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白细胞介素-4生物学功能及其临床应用
白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)是20世纪80年代初发现的, 具有多种生物功能的一种细胞因子.IL-4又名B细胞生长因子(B cell growth factor, BCGF), B细胞分化因子r(B cell differentiating factor r, BCDF), B细胞刺激因子-1(B cell stimulating factor-1, BSF-1), T细胞生长因子-Ⅱ(T cell growth factor Ⅱ, TCGF-Ⅱ)和肥大细胞生长因子-Ⅱ(mast cell growth factor Ⅱ, MCGF-Ⅱ).1986年其基因克隆成功, 国际统一命名为IL-4.
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人肺癌相关抗原基因ALT04ag的分子克隆及其转化活性的初步研究
本文旨在克隆人肺癌相关抗原基因ALT04ag cDNA全长序列并对其生物信息学特性及转化活性进行初步探讨.采用5RACE实验程序克隆靶基因全长cDNA,借助生物信息学分析方法对其序列进行初步分析,以细胞生长曲线、FCM分析及RT-PCR技术分别观察重组ALT04ag表达质粒转染细胞的生长特性及相关基因的表达.结果表明ALT04ag cDNA序列全长1115bp,含有编码194个氨基酸的开放阅读框架,计算预测其分子量为21KD,等电点为5.51.该序列登录Genbank(AF026816)时未发现同源序列(2001-1-30).该基因转染的细胞有ALT04ag基因表达, ALT04ag基因表达可上调c-myc基因表达及加速细胞增殖速率,但对bcl-2及p53基因表达无影响,提示ALT04ag基因表达可能是细胞癌变的重要因素之一.本研究为探索人肺癌诊断及治疗的分子靶标提供了新的线索.
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HPV58 E6体外降解p53蛋白作用的研究
通过PCR方法从人乳头瘤病毒58型(HPV58)全基因克隆中扩增出HPV58E6基因片段,克隆至真核表达质粒pcDNA3的T7启动子下游,并在体外转录成mRNA后,在源自网织红细胞的翻译缓冲液中成功表达了含有生物素标记的HPV58E6蛋白,并在体外成功发现HPV58E6能够降解p53蛋白,从而推断结合并降解p53蛋白是其致癌作用的关键环节,这为日后在细胞内对其致癌机理行进一步研究以及针对其进行治疗奠定下坚实的基础.
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大鼠睾丸精子发生中差异表达基因RSD5的克隆与表达分析
为了分离、克隆精子发生相关基因，深入了解精子发生的分子机理，本文以大鼠睾丸曲细精管显微分离结合DDRT-PCR的方法，所得的不同区段中差异表达的EST(expressed sequence tag)筛选大鼠睾丸cDNA文库，获得一个新的cDNA序列-RSD5。RSD5 cDNA全长1556bp,编码176个氨基酸，GenBank接收号为AF146738。RSD5基因编码蛋白序列含有一个PEST基序，这是蛋白质快速降解的标志。Northern blot 分析结果显示，RSD5在睾丸组织和脑组织表达量较高，且在不同发育天龄的睾丸组织中具有显著的表达差异性。RSD5基因的表达特征及其编码蛋白的PEST基序提示RSD5蛋白可能在精子发生中具有重要作用。
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睫状神经营养因子的cDNA克隆、表达、纯化及其生物活性鉴定
反转录PCR扩增人睫状神经营养因子(human ciliary neurotrophic factor,hCNTF)cDNA后,克隆进pBV220,在大肠杆菌中实现原核高效表达,SDS-PAGE观察到分子量约为24kD的预期表达产物,薄层扫描确定其表达量为26%,制备电泳和凝胶过滤纯化后纯度达到98%,生物活性分析表明,表达产物能刺激10日龄鸡胚背根神经节细胞的生长,促进CFU-GM的增殖.
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人神经营养因子3基因的分子克隆、表达及其产物的生物活性鉴定
以正常中国人血淋巴细胞染色体DNA为模板，PCR扩增出神经营养因子3(NT3)编码基因。将所得基因片段重组于M13噬菌体载体，筛选得到含中国人NT3基因的克隆。采用单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列，该序列与国外文献所报道的完全一致。将NT3编码基因亚克隆于杆状病毒表达载体，以在大肠杆菌内转座后的重组Bacmid大分子DNA转染悬浮培养的昆虫细胞后，在培养上清中检测到大量成熟型的NT3，后者对人神经母细胞瘤SH-SY5Y-T3具有较强的促进神经突起生长的作用，其生物学效应可被抗人NT3多克隆抗体所阻断。
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人血管内皮生长因子基因的克隆、表达及生物活性分析
目的克隆人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因,构建真核表达载体,观察其对脐静脉内皮细胞的增殖作用和血管新生的影响. 方法利用RT-PCR方法,从人扁桃体组织中扩增人VEGF165cDNA完整编码区,并构建成pcDNA3.1(+)/VEGF165(简称pcDNA/V)重组体;应用脂质体介导的基因转移技术将构建的真核表达载体pcDNA/V体外转染至人脐静脉内皮细胞(HUVEC),MTT法检测其对内皮细胞增殖的影响.建立家兔下肢缺血模型,注射重组质粒pcDNA/V,pcDNA3.1(+)空质粒作对照,选取不同时间点,行血管造影. 结果构建的真核表达载体pcDNA/V的酶切电泳分析和测序表明结果正确.pcDNA/V转染HUVEC能明显促进内皮细胞的分裂增殖.血管造影显示,术后基因治疗组远端动脉充盈早于对照组,新生血管数目也明显多于同时期对照组. 结论成功克隆了人VEGF165基因,构建了其真核表达载体.体内外生物学活性研究证实,重组质粒的表达产物具有刺激HUVEC增殖和促进缺血肢体侧枝循环建立的功能.
关键词： 血管内皮细胞生长因子 基因克隆 基因表达 -
含人过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因高效真核表达载体的构建及其意义
目的 构建高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体δ(hPPARδ)的真核表达载体,为hPPARδ受体功能和基于hPPARδ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台.方法 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),从HepG2细胞总RNA克隆hPPARδ全长基因,与经BamHI、SalI相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建重组质粒phPPARδ-IRES2-EGFP,经酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARδ基因的完整性和忠实性;荧光显微镜观察重组质粒转染的293细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞hPPARδ的表达进行荧光定量PCR和免疫细胞化学检测.结果 经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPAR6的高效表达.结论 成功构建phPPARδ-IRES2-EGFP重组质粒.
关键词： 过氧化物酶体增殖物激活受体δ 基因克隆 真核表达 逆转录-聚合酶链反应 -
rAAV2-hGAD65重组载体的构建和功能检测
目的 构建rAAV2-hGAD65重组载体,观察其体内外功能.方法 应用RT-PCR的方法克隆hGAD65基因,与AAV载体连接得到重组载体(rAAV2-hGAD65).包装重组腺相关病毒并检测病毒的滴度.体外感染成纤维细胞后,用免疫组织化学的方法检测GAD65在细胞中的表达水平,用高效液相色谱(HPLC)法检测培养上清中γ-氨基丁酸(GABA)的含量.在体实验中,向丘脑底核(STN)立体定位注射rAAV2-hGAD65后,用HPLC方法检测黑质网状部(SNr)中的GABA含量.结果 应用RT-PCR方法成功地从人胚胎端脑组织中克隆出GAD65基因的cDNA,基因测序显示与基因库中人GAD65基因序列一致,亚克隆入AAV载体并包装后所得的病毒颗粒的滴度达到4.5×10~(11)/ml.组织化学检测感染大鼠肺成纤维细胞的效率约为80%,HPLC检测培养上清中GABA的含量为(45.66±6.07)nmol/L.STN立体注射rAAV2-hGAD65后,在STN可以检测到hGAD65的表达,SNr区GABA的含量由原来的(5.66±1.07)nmol/g升高到(12.66±2.59)nmol/g.结论 成功地克隆出了人GAD65基因,并构建了AAV重组载体.AAV病毒颗粒在体外能感染成纤维细胞并具有催化谷氨酸合成GABA的功能.在体内实验中,向STN注射rAAV2-hGAD65后,可以增加黑质网状部(SNr)中的GABA含量.
关键词： 谷氨酸脱羧酶2 腺相关病毒载体 基因克隆 反转录-聚合酶链式反应 人 -
人神经营养素-3基因重组腺病毒载体的构建、表达和生物活性检测
目的构建具有生物活性的人神经营养素-3(NT-3)基因重组腺病毒表达载体.方法从人脑组织mRNA中扩增NT-3基因全长cDNA,定向克隆于穿梭质粒pShuttle中,获得一个带有CMV启动子的质粒.再与腺病毒骨架DNA(Adeno-X viral DNA)体外连接,形成重组腺病毒质粒(pAd-NT-3).用pAd-NT-3转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Adeno-NT-3). 结果NT-3基因RT-PCR扩增产物约801 bp.Adeno-NT-3 PCR鉴定为正确重组子.RT-PCR、免疫细胞化学、ELISA及Western blot检测显示,Adeno-NT-3能在其转染的293细胞表达和分泌NT-3.这种NT-3能使体外培养的神经干细胞更多地分化为神经元样细胞. 结论应用体外连接法成功构建了人NT-3基因重组腺病毒表达载体,其表达产物具有促进神经干细胞分化为神经元样细胞的活性作用.
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日本沼虾血蓝蛋白基因cDNA全长克隆及表达分析
目的 克隆日本沼虾血蓝蛋白基因,进行生物信息学及时空表达分析. 方法 利用cDNA末端快速扩增技术( RACE)从肝胰腺中克隆血蓝蛋白基因cDNA全长序列,用生物学软件对其序列进行生物信息学分析,时空表达分析采用实时荧光定量PCR方法. 结果 日本沼虾血蓝蛋白基因cDNA全长2 151 bp,包含14 bp的5'UTR、148 bp的3'UTR和189 bp的开放阅读框(ORF).ORF编码663个氨基酸,预测分子量为76.65kD,理论等电点为5.42,含有典型的3个血蓝蛋白结构域和2个保守的铜离子结合位点.与淡水螯虾、凡纳滨对虾血蓝蛋白相似性分别为70％和63％.该基因在肝胰腺中的相对表达量高,肌肉和血细胞表达较弱,大颚器官、表皮和卵巢几乎不表达:肝胰腺血蓝蛋白基因的表达量在蜕皮间期高,蜕皮后期和蜕皮前期较低；嗜水气单胞菌刺激后肝胰腺中的表达量显著增加. 结论 与其他甲壳动物相似,日本沼虾血蓝蛋白基因具有典型的结构域和保守的铜离子结合位点,在蜕皮间期的肝胰腺中呈高表达,是参与机体免疫防御反应的一种重要分子.
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Tet-on慢病毒调控系统的构建及其调控作用
目的 构建四环素诱导基因表达的3代慢病毒系统,为慢病毒介导的基因治疗提供实验依据.方法 将四环素调控的转录激活因子(rtTA和M2rtTA)分别克隆入带有新霉素(neo)筛选标记的慢病毒载体中,得到pELNS-rtTA-IRES-Neo和pELNS-M2rtTA-IRES-Neo质粒,将四环素顺式应答作用元件(TETO和TREpitt)和绿色荧光蛋白(GFP)克隆入带有杀稻瘟素(blasticidin)筛选标记的慢病毒载体中,得到plenti6-TETO-GFP和plenti6-TREpitt-GFP质粒,将pELNS-rtTA-IRES-Neo与plenti6-TETO-GFP和pELNS-M2rtTA-IRES-Neo与plenti6-TREpitt-GFP分别以10∶1共同转染293细胞,用四环素类似物强力霉素(Dox)诱导GFP基因表达,48h后检测GFP表达.结果 成功构建了1代四环素调控体系pELNS-rtTA-IRES-Neo和plenti6-TETO-GFP重组质粒.共转染293细胞后,Dox诱导组的细胞有较强的GFP表达,阳性率约为90%,而未加Dox组细胞GFP阳性表达率约为30%.成功构建了2代四环素调控体系pELNS-M2rtTA-IRES-Neo和plenti6-TREpitt-GFP重组质粒.共转染293细胞后,Dox诱导组的细胞有较强的GFP表达,阳性率约为95%,而未加Dox组细胞未见GFP表达.结论 2代四环素调控体系3代慢病毒系统可以高效诱导目的基因表达,且目的基因背景表达值低.
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日本三角涡虫热休克蛋白90基因克隆及其表达模式
目的 克隆日本三角涡虫热休克蛋白90(Djhsp90)基因,并对其在不同应激条件下表达模式进行分析.方法 采用PCR技术克隆日本三角涡虫hsp90 cDNA全长序列和基因组DNA序列,利用生物信息学软件对其序列进行分析,采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)技术检测其在再生、饥饿和热激过程中的表达模式.结果 Djhsp90 cDNA全长2354 bp,含有2148 bp的开放阅读框(ORF),编码715个氨基酸,含有真核生物HSP90家族蛋白的5个标签序列和末端高度保守序列MEEVD.基因组DNA测序表明,该基因仅含有1个内含子(48 bp),内含子的5'-和3'-剪切位点符合经典的“GT-AG”法则.涡虫切断后1d Djhsp90的表达量显著增加,2d达到高峰,3d后逐步下降到正常水平.持久饥饿过程中Djhsp90的表达量维持在较高水平.提高培养温度能显著诱导Djhsp90的表达,且涡虫头部对热效应敏感.结论 我们成功克隆了日本三角涡虫hsp90基因,并证实切割、饥饿和热激能诱导其表达上调.
关键词： 热休克蛋白90 基因克隆 实时荧光定量聚合酶链反应 涡虫 -
大鼠Fas配体基因的克隆
目的研究Fas配体(Fas ligand, FasL)在移植免疫方面的作用,克隆其编码的全部cDNA序列,并添加Kozak序列,以便在真核细胞高效表达大鼠FasL. 方法从大鼠的睾丸组织中提取总RNA,设计上、下游引物以RT-PCR的方法扩增出一931bp的DNA片段,将这一片段重组于pBK-RSV载体中,酶切鉴定插入片段正确后进行全序列分析. 结果证实该研究所克隆的cDNA是编码正确的大鼠FasL基因,与发表于GeneBank上的序列相比,完全正确.已构建成用于真核表达的重组质粒pBK-RSV/rFasL. 结论克隆到了编码正确的大鼠FasL的cDNA全序列,对移植免疫和帕金森病基因治疗的基础研究及临床应用具有重要意义.
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大鼠面神经核小GTP结合蛋白TC10的表达和真核表达载体的构建
目的分析大鼠小GTP结合蛋白TC10基因在大鼠面神经损伤早期的表达和作用,构建大鼠TC10的真核表达载体. 方法由大鼠损伤的面神经核中提取组织总RNA,利用逆转录聚合酶链反应技术观察面神经损伤后面神经核团TC10的表达变化,将获得的基因片段酶切后插入pcDNA3真核表达载体中,利用酶切电泳和核苷酸序列分析鉴定. 结果逆转录聚合酶链反应显示在正常情况下,面神经核团有TC10的表达,切断后6h即出现增加,24h达到大值.TC10真核表达质粒酶切电泳及序列测定证明,所获得的基因片段为大鼠TC10全长基因cDNA序列. 结论面神经切断后,TC10在面神经核团出现急剧增加,可能参与了神经元早期损伤反应的信号转录.本实验首次从大鼠面神经核团中获得大鼠TC10的cDNA,并构建了TC10真核表达质粒.为研究TC10的表达及作用提供了必要条件.
关键词： 小GTP结合蛋白 逆转录聚合酶链式反应 基因克隆 大鼠 -
家蝇抗菌肽defensin基因的克隆、原核表达纯化及抑菌、抑肿瘤活性鉴定
为研究家蝇防御素融合蛋白对肿瘤细胞K562有抑制作用,在GenBank中检索家蝇defensin基因,设计特异引物,在家蝇幼虫组织中提取RNA,并通过PCR扩增defensin基因成熟肽部分(Mature defensin,MD),将该基因与原核质粒表达载体pGEX-6P-1进行重组,构建家蝇抗菌肽重组蛋白pGEX-6P-1/MD.通过双酶切鉴定证明目的片段已稳定融合到载体pGEX-6P-1中并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中,经25℃ IPTG诱导在大肠杆菌E.coli DH5ɑ中表达.用GST-Sefinose亲和层析纯化蛋白,15% SDS-PAGE分析鉴定,可见相对分子量为约30 kDa的特异性目的条带.运用琼脂孔穴平板扩散法测定表达产物的活性,得知纯化后的重组融合蛋白pGEX-6P-1/MD对大肠杆菌生长有一定的抑制作用,并首次证明家蝇防御素融合蛋白pGEX-6P-1/MD对肿瘤细胞K562有抑制作用.家蝇抗菌肽融合蛋白pGEX-6P-1/MD被成功克隆和表达,证明纯化融合蛋白pGEX-6P-1/MD对肿瘤细胞K562有抑制和损伤作用,这为以后研发蝇防御素抗菌肽药物提供了依据.
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中华按蚊前酚氧化酶基因部分序列的基因结构和功能预测
前酚氧化酶是一种黑色素合成酶,是节肢动物体内的一种重要免疫蛋白.为了克隆中华按蚊Anopheles sinensis前酚氧化酶(Prophenoloxidase,PPO) 基因部分序列,根据已报道的多种昆虫 PPO 氨基酸的保守序列设计简并引物,以中华按蚊总 RNA 为模板进行RT-PCR 扩增,目的片段经 TA 克隆后测序.所得中华按蚊 PPO 基因(ASPPO) 部分序列长597 bp,编码 199 个氨基酸;与几种近缘蚊种的PPO基因序列同源性分别达57%~100%不等.经在线比对,该序列在基因组中分属两个外显子区域,中间含有一个内含子.推导的氨基酸序列含有两个铜离子结合位点,与目标序列相符,表明成功克隆出ASPPO部分序列.所得序列登录GenBank,登录号:JX295575,JX295576.推导的氨基酸序列提交瑞士蛋白质空间构象模拟平台Swiss-model,以冈比亚按蚊免疫相关前酚氧化酶为模板进行空间3D构象模拟,SPDview软件分析拉氏构象图.结果显示拉氏构象得分较高而QMEAN得分较低,近似跨膜蛋白值,提示该该蛋白是否为中华按蚊中肠和血淋巴疟原虫免疫蛋白尚不确定,需进一步研究.
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阴道毛滴虫黏附蛋白ap33基因克隆及其表达
通过提取取道毛滴虫mRNA,逆转录合成cDNA,PCR取到预期长度片段后,将其克隆到pUCm-T载体中进行PCR、酶切及测序分析,并与GeneBank中核酸序列进行同源性分析.再将其克隆至表达载体PET-32a.重组子用酶切、PCR和测序鉴定后,转化大肠杆菌并以异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.从阴道毛滴虫临床分离株中扩增出927bp的ap33的基因片段,构建重组质粒PET-32a(+)-ap33;EPTG诱导后,SDS-PAGE显示表达产物的大小约50kDa.
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抗隐孢子虫子孢子表膜单链抗体4G4的基因克隆及序列测定
应用RT-PCR技术,从分泌抗隐孢子虫表膜单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞4G4中,扩增出抗体VH和VL基因,用Linker(Gly4Ser)3基因,将VH和VL基因连接成ScFv基因,并将其克隆至pMD-18T载体中.经核甘酸序列分析证实,VH和VL基因及Linker基因拼接正确,基因全长717bp,经计算机分析,VH和VL基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征.
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阴道毛滴虫Rab6鸟苷三磷酸酶同源基因的cDNA克隆和序列分析
Rab鸟苷三磷酸酶是细胞膜转运机制的关键调节分子,与原虫的分泌功能密切相关.本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rab6鸟苷三磷酸酶同源基因,以便进一步探讨其功能.作者从阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离出2个Rab6鸟苷三磷酸酶同源基因的cDNA克隆,其中1个cDNA序列长658对碱基,读码框含597对碱基,推测蛋白质序列具198个氨基酸.序列分析表明该氨基酸序列与Rab6a蛋白亚家族的同源性高.另一cDNA序列长764对碱基,读码框含657对碱基,推测蛋白质序列具218个氨基酸.序列比对分析显示该氨基酸序列与Rab6b蛋白有较高的同源性.2个氨基酸序列都拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域、特异性RabF结构域和典型的异戊烯化结构域.进化树分析提示毛滴虫的这2个基因系Rab6家族的同源基因,在进化上更接近原虫和单细胞的酵母Rab6亚家族.序列分析还显示这2个基因都无内含子,其基因组DNA序列与其cDNA序列完全一致.
关键词： 阴道毛滴虫 Rab6鸟苷三磷酸酶 基因克隆
