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自体外周血造血干细胞移植后造血重建中CD226分子在NK细胞上表达的变化
本文应用双重免疫荧光染色和流式细胞术分析,观察自体外周血造血干细胞移植患者造血重建中,CD226分子在CD56bright和CD56dimNK细胞亚群表达的变化.结果显示,在自体外周血造血干细胞移植造血重建中,于干细胞回输第12天,CD56+NK细胞占外周血淋巴细胞百分率为26.6%,其中CD56bright亚群,占CD56+NK细胞87.3%;CD56+CD226+细胞占CD56+NK细胞92.1%,CD56brightCD226+细胞占CD56+CD226+细胞89.9%.在自体外周血造血干细胞移植造血重建中,CD56bright亚群是NK细胞造血重建早出现并占优势的一个亚群, CD226分子可能作为一种分化标记主要表达在CD56bright亚群上.
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人CD226 (PTA1)分子胞膜外区截短体真核表达载体的构建、表达及其识别结构域的分析
目的确定一套CD226单克隆抗体(McAb)识别CD226分子胞膜外区结构域的部位. 方法应用计算机软件分析CD226分子蛋白质序列疏水性,确定其亲水性区域.采用PCR方法扩增CD226分子基因序列,分别缺失相应亲水性区域,构建CD226截短体重组真核细胞表达载体pcDNA3-PTA1T1和pcDNA3-PTA1T2.测序正确后,转染COS7细胞,抗CD226分子多克隆抗体间接免疫荧光染色,流式细胞术检测CD226分子截短体的表达.表达成功后,采用间接免疫荧光染色和流式细胞术分析,用一套CD226 McAb检测与截短突变体的免疫反应性,从而确定CD226 McAb识别CD226分子结构域的部位. 结果 PCR扩增出CD226分子相应目的片段序列,定向克隆入pcDNA3真核表达载体,DNA序列测定正确.转染COS7细胞后,流式细胞术检测CD226截短体分子有较高水平的表达.CD226 McAb Leo A1、New E1和FMU1～7均可识别CD226全长分子;Leo A1、New E1、FMU1、FMU2、FMU4和FMU5与截短突变体PTA1T1和PTA1T2均无反应性;FMU3可结合PTA1T1分子,不结合PTA1T2分子;FMU6和FMU7均可结合PTA1T1及PTA1T2分子. 结论 CD226 McAb Leo A1、New E1、FMU1、FMU2、FMU3、FMU4和FMU5识别CD226分子胞膜外区D1结构域,其中FMU3识别的位点位于V1和V2环之间;FMU6和FMU7识别D2结构域.
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Ag85 A-CD226 DNA 疫苗的制备及对小鼠免疫功能的影响
目的：构建pcDNA3．1-Ag85A-CD226真核表达质粒，制备Ag85A-CD226 DNA疫苗，经灌胃接种并观察该疫苗对小鼠免疫功能的影响。方法采用PCR方法从CD226-PCR2．1-ToPo质粒扩增CD226基因，与pcDNA3．1-Ag85A质粒连接，构建pcDNA3．1-Ag85A-CD226真核表达质粒，经脂质体转染法瞬时转染HEK293细胞株，采用RT-PCR、Western blot、免疫荧光方法检测Ag85A-CD226基因在该细胞内的表达。进一步提取纯化pcDNA3．1-Ag85 A-CD226重组质粒，用脂质体包裹制成Ag85 A-CD226 DNA疫苗。经灌胃Ag85 A-CD226 DNA疫苗接种于小鼠，乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞杀伤活性，ELISA法检测脾细胞培养上清细胞因子分泌水平，real-time PCR法检测肠黏膜组织内细胞因子表达水平。结果成功构建真核细胞内表达pcDNA3．1-Ag85A-CD226重组质粒，并且转染HEK293细胞株检测到Ag85 A-CD226融合蛋白分子的表达。接种Ag85 A-CD226 DNA疫苗的小鼠较对照组小鼠NK细胞杀伤活性显著升高（ P＜0．01）；脾细胞培养上清中TNF-α、IFN-γ和IL-2的分泌水平显著增高（P＜0．01），而IL-4分泌水平显著降低（P＜0．01）；肠黏膜组织内TNF-α、IFN-γ和IL-2的表达水平显著升高（P＜0．01），而IL-4表达水平未见有统计学差异（P＞0．05）。结论 Ag85A-CD226 DNA疫苗经灌胃接种可诱导小鼠全身和肠道局部Th1型免疫应答增强，其效果强于单独应用Ag85 A或CD226 DNA疫苗。
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CD40和CD226基因多态性与类风湿性关节炎易感性的Meta分析
目的 探讨CD40 rs4810485 G/T多态和CD226 rs763361 C/T (Gly307Ser)多态与类风湿性关节炎(RA)发病风险的关系.方法 使用PubMed/MEDLINE和Embase数据库检索2013年5月以前所有相关文献.两名研究者分别独立检索文献、提取有效数据并交叉核对.采用固定或随机效应模型计算优势比(OR)和95%置信区间(CI)对CD40 rs4810485多态和CD226 rs76336多态与RA易感性的关系进行总体评估.采用漏斗图和Egger检验评价发表偏倚.所有分析均使用Stata 10.1统计学软件进行处理.结果共有8项独立的研究(包含11520例RA病例和10843名对照者)被纳入当前的Meta分析.与携带CD40 GG基因型的人相比,携带TT基因型可以显著降低RA的发病风险(OR=0.83,95%CI=0.74-0.94,P<0.01).与携带CD226 CC基因型的个体相比,携带TT基因型的个体患RA的风险增加46% (OR=1.46,95%CI=1.20-1.77,P<0.01).当前的Meta分析的数据不存在发表偏倚.结论 CD40 rs4810485和CD226 rs763361多态与RA发病风险显著相关.
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系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞CD226基因表达的研究
目的 研究CD226基因在系统性红斑狼疮(SLE)患者与健康人外周血单个核细胞(PBMCs)的表达及其与CD226-Gly307Ser多态性、疾病活动度的相关性.方法 应用实时荧光定量聚合酶链反应检测SLE患者组90例及健康对照组30名PBMCs CD226 mRNA表达水平,同时应用单因素方差分析CD226基因表达量在3种基因之间是否存在差异,并且探讨其与临床指标的相关性以及CD226-Gly307Ser多态性的3种基因型进行Pearson相关性分析.结果 SLE组与健康对照组相比,CD226基因表达水平明显降低(P＜0.01);SLE组3种基因型之间的CD226 mRNA表达量差异无统计学意义(6.8±1.1与26.5±6.7,P＞0.05);红细胞沉降率、尿蛋白定量(24 h)、抗核抗体滴度、SLE疾病活动指数(SLEDAI)及血清补体C3水平与CD226基因表达均没有相关性.结论 在中国湖北汉族人群中,CD226-Gly307Ser多态性与SLE发病相关;T危险等位基因未影响CD226的mRNA表达水平,CD226分子在自身免疫性疾病中作用需进一步探讨.
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CD226(PTA1)单抗诱导NK细胞克隆杀伤靶细胞的研究
目的:研究CD226分子在NK细胞克隆上的表达及功能.方法:用有限稀释法建立NK细胞克隆并鉴定.采用重导向杀伤实验(redirected cytotoxicity assay, RCA)观察CD226单克隆抗体对NK细胞克隆杀伤作用的影响,并用ELISA方法检测杀伤相培养上清中细胞因子水平的动态变化.结果:获得1株NK细胞克隆.在重导向杀伤实验中,CD226单克隆抗体能明显提高NK细胞克隆的杀伤水平;促进NK细胞克隆IFN-γ和GM-CSF的分泌.结论: CD226是一种新的NK细胞活化性受体,IFN-γ和GM-CSF水平升高可能与NK细胞克隆功能有关.
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CD226在NK细胞亚群上表达规律与功能关系的研究
目的:观察CD226分子在NK细胞亚群上的分布和其他NK细胞活化性受体和抑制性受体的共存规律,及与NK细胞功能的关系.方法:分别以IL-2或IL-15刺激PBMC和MLC细胞为模型,采用双重免疫荧光染色和流式细胞术分析,观察CD226分子在CD56bright和CD56dimNK细胞亚群上的表达,及与NK细胞活化性受体CD16和抑制性受体NKG2A的共存关系,同时用ELISA方法检测培养上清中IFN-γ的水平.用4小时51Cr释放试实验检测NK细胞杀伤水平.结果:在PBMC中,CD226主要分布于CD56dim亚群,在IL-2作用下,CD226主要分布于CD56bright亚群,而在IL-15作用下,NKG2A+CD226+双阳性细胞明显增加.在MLC活化的NK细胞中,CD226主要分布于CD56dim亚群,在IL-15作用下,CD226主要分布于CD56bright亚群,IL-2和IL-15都能促进CD16+CD226+和NKG2A+CD226+双阳性细胞的增殖.IL-2和IL-15能明显提高PBMC培养上清中IFN-γ的水平,并能促进PBMC和MLC中NK细胞的杀伤活性.结论:CD226主要分布于活化NK细胞CD56bright亚群上,其表达水平及与CD16及NKG2A共存关系可能受不同细胞因子调节并与NK细胞功能相关.
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CD226基因5'上游调控序列研究
目的:研究CD226基因5′上游调控序列对CD226基因表达调控的影响.方法:通过基因克隆的方法将CD226基因5′上游调控序列,克隆到荧光素酶报告基因载体中(pGL3-basic),用脂质体转染Jurkat细胞,48小时后检测荧光素酶活性.结果:CD226基因存在两个启动子P1和P2,分别位于与-843～-319 bp和+1～+181 bp,PMA可以上调P1的启动子活性,对P2有一定的抑制作用;A23187均可以上调两个启动子的活性,但对P2的作用更为明显.结论:CD226基因存在两个启动子,其活性受到PMA和A23187的调控,并呈与蛋白水平表达调控相类似的模式.
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妊娠高血压综合征患者血清对内皮细胞 CD226分子表达和PDGF黏附分子的研究
目的探讨妊娠高血压综合征(PIH)患者血清对体外培养的内皮细胞表达CD226的影响,和CD226分子与PDGF表达的相关性.方法用间接免疫荧光染色结合流式细胞术分析观察妊高征患者血清对于体外培养人血管内皮细胞表达CD226的作用以及该血管内皮细胞和活化血小板黏附后CD226表达百分率的变化,用ELISA定量检测不同条件下活化血管内皮细胞分泌的PDGF,进一步探讨CD226分子和PDGF在妊高征血管内皮损伤中的作用.结果①妊高征患者血清刺激血管内皮细胞表达CD226百分率明显高于对照组(P＜0.001).②活化血管内皮细胞和活化血小板孵育后,血管内皮细胞表达CD226百分率明显降低(P＜0.05).③妊高征患者血清刺激血管内皮细胞分泌PDGF的量明显高于对照组并呈时间依赖性(P＜0.001),与活化血小板作用后,分泌PDGF的量更进一步升高(P＜0.005).结论①患者体内存在某种非正常刺激因素,使血管内皮细胞敏感性增强,更易于活化.②PIH患者血清活化的血管内皮细胞与活化血小板孵育后表达CD226的百分率明显降低,提示CD226分子直接或间接参与了妊高征血管内皮细胞和血小板的黏附.③CD226与PDGF的表达有时段相关性.活化血管内皮细胞分泌PDGF增多,并与CD226表达的时间基本一致,提示其可能与CD226一起参与了妊高征形成的相关病理生理机制.
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口服CD226 DNA疫苗对小鼠免疫功能的影响
目的 制备口服CD226 DNA疫苗,观察该疫苗对小鼠免疫功能的影响.方法 以质粒CD226-PCR2.1-ToPo为模板,PCR扩增CD226基因,克隆至pcDNA3.1载体,构建真核表达质粒pcDNA3.1-CD226,利用脂质体LipofectamineTM 2000瞬时转染CT-26细胞株,采用RT-PCR法、Western blot法、流式细胞术检测CD226基因在CT-26细胞中的表达.将质粒pcDNA3.1-CD226用脂质体LipofectamineTM2000包裹制成CD226 DNA疫苗(100 μg质粒/100μl脂质体),经灌胃免疫C57BL/6小鼠,实验分CD226疫苗组、pcDNA3.1组和生理盐水组,流式细胞术检测CD226在小鼠脾细胞中的表达;还原酶法检测NO分泌水平;乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞杀伤活性;ELISA法检测脾细胞培养上清中细胞因子(IL-2、IL-4、IFNγ和TNF-α)分泌水平;Real-time PCR法检测肠黏膜组织内细胞因子表达水平.结果 质粒pcDNA3.1-CD226经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;质粒pcDNA3.1-CD226转染CT-26细胞的转染率为32.14％,转染的CT-26细胞检测到CD226蛋白表达.CD226疫苗组CD226 CD4+T细胞的绝对数、NK细胞杀伤活性、NO分泌水平、脾细胞培养上清中TNF-α、IFNγ和IL-2分泌水平、肠黏膜组织内TNF-α和IFNγ基因mRNA水平均明显高于pcDNA3.1组和生理盐水组(P＜0.05);而CD226疫苗组脾细胞培养上清中IL-4分泌水平及肠黏膜组织内IL-2和IL-4基因mRNA水平,与pcDNA3.1组和生理盐水组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 CD226DNA疫苗经灌胃免疫,可诱导小鼠全身Th1型免疫应答增强和肠道局部部分Th1型免疫应答增强.
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CD226与肿瘤关系的研究进展
CD226是NK细胞主要的活化性受体之一，与多种疾病的致病机制相关，在肿瘤免疫监视乃至肿瘤细胞清除等方面发挥重要作用[1]。在新研究中，CD226与黑色素瘤、神经母细胞瘤、白血病等疾病的发病机制有极大关联。 CD226的功能在一些因素的作用下受到抑制，可能导致NK细胞失活，从而加速肿瘤的发生、发展及转移。本文主要综述CD226杀伤肿瘤的研究进展。
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慢性丙型肝炎患者病毒载量与滤泡辅助性T淋巴细胞表面CD226表达的关系
目的 探讨慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC)患者病毒载量与滤泡辅助性T淋巴细胞(T follicular helper cells,Tfh)表面CD226表达的关系.方法 无锡市第五人民医院2015年3月至2017年4月就诊的CHC患者135例,另取30名健康献血员作为健康对照组.根据HCV RNA水平分为低病毒载量组49例(36.3％)和高病毒载量组86例(63.7％),比较两组患者的外周血Tfh表面CD226表达 、Tfh、IL-21和HCV特异性CTL水平.计数资料比较采用 χ2检验,计量资料比较采用t检验,不同因素相关性分析采用Pearson方法.结果 135例CHC患者的外周血Tfh表面CD226表达水平为(77.69±5.42)％,低于健康对照组的(90.06±5.83)％,两组比较差异有统计学意义(t=7.541,P<0.01);低病毒载量组的外周血Tfh表面CD226表达水平为(88.75±6.68)％,高于高病毒载量组的(69.23±5.86)％,两组比较差异有统计学意义(t=19.232,P<0.01).病毒载量与Tfh表面CD226表达水平呈负相关(r=-0.705,P<0.01).135例CHC患者的外周血Tfh水平高于健康对照组,两组比较差异有统计学意义(t=13.878,P<0.01);低病毒载量组外周血Tfh水平高于高病毒载量组,两组比较差异有统计学意义(t=26.993,P<0.01).135例CHC患者的IL-21水平低于健康对照组的(70.35±1.6)ng/L,两组比较差异有统计学意义(t=18.322,P<0.01);低病毒载量组的外周血IL-21水平高于高病毒载量组,两组比较差异有统计学意义(t=84.54,P<0.01).低病毒载量组外周血HCV特异性CTL水平高于高病毒载量组,两组比较差异有统计学意义,(t=29.869,P<0.01).病毒载量与HCV特异性CTL水平呈负相关(r=-0.734,P<0.01).结论 CHC患者中,不同病毒载量导致Tfh表面CD226表达水平不同;低病毒载量者可引起Tfh表面CD226表达水平升高,从而进一步导致Tfh、IL-21及HCV特异性CTL的表达水平升高.
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CD226单克隆抗体诱导人脐静脉内皮细胞胞质钙离子浓度的变化
为观察CD226单克隆抗体(mAb)对培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)胞质钙离子变化的影响, 我们用Fluo-3作为钙指示剂, 用激光共聚焦显微镜观测不同状态下CD226 mAb作用后HUVECs胞质钙离子[Ca2+]i的变化.结果发现: (1)用Hanks液平衡, CD226 mAb作用后HUVECs [Ca2+]i 水平缓慢升高后回到原位; 加入二抗(羊抗鼠IgG)交联后 [Ca2+]i 水平有较大幅度的升高, 随后回到原位, 与此同时, 细胞外液中[Ca2+]o 水平有一定程度的下降; (2)用D-Hanks液平衡, CD226 mAb作用后HUVECs [Ca2+]i 水平无显著变化, 加入二抗发生交联作用后, [Ca2+]i 水平有较大幅度的下降; (3)用EGTA预处理后, CD226 mAb及其二抗交联对HUVECs [Ca2+]i变化无显著影响.以上结果提示, CD226 mAb及其二抗交联可诱导不同状态的HUVECs胞质钙离子水平发生不同程度的变化, 从而参与一系列的生理和病理过程.
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银屑病患者血清中可溶性血小板T细胞活化抗原1的检测
目的检测银屑病患者血清中可溶性血小板T细胞活化抗原1(sCD226/PTA1)的水平,初步探讨该抗原与银屑病的关系.方法银屑病患者包括疗前30例,其中活动期17例、静止期13例,疗后10例,正常人对照15例.应用双抗体夹心ELISA法测定血清中sCD226/PTA1的浓度.结果银屑病组血清中sCD226/PTA1水平(823.88±569.93pg/mL)显著高于正常人(120.45±58.41 pg/mL),t=4.41,P＜0.001.活动期(1036.07±598.97pg/mL)更高,依次高于静止期(546.39±399.28 pg/mL)和正常人.疗后组(263.16±207.3pg/mL)显著低于相应的疗前组(751.51±648.07 pg/mL),t=3.42,P＜0.005.与正常人比较,疗后组值仍偏高,但差异无显著性,t=2.02,P＞0.05.结论银屑病患者血清中存在高水平的sCD226/PTA1,并在活动期、静止期及疗后呈现出不同的变化.提示CD226/PTA1可能参与银屑病的病理过程.
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人pSecTag2B-CD226真核表达载体的构建、表达及初步鉴定
目的:构建含有6His标签的可溶性人CD226分子的真核表达载体pSecTag2B-CD226,并进行表达和初步鉴定.方法:PCR扩增CD226细胞膜外区,插入真核表达载体pSecTag2B,构建真核表达载体pSecTag2B-CD226.酶切和测序法鉴定后,转染COS-7细胞进行表达,培养上清液经抗CD226抗体免疫亲和层析柱纯化后用酶标记免疫吸附分析法(ELISA)进行初步鉴定.结果:经表达和纯化获得了含有CD226细胞膜外区的CD226-6His融合蛋白.结论:成功构建了可分泌人CD226蛋白的真核表达载体pSecTag2B-CD226,本实验结果将为进一步的功能学研究奠定基础.
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CD226与临床相关疾病
1985年Burns等[1]以活以的T细胞为免疫原制备了抗活化T细胞表面抗原的单克隆抗体,并将其中一株单抗Leo-A1识别的抗原命名为T细胞系特异性水活化抗原1(TLiSA1),实验证实其参与了CTL的活化和分化.
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CD226、TIGIT在类风湿关节炎患者T细胞亚群的表达及其与病情活动性关系的研究
目的 研究CD226、TIGIT在类风湿关节炎(RA)患者外周血T淋巴细胞亚群上的表达及其与DAS28评分的相关性,以探讨其在RA发病机制中的作用.方法 选取RA患者40例:其中包括活动期RA患者23例,非活动期RA患者17例.同时选取健康志愿者20例作为正常对照组.提取外周血单个核细胞,多色荧光标记的单克隆抗体染色,流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群上CD226、TIGIT的表达率.结果 RA组患者T淋巴细胞上CD226和TIGIT分子的表达水平与正常对照组相比差异均具有统计学意义(均P＜0.05),尤其是活动期RA组患者CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞上CD226的表达水平显著高于正常对照组(P＜0.05),差异具有统计学意义;而活动期RA组患者T淋巴细胞上TIGIT的表达水平显著低于正常对照组(P＜0.05),差异具有统计学意义.活动期RA组患者T淋巴细胞上CD226和TIGIT分子的表达水平与非活动期RA组相比差异均具有统计学意义(均P＜0.05).RA组患者T淋巴细胞上CD226的表达水平与DAS28评分值呈正相关.而RA组患者T淋巴细胞上TIGIT分子的表达水平与DAS28评分值呈负相关.结论 RA患者T淋巴细胞亚群上CD226和TIGIT分子表达异常,且与RA的病情活动有关,提示共刺激分子CD226和TIGIT在RA发病机制中有一定的作用.
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人CD226分子胞膜外区D1和D2真核表达载体的构建、表达和鉴定
目的 构建含有人CD226分子胞膜外区结构域1(D1)和结构域2(D2)的真核表达载体,表达并纯化重组蛋白.方法用特异性引物分别扩增CD226 D1和D2的基因,定向插入真核表达载体pSecTag2B-Fc,进行酶切和DNA测序鉴定,重组质粒瞬时转染293T细胞,收集上清,纯化蛋白及SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果利用PCR方法克隆出CD226胞膜外区D1和D2的基因,并正确插入pSecTag2B-Fc载体中,真核表达载体瞬时转染293T细胞,Western blot结果证实转染293T细胞的培养上清液中含有hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc融合蛋白,培养上清经亲和层析柱纯化,可获得较高纯度的重组蛋白.结论 成功的构建了分泌型融合蛋白hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc真核表达载体,获得纯度较高的融合蛋白,为进一步探讨其配受体的相互作用机制奠定了基础.
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CD226在系统性红斑狼疮患者T淋巴细胞亚群上的表达
目的研究CD226在SLE患者外周血T淋巴细胞亚群上的表达,以阐明CD226抗原在SLE患者体内T细胞活化中作用以及与SLE发病的关系.方法 31例SLE患者和30例健康志愿者外周血单个核细胞,在体外培养72 h后,三色荧光标记的单克隆抗体染色 ,利用流式细胞仪测定T细胞亚群细胞表面CD226抗原的表达.结果 SLE患者组CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞上CD226+表达均高于正常对照组(P<0.01);活动期SLE组、静止期SLE组的CD3+、CD4+、CD8+细胞上CD226+表达均显著高于对照组(P<0.01),而活动期与静止期患者之间T细胞亚群上CD226+表达则无显著性差异(P＞0.05).SLE患者CD3+、CD4+、CD8+T细胞CD226+抗原表达水平与SLEDAI之间无明显相关性(P＞0.05).结论 SLE患者体内存在T细胞亚群异常活化;活动期、静止期SLET淋巴细胞CD226+表达均增高,CD226+可能参与了SLE的免疫发病.
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再生障碍性贫血TIGIT,CD96,CD226表达及与中医证型关系
目的 研究TIGIT,CD226,CD96在再生障碍性贫血(AA)外周血的表达率,以及与中医分型的关系.方法 收集再生障碍性贫血患者共60例,以及正常组20例,再障组根据中医诊断标准分为脾肾阴虚组及脾肾阳虚组,流式法检测不同分组外周血淋巴细胞TIGIT,CD226,CD96表达的水平比较.结果 再障组患者的TIGIT水平较正常组降低,CD226,CD96表达水平高于正常组;再障组中脾肾阴虚型CD226及CD96表达水平较脾肾阳虚型升高;病程小于1年的患者TIGIT低于病程较长的再障患者.结果有统计学差异(P<0.05).结论 TIGIT,CD226,CD96表达在再障的发病过程有一定作用,在中医分型物质基础上有一定差异,与病程长短有一定相关性.
