缩短配型时间,增加寻找合适供者的机会.
