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乳鼠心肌细胞对骨髓基质干细胞分化的影响
目的了解乳鼠心肌细胞对骨髓基质干细胞(MSCs)分化的影响.方法将已传一代的骨髓基质干细胞用Hoechst 33258预标记.乳鼠心肌细胞经培养2 d后再与骨髓基质干细胞共同培养5d,细胞爬片使用激光扫描共聚焦显微镜技术,经免疫荧光细胞化学鉴定肌钙蛋白-T的表达.流式细胞仪进行骨髓基质干细胞分选及乳鼠心肌细胞周期测定;提取各类细胞总RNA,行逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)鉴定肌钙蛋白-T1(Tn-Ti)的RNA表达.结果共同培养的MSCS表达肌钙蛋白-T及其RNA,而单独培养的MSCS无Tn-T1及其RNA表达;培养1 d后乳鼠心肌细胞周期为Go/G176%,S 12%,G2/M 12%.结论在共同培养下,骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化,这种分化不需要细胞与细胞的直接接触.
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自体和异体骨髓间充质干细胞移植对家兔股骨头缺血性坏死治疗作用的比较研究
目的 比较同种异体和自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植,对实验性家兔股骨头缺血性坏死的治疗作用;为建立BMSCs库及临床应用,提供实验证据.方法 采用新西兰大白兔液氮冷冻法造模,随机分为对照组(A),髓芯减压组(B),自体细胞移植组(C)和同种异体细胞移植组(D);对术后2、4、6、8周的标本,进行X线和组织学观察.结果 (1)X线检查显示:2周时,A组股骨头标本呈高密度,随时间延长,骨密度进一步增加,并出现骨小梁结构的紊乱和囊性变,8周时变化为显著.2周时,在B、C、D组股骨头钻孔区的边缘,出现密度增加;8周时,在B组股骨头钻孔区的周围,形成硬化线.在C、D组钻孔区,出现骨小梁结构.(2)组织学观察表明:液氮冷冻后,A组股骨头标本出现骨坏死和修复的病理变化.8周时B组钻孔区修复不完全.2周时C、D组钻孔区,均有大量移植的BMSCs存在;4周时两组钻孔区内,充满了新生骨小梁结构;在8周时钻孔区内,骨小梁趋于成熟.而且,C、D两组间骨小梁面积的图像分析,其差异无统计学意义.结论 同种异体和自体:BMSCs移植,对实验性家兔股骨头缺血性坏死的治疗,呈现相似的结果:建立BMSCs库供临床应用,具有较大的可行性.
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干细胞复合Ⅰ型胶原修饰的PLGA微球治疗骨质疏松性骨缺损
目的 观察骨髓间质干细胞复合Ⅰ型胶原修饰的聚乳酸聚乙醇酸(PLGA)微球支架注入骨质疏松大鼠股骨转子间骨缺损后骨质量的局部改善情况.方法 制备Ⅰ型胶原修饰的PLGA微球支架,将干细胞与该支架共同培养.40只3月龄雌性SD大鼠去势建立骨质疏松模型,随机分为对照组、缓冲液组、细胞组、微球组、细胞+微球组,每组8只,于股骨转子间用电钻制作骨缺损,每侧注入不同材料约30μl.术后1个月和3个月每组各处死4只大鼠,取股骨标本用骨密度仪和Micro CT测定转子间骨密度、骨小梁结构.结果 骨髓间质干细胞与Ⅰ型胶原修饰的PLGA微球支架体外培养7d,扫描电镜发现细胞在支架表面黏附、增殖良好.将不同材料分别植入大鼠骨缺损部位,术后1个月,各组转子间骨矿含量及骨密度比较,差异均无统计学意义.细胞+微球组骨小梁厚度高于缓冲液组和微球组,骨小梁面积百分数高于细胞组和微球组,骨小梁分离度与对照组、缓冲液组和微球组相比有减少趋势,但差异无统计学意义.术后3个月,细胞+微球组转子间骨矿含量有高于缓冲液组和微球组的趋势,但差异无统计学意义;BMD高于对照组、缓冲液组、细胞组和微球组;骨小梁厚度高于对照组、缓冲液组、微球组和细胞组,骨小梁面积百分数高于对照组和缓冲液组,骨小梁分离度与对照组、缓冲液组、细胞组和微球组相比有减少趋势,但差异无统计学意义.结论 骨质疏松部位植入干细胞复合Ⅰ型胶原修饰的PLGA微球1个月,即可修复骨质疏松部位骨缺损;3个月,可改建骨质疏松部位骨小梁结构,提高骨质量.
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干细胞在宫腔粘连治疗中的研究进展
宫腔粘连（intrauterine adhesions， IUA）是一种常见的子宫内膜损伤性疾病。随着频繁的宫腔操作及宫腔镜手术的普及，IUA的发病率和检出率逐年升高，已成为女性继发不孕的第二大病因。目前针对IUA的治疗，轻中度患者通过传统治疗方法尚能取得一定疗效，但对于重度或广泛内膜损伤的患者，子宫内膜再生和功能恢复已成为妇产科医生临床上棘手的问题。随着干细胞在再生医学领域的广泛研究，国内外学者相继证实子宫内膜干细胞的存在，为IUA的治疗提供了新思路。综述干细胞在IUA治疗中的研究进展。
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不同来源间充质干细胞定向诱导为神经样细胞的研究
目的:比较不同来源间充质干细胞( MSCs)在体外定向分化为神经样细胞的能力.方法:无菌获取不同来源的MSCs并进行分组.A组:胎儿真皮；B组:胎儿骨髓；C组:成人骨髓.倒置显微镜下观察各组细胞形态并检测其倍增时间.流式细胞术检测各组MSCs的细胞表型和细胞周期.全反式维甲酸(ATRA)诱导各组MSCs在体外分化为神经样细胞,倒置相差显微镜观察神经样细胞的形态,免疫组织化学法和Western blot检测神经元特异性标志一神经丝蛋白(NF)和星形胶质细胞特异性标志一胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果:不同来源的MSCs具有相似的细胞形态、细胞表型和细胞周期,但是C组MSCs的增殖能力及体外传代能力低于A组和B组.不同来源、不同扩增代数的MSCs在诱导剂的作用下呈现典型的神经样细胞的形态,免疫组织化学显示,NF和GFAP均呈阳性反应.结论:不同来源的MSCs均可以在体外分化为神经样细胞,但不同发育阶段的MSCs体外分化为神经样细胞的能力存在差异.
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吲哚-3-甲醇对小鼠骨髓造血细胞辐射损伤的防护作用及其机制
目的：研究吲哚-3-甲醇（I3C）对小鼠骨髓造血细胞辐射损伤的保护作用及机制。方法（1）密度梯度离心法获得CD45.1亚型C57BL/6J小鼠骨髓有核细胞，经0 mol/L、10-8 mol/L~10-3 mol/L I3C处理后，接受不同剂量（0 Gy、1 Gy、4 Gy）的137Csγ-射线照射；继续培养18 h后采用生物发光法检测细胞活力。（2）设空白对照组和10-6 mol/L I3C组，经上述3种剂量射线照射后，接种于甲基纤维素半固体培养基中培养7 d，观察骨髓粒-单核巨噬细胞集落（CFU-GM）形成情况。（3）取24只CD45.2亚型小鼠接受8 Gy 137Csγ-射线照射作为受体，CD45.1亚型小鼠骨髓有核细胞（供体）设空白对照组、4 Gy照射组和4 Gy照射+10-6 mol/L I3C组。将供体与竞争者（CD45.2亚型）骨髓细胞混和后，接种于受体小鼠体内（每组8只），流式细胞术检测受体小鼠外周血细胞中供体来源的细胞比例。（4）细胞设空白对照组、10-6 mol/L I3C组、1 Gy照射组和1 Gy照射+10-6 mol/L I3C组。培养24 h后收集细胞，提取蛋白后Western blot法检测各组核因子NF-E2相关因子（Nrf2）、血红素加氧酶（HO）-1表达。结果（1）I3C浓度>10-4 mol/L时出现明显的细胞毒性作用（P>0.05）；相同剂量射线照射下，10-7~10-6 mol/L I3C可减轻射线对细胞的损伤；因此选取10-6 mol/L为本研究I3C的实验浓度。（2）相同剂量射线照射下，10-6 mol/L I3C组CFU-GM形成数量较空白对照组明显升高（P<0.05）。（3）流式细胞结果显示，4 Gy照射组细胞移植后，受体小鼠外周血中供体细胞比例较对照组明显降低（P<0.05），而10-6 mol/L I3C预处理的供体小鼠细胞移植后，受体小鼠中供体细胞比例较4 Gy照射组升高（P<0.05）。（4）Western blot结果显示，1 Gy照射+10-6 mol/L I3C组Nrf2和HO-1蛋白表达水平明显高于其他3组（P<0.05）。结论 I3C可以减轻辐射引起的小鼠造血细胞损伤和功能下降，其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。
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非病毒载体携带Cbfal诱导成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究
目的:观察核心结合因子al (Cbfal )对成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向成骨细胞定向分化的诱导作用.方法:经密度梯度离心法和贴壁筛选法获得hBMSCs.非病毒载体FuGene HD携带Cbfa 1转染hBMSCs后7、14 d,经Real-time PCR分析hBMSCs成骨细胞标志基因表达,包括Cbfal 、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、骨桥蛋白(OPN)和Ⅰ型胶原;培养1、2和3周,ALP染色、钙结节染色检测成骨分化.结果:培养的hBMSCs阳性表达CD73,阴性表达CD34.第3代细胞增殖曲线呈"S"形,符合对数生长曲线.Cbfal转染hBMSCs表现出与成骨细胞相似的形态,成骨细胞标志基因ALP、OC 、OPN和Ⅰ型胶原的表达均明显上调,ALP染色阳性,并且有明显的钙结节形成.结论:非病毒载体携带Cbfal转染hBMSC,可诱导其向成骨细胞分化.
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分子嵌合MHC-Ⅰ基因对小鼠DC反应的研究
目的:构建分子嵌合主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ基因小鼠骨髓造血干细胞,并探讨其诱导脾脏T细胞对异基因小鼠树突状细胞(DC)反应的机制.方法:密度梯度法分离培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞.构建携带C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因慢病毒载体(病毒感染组),携带无意义基因慢病毒载体(阴性对照组).分别感染BALB/c 小鼠骨髓造血干细胞,构建分子嵌合细胞.分别取病毒感染组、阴性对照组及未加入病毒的空白对照组造血干细胞输注BALB/c小鼠后7d,获取脾脏T淋巴细胞,分别与C57BL/6小鼠DC进行混合淋巴细胞培养,测定刺激指数.结果:成功体外分选及培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞.病毒感染组C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ蛋白表达率可达98.17％.单向混合淋巴细胞培养结果显示,C57BL/6小鼠DC对输注病毒感染组细胞后BALB/c小鼠脾脏T细胞刺激指数明显降低(P＜0.01).结论:输注分子嵌合MHC-Ⅰ基因造血干细胞后,小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠DC反应明显减低.
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骨髓干细胞使坏死心肌再生
冠心病心肌缺血损伤后心肌细胞的丢失、瘢痕的形成和心室的重构是引起心功能日益恶化,终导致心力衰竭,乃至死亡的主要原因.要治疗大面积心肌损伤心脏需要外来的帮助--移植外源或自体细胞来代替受损心肌细胞.
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黄芪提取物对大鼠骨髓源性内皮祖细胞的作用
目的：探讨黄芪提取物对大鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）黏附、迁移、活力、血管形成能力及内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）表达的影响。方法体外培养、分离和鉴定EPCs，设10-4、10-3、10-2 g/L黄芪提取物组和对照组。倒置显微镜下观察并比较各组EPCs黏附、迁移、血管形成能力的差异；MTT法检测EPCs的活力变化；RT-PCR法检测EPCs中eNOS mRNA的表达；Western blot检测EPCs中eNOS蛋白的表达。结果与对照组相比，不同浓度黄芪提取物组促EPCs黏附、迁移、血管形成能力均显著增强，且呈浓度依赖性(F值分别为15.256、13.633、97.549，均P<0.05)；EPCs的活力显著增加，呈时间（F 时间=9.755）和浓度依赖性（F 组间=10.018）；且EPCs中eNOS mRNA和蛋白的表达水平均明显升高，呈浓度依赖性(F值分别为56.356、77.125，均P<0.05)。结论黄芪提取物具有调控EPCs促血管新生的作用，该作用可能与上调eNOS的表达水平密切相关。
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肝细胞移植与肝硬化的治疗
肝硬化是各种慢性肝病发展的晚期阶段.病理上以肝脏弥漫性纤维化、再生结节和假小叶形成为特征.肝硬化是常见病,世界范罔内的年发病率约为25～400万/10万,平均100万,出现并发症时病死率高.肝移植凶其能够从根本上改善肝功能、延长肝硬化患者的生存期.
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ST段抬高心肌梗死患者自体骨髓源干细胞输注——第一个双盲、随机、对照试验的启示
早在1968年造血干细胞便已用于治疗先天免疫缺陷儿童恢复造血和免疫功能,目前已广泛用于临床.2001年在Nature杂志上Orlic等报道,从小鼠动物实验发现,在心脏受损伤后自体骨髓干细胞可大量分化生长为心肌细胞. 这个惊人的发现促使人们迅速开展干细胞移植治疗人类心肌梗死和心力衰竭的基础研究和临床试验.自体骨髓源或循环祖细胞可能有助于左室功能的恢复,但其内在机制尚不清楚,且明显的心肌细胞转分化仅在实验条件下被证实过.
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促红细胞生成素对慢性肾衰竭贫血患者骨髓祖细胞的影响
目的 观察促红细胞生成素(EPO)对慢性肾衰竭(CRF)贫血骨髓祖细胞的影响,探讨CRF血液系统改变及EPO治疗机制.方法 对20例CRF贫血采用国产济脉欣(EPO)3000～6000 U,皮下注射,每周3次,于治疗前及连续治疗12周后在髂后上棘同一部位行骨髓穿刺抽取等量骨髓液,观察EPO治疗前后血常规和骨髓祖细胞变化情况.结果 治疗后血红蛋白、血细胞比容、白细胞及血小板升高,而血清肌酐下降,与治疗前比较差异有统计学意义(P<0.01).骨髓红系造血祖细胞(CFU-E)、粒-单系祖细胞(CFU-GM)、成纤维祖细胞(CFU-F)集落数较治疗前均明显增多,差异均有统计学意义(P<0.01).骨髓CFU-F集落产率与CFU-E和CFU-GM集落产率呈正相关(r=0.32,r=0.49,P＜0.05).结论 EPO治疗CRF贫血可使骨髓造血微环境恢复,保护造血干细胞,并恢复其自我复制、增殖与分化.
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Fractalkine/CX3CR1参与骨髓间充质干细胞向缺血脑组织定向迁移的实验研究
目的 观察fractalkine及其受体CX3CR1是否参与介导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向缺血脑组织的定向迁移.方法 密度梯度离心贴壁筛选法分离纯化BMSCs.利用RT-PCR和免疫组化方法检测BMSCs对CX3CR1的表达.建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型.使用Transwell小室建立体外趋化迁移模型,观察fractalkine和缺血脑组织萃取液是否诱导BMSCs定向迁移,以及阻断CX3CR1对BMSCs向缺血脑组织萃取液迁移的影响.结果 获得了纯化的BMSCs;BMSCs均一地表达CD44、CD90和CD71,在重组fractalkine浓度为200 ng/ml和500 ng/ml实现迁移的BMSCs与对照组相比有显著差异(P＜0.05);以CX3CR1抗体阻断BMSCs向缺血脑组织迁移组与正常对照组比较有显著差异(P＜0.05).结论 fractalkine及其特异性受体CX3CR1参与介导BMSCs向缺血脑组织的定向迁移.
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心肌梗死后的骨髓干细胞动员和心肌细胞凋亡
急性心肌梗死(AMI)后心室容积、形状、室壁厚度、心肌结构和超微结构等方面发生系列改变称为心室重塑[1].
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转化生长因子-β1基因修饰骨髓间充质干细胞复合壳聚糖修复兔关节软骨缺损
目的 利用壳聚糖负载转化生长因子-β1(TGF-β1)基因修饰后骨髓间充质干细胞(MSCs)构建新型组织工程软骨培养体系,观察该培养体系对体内软骨缺损修复能力.方法 将12只新西兰大白兔随机分为A、B、C三组,分别用壳聚糖、未转染MSCs+壳聚糖和TGF-β1基因修饰MSCs+壳聚糖修复全层关节软骨缺损,于术后6、12周用甲苯胺蓝染色、免疫组织化学法观察缺损区软骨基质和TGF-β1表达情况.结果 TGF-β1基因修饰MSCs组缺损修复时间明显缩短,并且新生的透明软骨组织均匀一致,与正常软骨结合良好,效果明显优于其他两组.结论 TGF-β1基因修饰MSCs复合壳聚糖是优秀的组织工程软骨培养体系,可用于全层关节软骨缺损的修复治疗.
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骨形态发生蛋白-2基因转染骨髓基质干细胞复合壳聚糖体外构建组织工程软骨的实验研究
目的 观察转人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因的骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨细胞方向分化的能力,并种植于壳聚糖体外构建组织工程软骨.方法 应用慢病毒介导把人BMP-2基因和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因转入大鼠BMSCs,通过荧光观察、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、免疫组织化学等方法 检测BMP-2、Ⅱ型胶原表达及软骨基质分泌情况;噻唑蓝(MTT)检测转基因后细胞的增殖活力.结果 BMP-2基因和eGFP基因成功转染BMSCs,Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达均显著增强,细胞种植壳聚糖支架后生长、粘附良好.结论 BMP-2可在BMSCs内表达,并诱导其向软骨方向分化;与壳聚糖复合培养可构建组织工程骨.
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VEGF基因修饰兔骨髓间充质干细胞的研究
背景:血管内皮生长因子的应用是组织工程组织血管化的有效手段.但是,血管内皮生长因子价格昂贵,并且半衰期非常短.很难在体内保持有效的作用浓度.故本实验将其转入组织工程的种子细胞--骨髓间充质干细胞中,使骨髓间充质干细胞能够有效地分泌血管内皮生长因子,从而达到促进血管生成的目的.目的:探讨应用人血管内皮生长因子165进行基因修饰的可行性,为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础.设计:观察对比实验.单位:吉林大学第一医院和吉林大学再生医学科学研究所.材料:实验于2003-06/2004-08在吉林大学再生医学科学研究所吉林大学重点实验室(生物安全实验室二级)完成.健康新西兰大耳白兔由吉林大学实验动物中心提供.4.0～5.0月龄,体质量215～315 kg,雌雄兼用,实验过程中对动物处置均在麻醉状态,无菌条件下完成,符合动物伦理学标准.实验药品及试剂:Ham F12培养基(GIBCO公司),噻唑蓝(MTT)(Sigma公司),pLXSN-KDRp-VEGF165与pcDNA3.0载体由本实验室自备,ELISA检测试剂盒(深圳晶美生物公司),感受态大肠杆菌DH5α、限制性内切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、HandⅢ、EcoR Ⅰ和标准DNA分子(Promega公司).方法:分离、培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞.构建并鉴定pcDNA3.0-VEGF165真核表达载体,利用脂质体介导其转染骨髓间充质干细胞.采用ELISA方法检测转基因骨髓间充质干细胞的人血管内皮生长因子蛋白表达,MTT法检测转基因骨髓间充质干细胞表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响,设单纯培养骨髓间充质干细胞及pcDNA3.0转染骨髓间充质干细胞组为对照组.主要观察指标:①重组质粒双酶切和基因测序分析.②ABC.ELISA法观察质粒转染后的骨髓间充质干细胞的人血管内皮细胞生长因子蛋白表达.③通过MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响.结果:①构建的质粒用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定结果与预期完全相同,PcR和酶切鉴定正确后行测序鉴定,测序结果正确,证明所构建的质粒为pcDNA3.0-VEGF165重组质粒.②ABC-ELISA法检测结果表明,人血管内皮生长因子165基因重组载体转染骨髓间充质干细胞后24 h,即有较高水平的人血管内皮生长因子165蛋白表达,48及72 h呈下降趋势,但与对照组比较,差异显著(P＜0.05).③MTT法检测人血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响,结果显示,含2%,4%,8%,16%和32%转染人血管内皮生长因子165基因的骨髓间充质干细胞培养上清促血管内皮细胞增殖率均高于对照组(P＜0.05).结论:人血管内皮生长因子165基因可成功地转染至骨髓间充质干细胞中,并可进行有效地表达.
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大鼠骨髓基质干细胞在成骨诱导剂条件下的成骨能力
目的:观察在有成骨诱导剂存在的条件下,大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力.方法:实验于2005-07/12在锦州医学院中心实验室完成.选取清洁级2月龄SD大鼠6只,无菌条件下取双侧股骨,制备单细胞悬液.采用贴壁培养与传代结合方法分离纯化大鼠骨髓基质干细胞,将2代细胞置于含有1×10-7 mol/L地塞米松、10 mol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸成骨诱导剂的培养基中,培养21～30 d.应用倒置显微镜观察骨髓基质干细胞与诱导后细胞形态,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并用碱性磷酸酶染色和VON-KOSSA法检测成骨能力.结果:6只大鼠均进入结果分析.①骨髓基质干细胞形态学观察结果:在成骨诱导剂里细胞增殖变缓慢,呈长梭形、成纤维细胞样或不规则形.②细胞生长曲线:1～2 d为潜伏期,细胞增殖不明显;3 d后细胞增殖明显加快,进入对数生长期;6 d后增殖变慢为平台期.经计算细胞群体倍增时间为38 h.③细胞增殖周期检测结果:G0/G1期为(82.12±4.60)%,S期为(14.35±2.32)%,G2/M期为(0.87±0.30)%.④成骨能力检测结果:细胞碱性磷酸酶染色阳性率为86%,VON-KOSSA染色提示有钙结节形成.结论:大鼠骨髓基质干细胞在有成骨诱导剂存在的情况下成骨能力较高.
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骨髓间充质干细胞定向移植局灶性脑缺血大鼠的行为学变化
背景:骨髓间充质干细胞移植已经应用到神经损伤修复领域,脑内立体定位移植和经血管移植均为其移植途径.目的:经立体定位将骨髓间充质干细胞注入大鼠脑梗死灶周边区,通过前肢不对称应用试验及姿势反射试验观察大鼠神经功能障碍的改善情况. 设计:随机对照动物实验.单位:吉林大学第一医院神经内科.材料:实验于2006-10/2007-04在吉林大学人兽共患病研究所,人兽共患病教育部重点实验室进行.健康雄性Wistar大鼠由吉林大学实验动物中心提供,体质量250～280 g,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.方法:采用密度梯度分离法、贴壁筛选法体外培养扩增健康成人志愿者骨髓间充质干细胞,采用流式细胞仪鉴定其免疫表型.将Wistar大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、模型+无血清DMEM组、模型+骨髓间充质干细胞组,每组10只.采用Longa等改良线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉闭塞脑缺血再灌注模型,正常对照组无任何处理,假手术组手术操作至暴露颈内外动脉后即缝合,其余处理同模型组.骨髓间充质干细胞立体定向移植:缺血90 min再灌注后1 h,采用立体定位仪取大鼠右侧大脑缺血周边区为移植点:前囟旁开3 mm、尾侧1 mm、深4 mm.缓慢注入5 μL经BrdU标记的骨髓间充质干细胞(4×1011 L-1)无血清培养基悬液于模型+骨髓间充质干细胞组大鼠,模型+无血清DMEM组大鼠注射5 μL无血清培养基,注射后留针5 min,缓慢退针,防止液体随针道返流.采用免疫组化技术检测骨髓间充质干细胞在大鼠体内存活情况,并于移植后1,3,7,28 d采用前肢不对称应用试验及姿势反射试验观察大鼠行为学变化.主要观察指标:①以流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞免疫表型.②移植大鼠脑内骨髓间充质干细胞的存活情况.③大鼠行为学变化.结果:50只大鼠全部进入结果分析.①实验获得了高纯度的骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测显示,CD44、CD29均呈阳性,CD34、CD45、CD31均呈阴性.②模型+骨髓间充质干细胞组移植的骨髓间充质干细胞在脑缺血周边区聚集并存活.③模型+骨髓间充质干细胞组大鼠行为学评分较其他各组降低明显 (P < 0.05),并随着细胞移植后时间延长逐渐降低,并且移植后7 d行为学评分低于同组内其他时间点(P < 0.01).结论:除正常对照组外,其他组大鼠神经功能均有所恢复,但各组恢复情况明显不同,脑梗死周边区域注射骨髓间充质干细胞组大鼠功能恢复明显好于各对照组.
