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丹参类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)基因全长克隆及其生物信息学分析
根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)全长cDNA,并进行生物信息学分析;采用实时定量PCR检测茉莉酸甲酯(MeJA)诱导丹参毛状根不同时期的SmKOL表达水平.克隆得到的SmKOL全长cDNA由1 884个核苷酸组成,具有完整编码框,编码519个氨基酸,蛋白相对分子质量约为58.88 kDa,等电点pI 7.62;实时定量PCR结果表明该基因受MeJA诱导后,表达水平在36 h时达到大值.从丹参毛状根中克隆得到1条SmKOL全长cDNA,为进一步研究该基因的功能和丹参次生代谢调控机制提供了靶基因.
关键词： 丹参 类贝壳杉烯氧化酶 cDNA末端快速扩增 生物信息学分析 -
丹参2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)基因全长克隆及其生物信息学分析
目的:从丹参毛状根中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)全长基因,并进行生物信息学分析.方法:根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆SmMCS全长cDNA,并对SmMCS进行蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等分析；同时采用实时定量PCR检测Ag+诱导子诱导丹参毛状根不同时期的SmMCS基因转录水平.结果:克隆的SmMCS全长cDNA由988个核苷酸组成,具有完整编码框,编码234个氨基酸,蛋白相对分子质量约24.6 kDa,等电点pI 8.53；实时定量PCR结果表明该基因受Ag+诱导后表达水平在12 h时急剧上升并达到高值.结论:从丹参毛状根中克降得到一条SmMCS全长cDNA,为进一步研究丹参酮类成分的生物合成和萜类次生代谢提供靶基因.
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日本沼虾血蓝蛋白基因cDNA全长克隆及表达分析
目的 克隆日本沼虾血蓝蛋白基因,进行生物信息学及时空表达分析. 方法 利用cDNA末端快速扩增技术( RACE)从肝胰腺中克隆血蓝蛋白基因cDNA全长序列,用生物学软件对其序列进行生物信息学分析,时空表达分析采用实时荧光定量PCR方法. 结果 日本沼虾血蓝蛋白基因cDNA全长2 151 bp,包含14 bp的5'UTR、148 bp的3'UTR和189 bp的开放阅读框(ORF).ORF编码663个氨基酸,预测分子量为76.65kD,理论等电点为5.42,含有典型的3个血蓝蛋白结构域和2个保守的铜离子结合位点.与淡水螯虾、凡纳滨对虾血蓝蛋白相似性分别为70％和63％.该基因在肝胰腺中的相对表达量高,肌肉和血细胞表达较弱,大颚器官、表皮和卵巢几乎不表达:肝胰腺血蓝蛋白基因的表达量在蜕皮间期高,蜕皮后期和蜕皮前期较低；嗜水气单胞菌刺激后肝胰腺中的表达量显著增加. 结论 与其他甲壳动物相似,日本沼虾血蓝蛋白基因具有典型的结构域和保守的铜离子结合位点,在蜕皮间期的肝胰腺中呈高表达,是参与机体免疫防御反应的一种重要分子.
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刺五加环阿屯醇合酶基因的克隆及其表达分析
目的 克隆刺五加的环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析.方法 采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加CAS基因的全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,并通过RT-PCR法检测CAS在不同生长发育时期和不同器官中的表达情况.结果 刺五加CAS基因的cDNA全长为2758bp,开放阅读框长2 277 bp,编码758个氨基酸的蛋白,包含三萜合成酶的标志性序列.CAS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中.RT-PCR的结果显示,刺五加CAS基因在各时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P＜0.05).其中果实基本成熟期的表达量高,是低量萌芽期的1.56倍,各器官中,叶片的表达量高,是低量叶柄的1.37倍.结论 首次分离并报道了刺五加的CAS cDNA克隆,并证实其在不同生长发育时期和不同器官中的表达量不同,为进一步研究CAS对刺五加皂苷量的影响和表达调控奠定基础.
关键词： 刺五加 环阿屯醇合酶 克隆 表达分析 cDNA末端快速扩增 -
柯萨奇B组病毒的RACE扩增与序列分析
目的探讨3′RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术检测柯萨奇B组病毒(CVB)的可行性,并建立相应的实验检测方法.方法首先自行设计柯萨奇B组病毒6个型别病毒基因组的一条通用引物spl;然后从柯萨奇病毒(CVB1～CVB6)感染的Hela细胞,提取总RNA,用引物sp1结合Oligo dT进行3′RACE扩增,将产物克隆到pGEM-T载体上,挑取阳性菌落进行序列测定,与标准株进行同源性比对.结果获得了柯萨奇B组病毒6个型别的3′末端扩增产物及其核苷酸序列,同源性分析的结果显示扩增毒株与标准株之间的核苷酸同源性在95%～99%之间,氨基酸同源性在98%～100%之间.结论设计的引物"sp1"是柯萨奇B组病毒6个型别病毒基因组的一条通用引物;该引物结合Oligo dT进行的3′RACE扩增可用于柯萨奇B组病毒的检测.
关键词： 柯萨奇病毒B组 cDNA末端快速扩增 序列分析 -
丙型肝炎5'非编码区末端快速基因扩增方法的建立及应用
目的建立快速获得丙型肝炎(HCV)基因组5'非编码区(5'UTR)真末端序列的分子生物学方法.方法逆转录后利用末端聚合酶(TDT)进行加尾反应,再利用套式聚合酶链反应(PCR)扩增出目的末端基因的cDNA片段,A-T克隆,用限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)与PCR鉴定重组子,全自动序列分析仪测定插入子序列.结果 cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得5株HCV5'UTR克隆,包括3株全长克隆和2株缺失克隆.2株缺失克隆,一条在5'末端缺失53个碱基,另一条缺失144个碱基.结论 RACE技术快速、有效、实用,可有效获得丙型肝炎病毒基因组的5'非编码区末端序列.
关键词： 丙型肝炎病毒 5'非编码区 序列分析 cDNA末端快速扩增 -
旋毛虫抗原基因Ts88的克隆及鉴定
目的获取旋毛虫具有抗原性的新基因.方法应用旋毛虫免疫血清和人工感染血清对旋毛虫成虫cDNA文库约3×105重组噬菌斑进行筛选.基因克隆、DNA测序及5′-RACE获cDNA全长;采用ESEE、DNAstar软件及核苷酸序列数据库(GenBank)进行cDNA序列分析.结果与结论免疫筛选成虫cDNA文库,获得3个阳性克隆.其中的Ts88 克隆cDNA全长为1 966bp,编码484个氨基酸,含有一个PWWP功能结构域及多个抗原表位.Ts88 cDNA是一个尚未见报道的旋毛虫抗原新基因.
关键词： 旋毛虫 cDNA文库 基因克隆 筛选 cDNA末端快速扩增 -
cDNA末端快速扩增技术新进展
全长cDNA的获得是基因克隆的重要内容,也是目前人类基因组研究中的一个重要方面.cDNA末端快速扩增(RACE)技术是以PCR为基础,从部分已知的cDNA序列扩增出其他未知部分的5′端和3′端的cDNA序列的一种方法.本文从RACE技术的基本原理方法出发,详细阐述了其存在的缺陷,并对RACE新研究进展,如Marathon-PCR、Smar1-RACE以及"电子"cDNA克隆等作一综述.
关键词： cDNA cDNA末端快速扩增 基因克隆 -
甲状腺癌特异性低表达基因的筛选与克隆
目的筛选并克隆在甲状腺癌组织中特异性低表达的基因.方法 (1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差异表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库.(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性低表达的基因.(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析.(4)应用cDNA末端快速扩增法(RACE)获取目的基因TCRS30的cDNA全长.(5)Northern blot验证TCRS30号基因的差异表达.结果构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,通过筛选阳性克隆,获得一个在甲状腺癌组织中低表达的基因片段,经检索Genbank表明,在已知的人类EST数据库中找不到高度同源的序列,提示它可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因.以RACE法获知TCRS30的cDNA全长约为4.5 kb,通过Northern blot初步验证了TCRS30号基因在甲状腺癌和正常甲状腺组织中存在差异表达.结论通过SSH和RACE技术,获得了一个在甲状腺癌和正常甲状腺组织中差异表达的未知基因片段TCRS30,它可能代表着一条对甲状腺癌有抑制作用的新基因.
关键词： 甲状腺癌 抑制性消减杂交技术 cDNA末端快速扩增 基因 -
兔肝辅酶Ⅱ依赖性视黄醇氧化还原酶全长cDNA的克隆与分析
目的:克隆兔肝辅酶Ⅱ依赖性视黄酵氧化还原酶(NRDR)的全长cDNA,并分析其特征.方法:根据GenBank中已发表的NRDR的cDNA部分序列信息,运用cDNA末端快速扩增技术得到全长cDNA,然后利用生物信息学的方法对其进行分析.结果:得到NRDR全长cDNA序列,并提交到GenBank.分析发现该cDNA具有短链脱氢酶(SDR)家族的保守模序,而且在5'端同一个读码框架内有2个起始密码子.结论:新克隆的NRDR全长序列在GenBank编号为DQ229110,NRDR蛋白属于SDR家族.
关键词： 视黄醇氧化还原酶 cDNA末端快速扩增 短链脱氢酶 维生素A代谢 -
RACE技术扩增及克隆中华菊头蝙蝠ACE2基因
目的 建立中华菊头蝠体内扩增血管紧张素转换酶2(ACE2)基因真核表达载体,研究SARS冠状病毒感染的跨种属传播机制. 方法 利用基因的种属保守性分别设计用于扩增5'未端和3'端cDNA的引物,从中华菊头蝠小肠组织中提取总RNA,在通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得cDNA 5'端和3'端序列基础上,进一步PCR扩增ACE2开放阅读框并克隆到pcDNA3.1.结果 成功获得了中华菊头蝠的ACE2基因全长序列,并构建了其真核表达栽体pcDNA3.1/R-ACE2.结论 利用RACE技术扩增并构建了中华菊头蝙蝠的ACE2的真核表达载体,为研究SARS冠状病毒感染与免疫及跨种属传播机制奠定了基础.
关键词： cDNA末端快速扩增 血管紧张素转换酶2 蝙蝠 -
胃癌高表达cDNA片段W41的克隆及组织表达谱分析
目的从人胃癌组织中克隆新的相关易感基因.方法利用cDNA末端快速扩增PCR技术得到了扩增片段,将其克隆、核苷酸序列分析,并将序列在GenBank进行同源性比较.利用Northern 杂交、多组织Northern及基因表达系列分析了所得基因片段的组织表达谱.结果获得1条533 bp带有poly(A)尾的 cDNA片段,可见加尾信号AATAAA.与GenBank基因数据库同源比较,该序列未见与任何已知基因同源,登录GenBank(登录号为AF325202).该序列在胃癌组织的表达强度高于对应正常组织,多组织Northern及基因表达系列分析表明该序列在多种肿瘤组织中高表达,在正常组织中表达减弱.结论得到了1条与胃癌可能相关的新的cDNA序列.
关键词： 胃癌 cDNA末端快速扩增 组织表达分析 -
获取基因全长cDNA的方法及其进展
全长cDNA的获得是基因克隆的重要内容,也是目前人类基因组研究中的一个重要方面.要理解新基因的结构和功能,仅有不完整的cDNA片段是不够的.该文就获取全长cDNA的方法及其进展情况作一综述.
关键词： 基因 cDNA文库 cDNA末端快速扩增 电子克隆 -
兔大电导钙敏感性钾离子通道β亚基的克隆及生物信息学分析
目的:克隆新西兰白兔大电导钙敏感性钾离子通道(BKCa)β亚基基因,观察其组织分布,并对其进行生物信息学分析. 方法:采用3'及5'cDNA末端快速扩增(RACE)及RT-PCR技术从兔Oddi括约肌(SO)组织获得BKCa通道β亚基的全长cDNA序列. 并应用生物信息学方法分析该基因的同源性、蛋白结构域及跨膜拓扑结构. 结果:兔BKCa通道β亚基基因cDNA全长为1168 bp,开放读窗长度为576 bp,编码191个氨基酸. 生物信息学分析表明该基因核酸序列及氨基酸序列与人类及其它哺乳动物有很高的同源性;拓扑结构为两次跨膜蛋白,具有4个功能结构域,含有1个磷酸化位点及2个N-糖基化位点. 结论:首次成功地从兔SO组织克隆出BKCa通道β亚基基因,获得新GenBank号DQ821756,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.
关键词： 钙敏感性钾离子通道 cDNA末端快速扩增 Oddi括约肌 生物信息学 -
反式二羟环氧苯(a)芘相关新基因brg的全长克隆
背景与目的:在前期研究中发现,16HBE-C细胞表达变化的基因中有未知基因参与,因其与BPDE有关,所以命名为brg(anti-BPDE related gene)基因.本研究应用cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增此未知基因的全长,以进行下一步的基因功能研究.材料与方法:应用cDNA末端快速扩增法(RACE技术),对3'和5'端分别设计了梯度PCR,巢式PCR等优化程序,以获得特异的产物,然后对特异产物直接测序,将测序结果进行生物信息学分析,基因拼接等获得新基因brg全长.结果:3'和5'端均成功获得特异性产物,3'RACE测序为394 bp,有明显的PolyA加尾信号,有编码区的终止密码子;5'RACE测序为1 017bp,有起始密码子ATG,其中197 bp为3'和5'全长共有序列.将3'和5'序列拼接,结果全长1 214 bp,生物信息学分析brg基因阅读框1 032 bp,编码344个氨基酸.结论:所得结果与设计一致,说明所采用的技术路线是简便可行的,brg基因可能在反式二羟环氧苯并(a)芘的致癌机制中起重要作用.
关键词： cDNA末端快速扩增 反式二羟环氧苯并(a)芘 基因
