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丹参2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)基因全长克隆及其生物信息学分析
目的:从丹参毛状根中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)全长基因,并进行生物信息学分析.方法:根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆SmMCS全长cDNA,并对SmMCS进行蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等分析；同时采用实时定量PCR检测Ag+诱导子诱导丹参毛状根不同时期的SmMCS基因转录水平.结果:克隆的SmMCS全长cDNA由988个核苷酸组成,具有完整编码框,编码234个氨基酸,蛋白相对分子质量约24.6 kDa,等电点pI 8.53；实时定量PCR结果表明该基因受Ag+诱导后表达水平在12 h时急剧上升并达到高值.结论:从丹参毛状根中克降得到一条SmMCS全长cDNA,为进一步研究丹参酮类成分的生物合成和萜类次生代谢提供靶基因.
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黄花蒿MCS基因的克隆及其序列分析与原核表达
目的 从黄花蒿中克隆MEP途径关键酶2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MCS)基因,进行序列特征分析、原核表达以及组织表达的研究.方法 根据黄花蒿MCS (AaMCS)基因EST序列,克隆MCS cDNA及基因组序列.将MCS编码区与表达载体pET-21a(+)重组,构建pET-21a (+)-MCS的原核表达载体并转入大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导获得MCS融合蛋白.半定量RT-PCR检测MCS的组织表达情况.结果 AaMCS cDNA全长994 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,基因全长2 540 bp,包含3个外显子和2个内含子.构建pET-21a (+)-MCS重组质粒,获得稳定的pET-21a (+)-MCS原核表达体系.AaMCS在根、茎、叶、花中均有表达,其中花中表达量较高,根和茎中表达量低.结论 克隆了AaMCS基因,建立pET-2 1a (+)-MCS稳定的原核表达体系,为研究AaMCS蛋白的活性及其功能奠定了基础.
