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低切应力对动脉粥样硬化血管平滑肌细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响
目的研究低切应力对颈总动脉粥样硬化形成及其血管平滑肌细胞凋亡的影响. 方法应用低切应力颈总动脉粥样硬化模型,采用免疫组织化学方法观察大白兔血管平滑肌细胞的Bcl-2及Bax蛋白表达的变化.结果颈总动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的Bcl-2表达减少、Bax表达增高.结论在低切应力作用下动脉粥样硬化的形成过程中,低切应力与高脂协同作用,可使促进凋亡的因素增强,抑制凋亡的因素减弱,从而调控VSMC的凋亡.
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microRNA-1在低切应力诱导血管平滑肌细胞增殖中的作用
[目的]研究microRNA-1 (miR-1)参与切应力条件下ECs (endothelial ceils,ECs)对VSMCs(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖活性调控的力学生物学反应机理,将有利于进一步探索动脉粥样硬化等心血管疾病的发病机制.[方法]应用细胞联合培养平行平板流动腔系统对与VSMCs联合培养的ECs施加15 dyn/cm2的正常切应力(normal shear stress,NSS)和5 dyn/cm2的低切应力(low shear stress,LowSS),加载时间为12 h;Western blotting检测联合培养VSMCs的细胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达变化;实时荧光定量PCR检测联合培养VSMCs的miR-1表达变化;通过TargetScan、miRWalk等网站预测miR-1的目标蛋白;Western blotting检测联合培养VSMCs的miR-1靶蛋白锌指转录因子4(kruppel-like factor4,Klf4)的表达;通过转染技术,上调和抑制VSMCs的miR-1表达,Western blotting技术检测靶蛋白Klf4和PCNA的表达变化,以此验证miR-1对Klf4的负调控作用.[结果]与NSS相比,LowSS促进联合培养VSMCs的PCNA表达并显著抑制miR-1表达;TargetScan、miRWalk等网站预测miR-l的下游靶蛋白为Klf4;与NSS相比,LowSS明显上调联合培养VSMCs的miR-1靶蛋白Klf4的表达;静态条件下上调VSMCs的miR-1表达,靶蛋白Klf4和PCNA表达均显著降低,抑制VSMCs的miR-1表达,靶蛋白Klf4和PCNA表达均明显升高.[结论]LowSS通过联合培养VSMCs的miR-1及靶蛋白Klf4,促进VSMCs的增殖.
关键词： 低切应力 血管平滑肌细胞 microRNA-1 锌指转录因子4 增殖 -
低切应力对高血压颈动脉血管重构作用的影响及其信号转导机制
目的 观察低切应力对高血压颈动脉血管重构作用的影响,并初步探讨其信号转导机制.方法 分离猪右侧颈总动脉,建立血管体外培养模型,实验分为高切应力组(切应力20 dyn/cm2,对应灌洗液的流量为200 ml/min)、低切应力组(5 dyn/cm2,对应灌流液的流量为50 ml/min)及对照组(未经培养的新鲜血管).镜下测量颈动脉内径及壁厚度,并计算壁横截面积;TUNEL法检测切应力对体外培养猪颈总动脉血管平滑肌细胞凋亡影响;Western blot法检测切应力对体外培养猪颈总动脉血管组织中RhoA、P-MYPT-1、P-ERK1/2、P-JNK和P-P38蛋白表达影响.结果 与对照组和高应力组比较,低应力组血管壁厚度和壁横截面积明显增加(P＜0.05),血管内径明显变小(P＜0.05),内径/壁厚比值明显降低(P＜0.05);血管平滑肌细胞TUNEL染色阳性细胞明显增多(P＜0.05),凋亡率显著增加(P＜0.05);血管组织中RhoA、P-MYPT-1 、P-ERK1/2、P-JNK和P-P38蛋白的表达水平明显升高(P＜0.05).结论 低切应力对体外培养高血压颈动脉血管重构具有显著地诱导作用,其机制可能与其激活RhoA/ROCK信号,从而引起胞质内丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)的3个成员(ERK1/2、JNK、P38)的磷酸化反应有关.
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低切应力在动脉粥样硬化形成中的作用--动物模型的建立和形态学观察
为了阐明低切应力在动脉粥样硬化形成中的作用机制,为动脉粥样硬化防治提供实验基础,本文建立了低切应力+高脂的动脉粥样硬化动物模型,观察了低切应力对动脉粥样硬化形成的影响.
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低切应力兔颈总动脉粥样硬化模型中血管平滑肌细胞凋亡相关基因BAX和BCL-2的表达
为探讨低切应力在动脉粥样硬化形成中的作用机制,观察了低切应力对动脉粥样硬化血管平滑肌细胞凋亡的影响.本文采用雄性新西兰白兔(体重2.5-3.0kg,n=54),左颈外动脉结扎,术后分别普通饲料、高脂饲料喂养,建立低切应力兔颈总动脉粥样硬化模型.设对照组(n=6),高脂组(n=24),普饲组(n=24).时相点为2、4、8、12周.
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015 液体低切应力振荡流对血管内皮细胞转录因子NFκB的影响
目的: 核因子κB(NFκB)是一种具有多向性调节作用的蛋白分子, 存在于胞浆中, 一旦活化则可转位进胞核中与目标基因启动区域中特定序列结合而调控基因的转录. 在血管内皮细胞中NFκB参与白细胞粘附分子、 MCP-1、细胞因子等基因的转录调控. 已往工作已经证明, 流体低切应力振荡流动方式作用脐静脉内皮细胞可导致粘附分子VCAM-1表达上调, 这在动脉粥样硬化发生中起重要作用. 故进一步探讨这种VCAM-1的上调是否与NFκB参与调节相关. 方法: 接种的第二代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)玻片置于平板流动腔中, 在无菌条件下连接到灌流系统, 调节流动腔隙的高度及灌流液速率达到所需切应力(0.2 Pa), 在此基础上, 用T形管连接一个偏心轮使液面在HUVEC表面来回摆动为振荡流, 这种流动方式作用于HUVEC 4 h后, 用细胞免疫化学方法测定EC的NFκB阳性率及阳性强度. 结果: 经振荡流作用后内皮细胞中NFκB阳性率明显增高、强度明显增加、分别为81.52%±10.65%和198.60±32.61(P<0.001), 处于静态EC为对照组, NFκB阳性率和强度分别为28.93%±14.06%和43.40±22.59, 经γTNF-α(5 ng/ml)处理内皮细胞阳性率为99.42%±0.84%, 阳性强度为277.23±23.26(P<0.001). 结论: EC经低切应力振荡流作用后明显增加NFκB的核转位, NFκB的活化能上调粘附分子的表达, 增加了在动脉粥样硬化易发部位单核和内皮细胞的粘附.
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016 不同流动方式的流体对血管内皮细胞粘附分子VCAM-1表达的影响
目的: 动脉粥样硬化(AS)早期病变易发生于动脉分叉及动脉弯曲处, 推测与血液流动方式有关: 此处血流呈低切应力摆动方式, 血管其它部位的血流呈稳层流方式. 单核细胞粘附于血管内膜, 进而穿过内膜迁移到内膜下成为巨噬泡沫细胞, 这是AS的病理基础的早期细胞行为, 细胞粘附分子的表达是细胞粘附的分子基础. VCAM-1是参与内皮和单核粘附的主要粘附分子之一, 了解不同血流方式对血管内皮细胞(VEC)粘附分子VCAM-1表达的影响, 有助于AS发生机制的阐明. 方法: 接种的第二代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)玻片置于平板流动腔中, 在无菌条件下连接到灌流系统, 调节流动腔隙的高度及灌流液速率达到所需切应力(0.2 Pa), 此为稳层流, 在此基础上, 用T形管连接一个偏心轮使液面在HUVEC表面来回摆动为振荡流, 这两种流动方式作用于HUVEC 4、 18 h后, 用细胞免疫化学方法测定EC膜上VCAM-1表达. 结果: 低切应力振荡流4、 18 h细胞阳性表达百分率分别为14.83%±2.09%(n=6, P<0.01), 10.40%±2.28%(n=5, P<0.05), 稳层流4、 18 h, 分别为2.45%±0.47%(n=9, P<0.05), 4.98%±1.34%(n=9, P>0.05), 对照组为4.41%±0.59%(n=9), 阳性对照组(用TNF-α 5 ng/ml作用)为20.33%±3.01%(n=9, P<0.001). 结论: 同是低剪切应力, 由于流动方式不同, 细胞粘附分子VCAM-1表达不同, 振荡流可上调粘附分子VCAM-1表达, 促进细胞粘附发生, 为AS在局部形成提供了基础.
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磷酸化p38介导低切应力诱导的血管内皮细胞Bmi-1表达
目的 探讨低切应力(LSS)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中Bmi-1表达的影响及其可能的机制.方法 原代培养HUVEC,免疫荧光检测Bmi-1在细胞中的定位;运用平行平板流动腔系统,给HUVEC加载0.5 Pa低切应力0.5 h、1h、2h和4h,以无切应力加载为对照组,用实时定量RT-PCR检测Bmi-1 mRNA表达,用Western blot检测Bmi-1蛋白表达,利用p38特异性抑制剂SB2219探讨信号转导途径.结果 免疫荧光观察发现Bmi-1主要分布在HUVEC胞核中;HUVEC在LSS作用0.5 h后Bmi-1表达即明显增强,随着作用时间延长(1h、2h、4h),Bmi-1mRNA及蛋白表达逐渐降低;切应力能显著激活磷酸化p38表达;SB2219可以明显抑制Bmi-1表达.结论 LSS可诱导HUVEC中Bmi-1表达,其表达量与刺激时间长短密切相关,这种作用可能通过p38信号调节.
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层流状态下高、低切应力对动脉重构及血管细胞粘附分子-1表达的影响
目的 制备小鼠腹主动脉狭窄模型,探讨近似层流状态下高、低切应力对动脉重构及VCAM-1表达的影响.方法 20只小鼠随机平均分为狭窄1d组、7d组、14d组和假手术对照组,用动脉银夹建立腹主动脉局部狭窄模型,超声检测狭窄近心端和狭窄处血流动力学参数,计算切应力值；血管标本行HE染色和内皮血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)免疫组织化学染色,定量分析动脉病理结构的改变及内皮VCAM-1表达的强度.结果 狭窄动脉近心端和狭窄处分别形成低、高切应力血流区,与对照组比较,随着作用时间的增加,狭窄近心端动脉内中膜逐渐增厚、内皮VCAM-1表达逐渐增强,而狭窄处动脉无明显结构改变及内皮VCAM-1表达.结论 血流动力学改变,尤其是低切应力可较早引起动脉重构,可能通过内皮VCAM-1的介导作用导致动脉粥样硬化的发生、发展,而高切应力则可能有抗动脉粥样硬化作用.
关键词： 低切应力 高切应力 血管重构 内皮血管细胞粘附分子-1 动脉粥样硬化 -
低切应力、血管重建与心血管疾病
心血管疾病如高血压、动脉粥样硬化等是危害人类生命健康严重的疾病之一.心血管病都有共同的发病学基础和基本的病理过程,表现为血管重建(vascular remodeling).血管重建是机体在生长、发育、衰老以及心血管疾病过程中的一种普遍现象,其主要表现是血管平滑肌细胞(VSMC)重排、迁移、增殖、肥大、凋亡和细胞外基质增加等.
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流体切应力对内皮细胞IL-8基因表达的影响及信号转导
目的流体切应力对于维持血管的稳定有着重要的作用.另外在一些病理情况下,例如动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的发病过程中,流体切应力也扮演着关键角色.我们以往的实验结果证实:以低流体切应力(4.2dyne/cm2)处理培养的人脐静脉内皮细胞1 h,其IL-8mRNA的表达上调;处理2 h其表达量上调更为明显.在本实验中我们将进一步阐明流体切应力对培养的人脐静脉内皮细胞IL-8基因表达、蛋白生成的影响及其信号转导途径.方法分别用实时定量RT-PCR及定量三明治ELISA检测IL-8基因表达及蛋白生成;通过基因转染及流式细胞数检测IL-8报告基因pEGFP1-IL8USCS经流体切应力作用后的激活情况;用免疫荧光化学染色观测对照和层流切应力处理以后NF-κB核转移情况;将对照和层流切应力处理后的内皮细胞裂解物进行I-κB和磷酸化的I-κB的免疫印迹实验,以检测切应力诱导的I-κB磷酸化和降解的情况;RT-PCR、Northern杂交和免疫荧光细胞化学染色观察TLR-4和TLR-2在人脐静脉内皮细胞上的表达;用RT-PCR技术从血管内皮细胞扩增胞内区段缺失突变TLR-4 cDNA克隆于真核表达质粒pcDNA3,构建重组TLR-4胞内缺失突变基因真核表达质粒pcDNA3-mTLR4,与pEGFP1-IL8USCS共转染内皮细胞,流式细胞术观察mTLR4对切应力诱导IL-8报告基因表达的影响.结果和讨论(1)未用切应力处理的内皮细胞没有IL-8基因的表达;切应力处理内皮细胞后,1 h IL-8 mRNA表达增加,2 h IL-8 mRNA表达量至高值,3 h IL-8 mRNA表达量开始下降,4 h后IL-8 mRNA持续相对高表达;各实验组(2.23、4.20、6.08 dyne/cm2)均表现出相同的IL-8 mRNA随时间的变化规律,即IL-8的表达对切应力有时间依赖性.(2)未用切应力处理的内皮细胞没有IL-8基因的表达;切应力处理内皮细胞后,低切应力时IL-8 mRNA表达量明显增加,高切应力时IL-8 mRNA表达量较低.IL-8 mRNA的表达量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系;不同的切应力作用时间(1、2 h)均表现出相同的IL-8 mRNA随切应力强度的变化规律.提示流体切应力诱导内皮细胞表达IL-8,不仅与切应力的作用时间有关,而且IL-8的表达量与切应力作用强度有关,两者之间具有明显的直线负相关.直线回归方程:1 h时为y=7.57-0.11x,相关系数r=-0.97;2 h时为y=7.92-0.10 x,相关系数r=-0.96.(3)未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的IL-8蛋白质生成;切应力处理内皮细胞1 h后,IL-8蛋白质生成量增加,处理5 h后IL-8蛋白质生成量增加至高值,处理8 h后IL-8蛋白质生成量下降,10 h后IL-8蛋白质生成量维持在一个较高的水平.各实验组(2.23、4.20、6.08 dyne/cm2)均表现出相同的IL-8蛋白质生成量随切应力作用时间的变化规律.提示流体切应力确实可以诱导内皮细胞生成IL-8,并且IL-8的生成量与切应力的作用时间有关,呈双相性变化.(4)未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的IL-8蛋白质生成;切应力处理内皮细胞后,低切应力(2.23 dyne/cm2)时IL-8蛋白质生成量明显增加,为高切应力(19.29 dyne/cm2)时IL-8蛋白质生成量的约6(作用5h)或7倍(作用6h).IL-8蛋白质生成量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系;直线回归方程:5 h时为y=760.12-36.06x,相关系数r=-0.978;6 h时为y=781.87-36.66x,相关系数r=-0.980.(5)pEGFP1-IL8USCS转染细胞,层流切应力刺激3 h后IL-8报告基因绿色荧光蛋白表达增强.(6)NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色显示,切应力刺激0.5 h,胞核即出现阳性反应,刺激1.5 h后,胞核呈强阳性染色.(7)细胞裂解物免疫印迹显示,刺激10 min时磷酸化IκB即显著增强,1 h后磷酸化IκB印迹强度降到无,而IκB随刺激时间延长而逐渐降低,0.5和1 h后降至测不到IκB.(8)免疫荧光细胞化学染色显示脐静脉血管内皮细胞膜表达TLR-4.RT-PCR和Northern杂交显示,人脐静脉血管内皮细胞表达TLR-2和TLR-4 mRNAs;当切应力刺激1 h后,TLR-4 mRNA表达明显增强.pcDNA3-mTLR4和pEGFP 1-IL8USCS共转染细胞,层流切应力刺激3 h后荧光蛋白表达未明显增强.本实验中我们采用的切应力为2.23、4.20、6.08 dyne/cm2,这些切应力与动脉血管分叉处等低切应力区生理切应力大小相似,在这些低切应力区,血管内皮细胞可分泌IL-8,IL-8转而激活中性粒细胞和单核细胞,调控它们和内皮细胞的黏附,这将触发一系列的病理变化,例如:动脉粥样硬化等.结论流体切应力诱导内皮细胞IL-8 mRNA的表达及IL-8蛋白的生成,在感染及动脉粥样硬化等病理过程中扮演着重要角色.
