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新疆紫草AP2/ERF转录因子的电子克隆和生物信息学分析
应用电子克隆技术,以紫草AP2/ERF序列为探针,获得了新疆紫草的1条876 bp AP2/ERF的序列,包含1个1 077 bp的开放阅读框编码205个氨基酸,命名为AeAP2/ERF.采用生物信息学方法,对该基因所编码的蛋白从氨基酸组成、理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、疏水性/亲水性、高级结构及功能域等方面进行预测和分析,结果显示该基因编码蛋白定位于细胞核,为水溶性蛋白,可以调控代谢、转导信号.
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应用EST和电子克隆策略研究血吸虫表达基因谱
目的开展血吸虫表达基因谱的研究,寻找新的疫苗候选分子和药物靶标.方法应用表达序列标签(EST)和电子克隆策略.结果获得了552个EST序列和487个电子延伸序列,其中104个EST序列在延伸前未表现同源性,而延伸后表现出有意义的同源性;获得了日本血吸虫基因表达谱的信息以及发现了有潜在药物和疫苗价值的新基因序列.结论本研究为日本血吸虫基因表达谱的研究提供更有效的研究思路.
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电子克隆结合RT-PCR获得两条eIF4E剪接变异体的全长cDNA
本研究旨在克隆急性白血病复发相关的新EST片段全长eDNA并进行生物信息学分析.电子克隆结合RT-PCR克隆新EST片段的全长cDNA,利用生物信息学技术分析所获得的cDNA.结果获得全长序列为1 904 bp和3 393 bp的两条真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor4E,eIF4E)新的剪接变异体,命名为真核细胞翻译起始因子剪接变异体1(splicing variant 1 of eIF4E)和真核细胞翻译起始因子剪接变异体2(splicing variant 2of eIF4E).编码的蛋白产物分别为245和132个氨基酸.二者编码的蛋白产物与eIF4E蛋白有所不同.结论:获得了两条eIF4E剪接变异体的全长cDNA,这为进一步探讨与急性白血病复发的相关性提供基础.
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大鼠矽肺相关基因组织蛋白酶B的电子克隆与验证
目的 探讨差异表达基因组织蛋白酶B在大鼠矽肺模型中的作用.方法 对以往经抑制消减杂交筛选得到的一条编号为ES110708的差异表达序列标签(EST)作为种子序列,通过电子克隆进行延伸,并在大鼠矽肺模型中用RT-PCR方法进行验证.结果 筛选得到的大鼠矽肺差异表达EST经电子克隆延伸得到了含有完整开放读码框架(ORF)的cDNA序列,长度为1977bp,比原来的EST片段(172bp)延伸了1805 bp.其ORF预测为1020bp,符合Kozak规则.将ORF序列进行同源性检索,其与序列号为NM022597.2的cDNA部分序列完全同源,说明所测ORF属于序列NM022597.2.该序列代表的基因是组织蛋白酶B.经RT-PCR验证,实验组大鼠肺组织Cathepsin B mRNA表达量明显上调.15 d、30 d、60d时,其吸光度(A)值分别为对照组的4.133、6.639、4.981倍,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 电子克隆能有效延伸EST序列直至全长cDNA序列,差异表达基因组织蛋白酶B可能参与了矽肺的发生与发展.
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人和大鼠自噬相关新基因WIPI-3的电子克隆和序列分析
目的:人和大鼠WIPI-3基因的电子克隆和序列分析.方法:综合运用基因电子拼接和比较基因组分析等生物信息学手段进行新基因的电子克隆和注释.通过拼接CR593190、NM_019613和BC000974 cDNA序列获得人WIPI-3 cDNA全长序列,通过拼接EST序列CB727439、CB737031、BF557312、BG663387和预测的CDS获得大鼠WIPI3基因的cDNA序列.结果:成功克隆了人和大鼠自噬相关新基因WIPI-3的cDNA,上述两个新基因序列均得到了人类基因组序列和EST序列的双重支持,另外经RT-PCR验证电子克隆的基因序列也是正确的,而且序列均已被GenBank收录,其编号分别为:AM182326和NM_001039587.其中,人WIPI-3基因修正了目前基因库中注释的WIPI-3序列,而大鼠基因则是国际上首次克隆,并被确定为参考序列.结论:基因电子拼接结合种属同源基因比较分析,可大大提高电子克隆的精确性,这种方法可有效用于新基因的克隆和注释.
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生物信息学策略鉴定新基因
随着人类基因组计划的开展,在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据,如何充分利用大量已有的网上数据库资源,加速人类基因克隆研究及功能初步研究,同时避免重复工作,节省开支,已成为我们面临的一个急迫而富有挑战性的课题.生物信息学是20世纪80年代末开始,随着基因组测序数据迅猛增加而逐渐兴起的一门新兴学科,它利用计算机对生命科学研究中的生物信息进行存储、检索和分析.它的产生和发展为人们提供了强大的工具,本文就生物信息学方法在识别和鉴定新基因中的应用予以综述.
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健脾益气法下调大鼠肝癌有关新基因cDNA序列的克隆
目的 克隆中医健脾益气法下调大鼠肝癌组织高表达序列标签(ESTs)的完整cDNA序列.方法 在以往发现若干健脾益气治法下调肝癌组织高表达EST的基础上,采用电子克隆与RT-PCR结合的方法,克隆有关E.ST片段cDNA序列.结果 成功筛选出7个EST片段的含完整编码区全长或近全长cDNA序列,经Blast对比,有6个基因为新基因,已向GenBank申报,并实现登录,登录号分别为:DQ480748、DQ480749、DQ480750、DQ480751、DQ480752、DQ480753.结论 所克隆出6个健脾益气法下调大鼠肝癌组织高表达EST的完整cDNA序列,为今后进一步深入研究这些基因的功能,及深入探讨健脾益气法防治肝癌的作用机制奠定了基础.
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健脾益气法下调大鼠肝癌有关新基因的克隆
目的 研究健脾益气治法下调DEN诱导大鼠肝癌高表达基因cDNA序列的克隆,为进一步揭示健脾益气法防治原发性肝癌的分子机制奠定基础.方法 在课题组以往大范围揭示出健脾益气法下调大鼠肝癌高表达基因谱的基础上,采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法,筛选健脾益气法明显下调的17个ESTs片段的全长cDNA序列.结果 成功克隆出14个ESTs片段的含完整编码区全长或近全长cDNA序列,经Blast对比,有7个基因为新基因,已向GenBank申报,并实现登录,命名为健脾益气药物下调大鼠肝癌ZH1、ZH3、ZH8、ZH12、ZH14、ZH16、ZH17基因.结论 本研究在充分利用生物信息学资源的基础上,成功克隆出7个健脾益气法能明显调控的新基因cDNA序列,为今后进一步深入研究这些新基因的功能,以及深入探讨健脾益气法防治肝癌的作用机制奠定基础.
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甲状腺激素反应蛋白1基因-一个新的鼠脑甲状腺激素反应基因的克隆、表达分布及其功能预测
目的克隆新的大鼠脑甲状腺激素反应基因,研究其表达特征并初步预测其功能.方法建立先天性甲状腺功能减退(甲减)新生大鼠模型,用荧光标记的差异显示PCR(DD-PCR)技术、亚克隆、测序及相似性检索获得未知的大鼠脑甲状腺激素反应基因的cDNA片段.采用电子克隆、RT-PCR、测序并克隆其cDNA全长.经Northern印迹法证实其表达受到甲状腺激素的调节,并用半定量RT-PCR方法和生物信息学技术观察其分布转录水平和预测其功能.结果克隆了甲状腺激素反应蛋白1(thyroid hormone-response protein-1,TRP-1)基因全长cDNA,共973 bp(基因登录号为AF348365),在甲减新生大鼠的脑中,该基因的转录增强.该基因表达广泛,以脑组织中的表达水平高;其在大鼠不同脑区的表达含量亦不同,以嗅脑高.该基因的编码产物具有一些重要的结构域和功能基序.结论 TRP-1基因是新发现的甲状腺激素反应基因,它在正常的脑发育中可能具有重要的作用,其异常表达可能是甲减性脑发育障碍发生的分子机制之一.
关键词： 甲状腺激素类 差异显示聚合酶链反应 印迹法 RNA 电子克隆 甲状腺激素反应蛋白1基因 -
3种常见人体寄生虫NAD1基因的电子克隆及对比分析
目的 利用电子克隆法对人体寄生虫NAD1基因进行电子克隆和生物信息学分析,为NAD1基因的进一步深入研究奠定基础.方法 分别选取华支睾吸虫、蛔虫和日本血吸虫的一个表达序列标签(EST)片段作为种子序列,以NCBI中的EST数据库作为目标参考序列,用电子克隆的方法分别克隆3种寄生虫的NAD1基因,并对其编码蛋白的理化性质、氨基酸组成、亚细胞定位、二级和三级结构进行对比分析.结果3种人体寄生虫NAD1蛋白理化性质、亚细胞定位、相对分子量、等电点差异较小,蛔虫和日本血吸虫的NAD1蛋白在三级结构上高度相似.进化分析显示,3种人体寄生虫的NAD1蛋白分属不同分支,存在一定的遗传距离.结论 通过电子克隆得到的3个NAD1基因是属于不同种属的同一基因,可广泛应用于研究寄生虫的种间和种内遗传变异.
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编码蛋白激酶的人类新基因NEK8的电子克隆
目的:克隆人类基因组中小鼠NEK8基因的同源物.方法:用同源筛选策略,以小鼠NEK8基因作为信息探针,在GenBank数据库中进行TBLASTN分析,将获得的高度同源的EST用VECTOR NTⅠ软件拼接成重叠群.利用BLAT分析确定NEK8基因的基因组结构以及染色体定位.利用SMART网上分析工具进行结构域预测,利用Unigene数据库进行表达谱分析.结果:电子克隆到人类NEK8新基因cDNA序列,长度为2858bp,含完整的ORF,编码一条692个氨基酸的多肽,被预测的分子量为74.8KDa,等电点8.04.定位在染色体17q11.2, 由15个外显子和14个内含子组成.其编码蛋白含有一个苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶结构域,与NEK家族成员有较高的同源性.电子表达谱分析显示NEK8基因在胎盘,胃,结肠,眼,胰腺,骨骼,肾,子宫等组织中表达.结论:电子克隆到编码苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶的人类新基因NEK8.
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新基因的克隆策略和方法
在对目的基因进行克隆时所采取的策略十分重要,其途径大致分为正向遗传学途径和反向遗传学途径,正向途径如功能性克隆(functional clonmg)、表型克隆(phonetypical cloning)等,而反向途径则以图位克隆(map-based cloning)、转座子标签(transposon tagging)技术为代表,电子克隆(snicon clonmg)的出现更提供了一种全新的方法.文章评述了各种策略的大致原理、技术路线及特点,以便在实际研究中可以选用较为可行的方案.
关键词： 克隆基因 正(反)向遗传学途径 电子克隆 -
成骨不全Ⅰ型致病基因COL1A1和COL1A2的电子克隆及结构分析
目的 揭示成骨不全Ⅰ型的分子遗传学发生机制.方法 分别选取致病基因COL1A1和COL1A2的一个EST片段作为种子,以NCBI中的EST数据库作为目标参考序列,用电子克隆的方法分别克隆两个基因,并对其编码的两种蛋白亚基的理化性质、氨基酸组成、二级和三级结构进行分析.结果 两种亚基虽然共同构成人Ⅰ型胶原蛋白,但两者之间相对分子量大小、等电点差别及氨基酸组成等差别较大;两者的相同点均包含信号肽序列,都带正电荷,都属于亲水性蛋白.结论 通过电子克隆得到的序列与实际序列之间存在误差,只能作为先期分析预测的参考,但是这种技术手段为具有高度遗传异质性的COL1A1和COL1A2基因致病机理的探索研究及疾病防患奠定了基础.
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葛枣猕猴桃果糖激酶基因电子克隆和生物信息学分析
目的:果糖激酶是促进果糖磷酸化关键代谢步骤重要的酶.通过电子克隆技术对葛枣猕猴桃果糖激酶基因进行预测.方法:以毛花猕猴桃果糖激酶序列为探针,基于美国国立生物技术信息中心(NCBI)中葛枣猕猴桃的EST数据库和CAP3在线软件进行序列拼接,利用生物信息学数据库及相关软件对其结构和功能进行预测分析.结果:葛枣猕猴桃果糖激酶基因全长1015 bp,包含957 bp的开放阅读框,编码318个氨基酸,该蛋白为疏水性蛋白.结论:本研究为进一步解释葛枣猕猴桃果糖激酶基因的分子功能奠定理论及实验基础.
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美洲茶藨子查耳酮合成酶基因电子克隆和生物信息学分析
目的:对美洲茶藨子查耳酮合成酶基因进行电子克隆及生物信息学分析.方法:以黑茶藨子查耳酮合成酶基因序列和美洲茶藨子表达序列标签为基本材料(探针),运用CAP3在线软件进行序列拼接,并对其进行了生物信息学分析.结果:美洲茶藨子查耳酮合成酶基因全长1423 bp,包含1173 bp的开放阅读框,编码390个氨基酸,该蛋白是定位于细胞质的亲水性蛋白,存在三处跨膜区,二级结构主要由α-螺旋构成.结论:研究结果有利于美洲茶藨子查耳酮合成酶基因的分子作用机制等方面的研究.
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甘蓝AP2/ERF转录因子的克隆和生物信息学分析
目的：：运用电子克隆的方法获得甘蓝中AP2/ERF转录因子基因。方法：以拟南芥的AP2/ERF转录因子作为探针，对甘蓝的EST数据库进行搜索，应用相关软件进行序列拼接组装和延长。结果：克隆出甘蓝两个AP2/ERF-B3亚族转录因子BoAP2/ERF1和BoAP2/ERF2。通过生物信息学方法，对两条序列编码蛋白质的氨基酸组成，亲水性/疏水性、理化性质、亚细胞定位、高级结构和空间构型等方面进行了预测和分析。结论： BoAP2/ERF1和BoAP2/ERF2基因由371和352个氨基酸组成、相对分子质量为40.85kDa和39.44kDa的蛋白质，定位于细胞核。序列分析结果显示，该蛋白可能具有信号转导和胁迫响应应答等功能。
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软枣猕猴桃GDP-L-半乳糖磷酸酶电子克隆与生物信息学分析
目的:通过电子克隆技术对软枣猕猴桃GDP-L-半乳糖磷酸酶(GGP)基因进行预测.方法:以猕猴桃GGP序列为探针,基于NCBI中软枣猕猴桃的EST数据库和CAP3在线软件进行序列拼接,利用生物信息学数据库及相关软件对其结构和功能进行预测分析.结果:软枣猕猴桃GGP基因全长1866 bp,包含1353 bp的开放阅读框,编码450个氨基酸.结论:本研究为进一步解释基因的分子功能奠定理论及实验基础.
关键词： 软枣猕猴桃 GDP-L-半乳糖磷酸酶 电子克隆 生物信息学 -
大鼠心肌缺血预适应相关基因5的克隆与特性分析
目的采用生物信息学分析表达序列标签AW918640以获得其所代表基因的全长序列,并对该基因进行初步的特性分析.方法利用基因银行(GeneBank)数据库,通过BLAST比对等生物信息学方法进行电子克隆,采用逆转录聚合酶链反应和基因测序等技术进行鉴定,采用map viewer软件进行染色体定位,ExPASy和SMART软件对获得的全长基因进行翻译和蛋白质功能结构分析.结果 AW918640(基因银行登录号)为一个在大鼠心肌缺血预适应后3 h表达升高的表达序列标签序列,通过电子克隆得到其所代表基因的全长,且为一新基因,经逆转录取合酶链反应和基因测序证实后,将其命名为心肌缺血预适应相关基因5(MIP5),并在基因银行数据库上登录,登录号为AY553870.心肌缺血预适应相关基因5大开放读码框为909 bp,编码302个氨基酸,含有6个kelch重复基序.结论心肌缺血预适应相关基因5为一与大鼠心肌缺血预适应相关的新基因.
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用生物信息学方法克隆大鼠核不均一核蛋白A2/B1基因
采用外显子预测、序列匹配、序列拼接等生物信息学方法电子克隆了一个在大鼠心肌缺血预适应中表达上调的表达序列标签所代表的核不均一核蛋白A2/B1基因,用逆转录聚合酶链反应证实了该基因的开放阅读框.它的开放阅读框为1026 bp,由10个外显子构成,推测编码341个氨基酸.它的编码区与人和小鼠的核不均一核蛋白 A2/B1基因分别有92%和95%的一致性,蛋白质序列的一致性几乎为100%.这些结果表明核不均一核蛋白 A2/B1基因在不同物种间高度保守,它在大鼠心肌缺血预适应中表达上调,可能在缺血预适应的内源性保护机制中发挥了重要的作用.
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脑脓肿相关新基因RBAG2-3的电子克隆及其功能预测
目的研究脑脓肿形成和发展过程中所涉及的新分子.方法对应用mRNA荧光差异显示技术(DD-PCR)获得的脑脓肿早期差异表达cDNA片段G2-3进行电子克隆,根据电子克隆的结果设计引物进行逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)、克隆及测序,验证电子克隆的准确性,并利用生物信息学技术对电子克隆产物进行功能预测.结果G2-3经电子克隆获得长度为1 157 bp的新基因RBAG2-3,Genbank登陆号为CN382815.结构功能分析显示RBAG2-3编码73个氨基酸残基的蛋白,存在多个功能作用位点,并具有PSI和H-NS结构功能域.结论经电子克隆获得新基因RBAG2-3,其编码蛋白具有多个功能作用位点,并具有能对神经上皮组织基因表达起作用的结构功能域,可能在脑脓肿的发病中起重要作用.
