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CVB3呼吸道重复暴露致鼠气道炎症的观察
目的观察CVB3呼吸道重复暴露后气道炎症的表现,进一步探讨CVB3感染与气道炎症关系.方法将Wistar大鼠随机分成4组:对照组,单次病毒吸入2w组、4w组,重复病毒吸入组,单次病毒吸入组2w处死,余各组4w处死,进行肺组织病理观察,分别计数炎症细胞及肥大细胞.结果单次病毒吸入2w组炎症细胞(320.850±110.998)及肥大细胞计数(20.450±8.268)均高于4w组(187.880±17.074)和(7.400±1.915),有显著差异(p＜0.01).重复病毒吸入组炎症细胞计数(298.933±85.731)高于单次病毒吸入4w组,有显著差异(p＜0.01),但与单次病毒吸入组2w无差别.结论CVB3鼻腔滴入可导致气道炎症.病毒感染后2周左右为炎症病变高峰期.重复CVB3感染并未加重气道炎症.
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黄芪注射液对病毒性心肌炎细胞感染模型的影响
目的研究黄芪注射液体外对病毒性心肌炎细胞感染模型的影响.方法以柯萨奇 B3m病毒感染新生SD 大鼠的培养心肌细胞,将黄芪注射液加入培养体系后,观察病毒感染前后细胞病变、搏动情况,检测培养液中心肌酶的改变.结果培养的SD大鼠搏动心肌细胞感染柯萨奇B3m病毒后,逐步出现细胞病变,细胞停止搏动.经黄芪注射液处理后病变减轻,心肌酶水平明显下降.结论黄芪注射液具有良好的抗病毒作用,能显著减轻病毒性心肌炎心肌细胞的损伤.
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实验性柯萨奇B3m病毒性心肌病变及其病原的原位逆转录-聚合酶链反应检测
目的 建立柯萨奇B3m（Cox B3m）病毒性心肌病变模型，用原位PCR方法检测心肌病变中的病原，以阐明Cox B3m病毒在发病过程中的作用。方法 (1)用Balb/C小鼠30只，制作Cox B3m病毒性急性心肌病变模型，50只制作慢性反复感染心肌病变的动物模型；并与25只正常Balb/C小鼠相对照；(2)对病毒反复感染所致慢性心肌病变动物模型的左室侧壁厚度及左室腔的面积大小，采用KS400型图像分析系统进行图像分析；(3)应用碱性磷酸酶联接的抗地高辛抗体标记的核苷酸直接掺入法建立原位PCR检测心肌组织中柯萨奇B3m病毒RNA。结果 不论是在急性或反复感染的慢性心肌病变模型心肌组织中100%可找到CVB-RNA阳性信号，慢性病变者经图像分析证明左心腔扩大，室壁变薄，与正常对照组相比P<0.01～<0.05。结论 在病变心肌组织中，用原位PCR检测都有阳性的CVB-RNA信号, 说明柯萨奇B3m病毒不仅能引起急性病变, 反复感染者亦可造成慢性病变, 后者心腔常扩大且室壁变薄。
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柯萨奇B组病毒IgM抗体特性研究
目的研究柯萨奇B组病毒(CVB)感染后患者急性期CVB-IgM抗体的反应特性。方法对临床确诊为CVB感染的患者急性期血清用免疫印迹法检测CVB-IgM抗体。结果患者的急性期血清IgM抗体均仅针对CVB的VP1抗原反应。经ELISA与免疫印迹方法的比较表明：用免疫印迹法检测的CVBIgM抗体可对CVB各型病毒抗原反应，具有CVB各型病毒之间的交叉反应性。而同时，在16例ELISA检测反应阴性的健康人血清中未见有CVB的VP1特异性的IgM抗体存在。结论临床感染CVB的患者急性期，其血清中的特异性的IgM抗体是针对CVB的VP1抗原，而且，此类抗体对各型的CVB抗原具有交叉反应性。
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小柴胡汤分解剂抑制CVB3m作用及对细胞活性影响
目的探讨小柴胡汤(XCT)分解剂在体外抗CoxB3病毒(CVB3m)及保护细胞的作用.方法采用微量细胞培养技术和中性红摄入法,以细胞病变及细胞活性为判定药物细胞毒性及病毒增殖的指标,观察不同浓度的XCT及分解1、2号抗CVB3m的作用及对细胞活性的影响.结果低于大无毒剂量浓度的XCT和分解1号、2号对细胞活性未见明显影响,并在一定浓度范围内有促细胞生长、增强细胞活性的作用.治疗组,XCT及其分解1、2号对CVB3m增殖均有明显抑制作用,尤以分解1号作用明显,抑制率为107.6%;同等浓度下,预防治疗组药物抑病毒率明显高于治疗组,高可达128.1%;抑病毒吸附组也有明显抑病毒作用.结论通过比较XCT及其分解1、2号作用细胞与病毒的不同环节,提示XCT具有保护细胞减轻病毒感染功能及直接杀伤CVB3m的作用.
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喘康平冲剂抗病毒作用的实验研究
目的探讨喘康平冲剂的抗病毒作用。方法在Hep-2细胞培养内观察细胞病变，测定喘康平冲剂对细胞的无毒限量，对呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒B3、流感病毒A1感染细胞病变的抑制指数，以及改变病毒和药物的加入顺序，观察细胞病变的影响程度。结果喘康平冲剂的无毒限量是1：16，对呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒B3、流感病毒A1抑制指数为8、8、2。双黄连口服液的无毒限量是1：32，对呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒B3、流感病毒A1的抑制指数为8、16、2。改变病毒和药物的加入顺序，细胞病变程度不同。结论喘康平冲剂对呼吸道合胞病毒，柯萨奇病毒B3、流感病毒A确有抑制作用，与双黄连口服液一致或接近；其体外抗病毒作用机理主要是直接的灭污作用，其次也可能抑制了病毒复制的某一环节。
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IL-12表达水平变化及其免疫活性对病毒性心肌炎的影响
目的探讨在小鼠急性病毒性心肌炎(VM)发病过程中白细胞介素12(IL-12) mRNA表达水平和蛋白浓度变化,及其免疫学活性对心肌炎的影响. 方法 135只雄性BALB/c小鼠随机分为正常组(n=25)、心肌炎对照组(n=50)、rIL-12组(n=40)、IL-12抗体组(n=20),后3组经腹腔接种柯萨奇病毒(CVB3m)诱发急性心肌炎,rIL-12组于病毒接种后4h皮下注射重组IL-12,10ng/0.1ml,心肌炎组注射等量PBS,均连续用5d(0～4d),抗体组于0～1d经腹腔注射IL-12中和抗体0.1mg/0.1ml,共2次,分别于接种后1、3、5、7d各组随机取若干只小鼠采血后处死,留取心脏、脾等标本. 结果小鼠感染CVB3m后,其心肌组织中IL-12 mRNA的表达水平增高,同时体内IL-12、IFN-γ的蛋白含量也增高;在投入rIL-12后,IFN-γ的蛋白含量升高更明显,NK细胞活力增强,同时小鼠心肌组织中病毒滴度降低,心肌损害减轻,小鼠生存率提高(分别为66%和85%);而在IL-12抗体投入组结果则相反,且小鼠生存率降低(50%),但与心肌炎组相比差异无显著性. 结论在VM早期小鼠体内rIL-12能减轻心肌损害,提高感染小鼠的存活率,起到保护性的作用.
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卡维地洛(carvedilol)对柯萨奇病毒B3感染小鼠γ-干扰素活性及氧自由基的影响
目的 探讨卡维地洛对柯萨奇病毒B3(CVB3)病毒性心肌炎小鼠的作用.方法 随机将80只小鼠分为3组:正常对照组(n=20),心肌炎组(n=30)与卡维地洛组(n=30),利用BALB/c小鼠感染CVB3建立病毒性心肌炎模型,感染24 h后每日灌胃给予卡维地洛10 mg/kg直至第14天末,分别于接种第7天和第14天随机从各组抽取若干只小鼠取血后处死并留取心脏等标本.结果 卡维地洛降低病毒性心肌炎小鼠急性期的病死率,显著减轻心脏病理损伤,显著减低HW/BW(HW,心脏重量;BW,身体重量)比值;卡维地洛干预后第7天小鼠心肌IFN-γ表达水平显著高于心肌炎对照组,MDA含量显著降低;干预后第14天SOD含量显著增加,MDA含量显著降低.结论 卡维地洛通过增加心肌IFN-γ表达水平与抗氧化的双重作用减轻感染小鼠的心肌损害,提高生存率,起到保护性作用.
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限制性内切酶分析法在柯萨奇B组病毒检测及分型中的应用
目的探讨限制性内切酶分析法在柯萨奇B组病毒B1～B6型检测及分型中的应用.方法利用GCG软件对柯萨奇B1～B6型病毒cDNA全序列进行了限制性内切酶酶切位点的分析.结果共114种限制性内切酶在柯萨奇B1～B6型病毒cDNA中分布有不同数量的酶切位点.经过比较和分析,得到了它们的一个共同cDNA片段,在这个cDNA片段中,B1～B6型病毒各自具有特异性的核苷酸序列(特异的限制性内切酶位点),对柯萨奇B组病毒6个已知型别标准毒株进行了成功的分型和检测.结论本方法有效地解决了在柯萨奇B组病毒检定以往方法中所存在的非特异性问题,可以对柯萨奇B组病毒进行准确的检定和型别鉴定.
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小鼠病毒性心肌炎中Fas/FasL异常表达的研究
目的探讨柯萨奇病毒B3(CVB3)所致小鼠病毒性心肌炎(VM)心肌细胞损伤的变化,观察Fas/FasL介导的细胞凋亡在心肌损伤中的作用.方法采用CVB3制备小鼠病毒性心肌炎动物模型,心肌组织切片HE染色了解心肌损伤情况;电镜检测观察心肌组织中的细胞凋亡;同时采用免疫组化、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)两种方法检测心肌炎小鼠不同时期心肌组织中Fas与FasL基因转录与蛋白的表达.结果光镜观察见对照组小鼠心肌组织无异常改变,实验组病鼠可见心肌细胞坏死和单核、淋巴细胞浸润,后期可见纤维化;电镜观察对照组心肌中未检出凋亡细胞,而病鼠心肌凋亡细胞检出率较高58.33%(7/12例),且细胞凋亡多存在于炎症病灶周围的心肌细胞及病灶处炎性浸润细胞;感染后第7～14天的病鼠心肌组织中,主要表达于心肌细胞的Fas mRNA及蛋白和主要表达于浸润淋巴细胞的FasL mRNA及蛋白均明显增强;FasL蛋白表达水平与心肌病变积分呈正相关(r=0.9082,P＜0.001).结论小鼠病毒性心肌炎中心肌损伤坏死与心肌细胞凋亡共存,通过Fas/FasL基因路径介导的心肌细胞凋亡与病毒性心肌炎的发病过程有关.
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心肌细胞感染病毒后钙、钾通道电流及其表达改变和牛磺酸的作用
目的观察心肌细胞感染病毒后心肌细胞钙、钾通道电流及通道表达改变和牛磺酸的作用.方法 (1)体外心肌细胞感染病毒:用胰蛋白酶和胶原酶消化法分别获得大鼠、乳鼠培养和分离的心肌细胞并感染柯萨奇B3病毒,用于检测Ca2+跨膜内流、电压依赖性钙通道电流(ICa)和外向钾通道电流(Iout).(2)在体小鼠感染病毒:BALB/c小鼠腹腔内注射柯萨奇B3病毒 7d后取出心脏用于检测电压依赖性钙通道α1亚单位抗原和电压调控性钾通道(Kv)mRNA的表达.相应各组加入不同剂量的牛磺酸并观察其作用.结果 (1)感染柯萨奇B3病毒后Ca2+跨膜内流量及ICa增加,牛磺酸对其有抑制作用.(2)柯萨奇B3病毒感染使Iout明显增大,牛磺酸可使病毒感染后的Iout趋于恢复正常.(3)柯萨奇B3病毒感染后小鼠心肌出现强电压依赖性钙通道α1亚基抗原阳性信号,Kv1.2、Kv2.1、Kv4.2 mRNA与3种探针的杂交信号亦明显增强,牛磺酸可使增强的阳性信号减弱.结论柯萨奇B3病毒感染后心肌细胞钙、钾离子通道电流及表达均增加,牛磺酸可通过抑制其改变而发挥对感染病毒心肌细胞的保护作用.
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小柴胡汤对体外新生大鼠柯萨奇病毒B3心肌炎模型的酶学与细胞病变的影响
目的 探讨中药小柴胡汤对病毒性心肌炎的心肌酶学和细胞病变的影响及对病毒性心肌炎的治疗作用.方法 体外培养新生大鼠心肌细胞,并感染柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3),以此作为体外病毒性心肌炎模型,观测心肌细胞感染CVB3 24、48、72、96 h后乳酸脱氢酶(LDH)、β-羟丁酸脱氢酶(HBDH)和细胞病变,并与小柴胡汤治疗组相比较.结果 小柴胡汤对CVB3感染心肌细胞24、48、72、96 h的心肌酶升高和细胞病变有显著的抑制作用.结论 小柴胡汤具有抗柯萨奇病毒感染和保护心肌细胞作用.
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CVB感染在上海地区小儿常见疾病发病中的地位及年龄特点
为探讨柯萨奇B组病毒(CVB)感染在上海地区小儿常见疾病发病中的地位及年龄特点,作者对967例住院患儿进行了血清CVB抗原(CVB-Ag)及CVB特异性IgM抗体(CVB-IgM)的检测.结果发现,上呼吸道感染组、下呼吸道感染组、心肌炎组、哮喘组、ITP组、过敏性紫癜组CVB-Ag及CVB-IgM阳性率均高于对照组,O～1岁组及1～3岁组CVB阳性者主要是呼吸道感染患儿,此后随年龄增长,阳性者中呼吸道感染者逐渐减少,心肌炎比例逐渐上升,同时,过敏性紫癜、ITP患儿的比例亦上升,而哮喘在各年龄组均占一定比例.结果提示除呼吸道感染外,CVB在小儿心肌炎、哮喘、ITP、过敏性紫癜的发病中也起到重要作用.
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灸甘草汤加减液在体外对感染病毒大鼠心肌细胞的影响
病毒性心肌炎(VMC)的主要病理变化是淋巴细胞侵润、单核细胞、心肌细胞变性坏死，它是一种由于心肌被嗜心性病毒侵犯而导致的心肌疾病，多见于青壮年人群[1]。复方生脉散合灸甘草汤加减液是根据“活血化瘀、益气养阴”的原则来进行配置[2]，临床应用效果表明：不存在着较为明显的毒副作用，临床疗效也较好，能够有效地保护实验性损伤心肌细胞[3]。灸甘草汤由桂枝、黄连、阿胶、灸甘草、麻仁、生姜、大枣、人参、生地、麦冬等成分组成，出自《伤寒论》。本实验就灸甘草汤加减液在体外对感染病毒大鼠心肌细胞的影响进行探讨。研究时间2006年7月～2007年4月。
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一株引起手足口病重症感染的柯萨奇B3病毒变异株的生物学分析
目的 分析1株柯萨奇病毒B3型(CoxB3)新分离株FY-19的基因特性和生物性状,为进一步探讨其引起手足口病(HFMD)重症表现的机理提供线索.方法 采用Lim Benyesh-Melnick组合血清方案对1株分离自2008年中国阜阳地区重症HFMD男性患儿的FY-19病毒株进行血清学鉴定,以全基因序列测定分析该病毒株的遗传特征,结合病毒增殖动力学和噬斑形成实验分析FY-19病毒的生物学特性,通过乳鼠脑内病毒接种研究该毒株的致病性特征.结果 血清学鉴别确定FY-19毒株为CoxB3病毒;与标准株相比,FY-19株在3'、5'非编码区和编码区的差异分别为达到23.0%、16.5%和32.1%,与我国分离于非HFMD患者的毒株相比也存在较大差异(非编码区和编码区的差异分别为13.5%和25.0%);FY-19株能在14 h内达到增殖高峰,且其在小鼠体内引起心肌病变的致病性显示出明显的致死能力.结论 FY-19株的生物学特性与标准毒株之间存在较大的差异,对该变异株的进一步分析将为了解其在HFMD的特殊的致病机理提供帮助.
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C3d对分泌型柯萨奇病毒B组3型VP1 DNA疫苗的免疫增强作用
目的 构建分泌型柯萨奇病毒B组3型(CVB3)衣壳蛋白1(sVP1)与三拷贝补体3片段(C3d3)融合基因疫苗,并观察其免疫效果.方法 将C3d3 cDNA与带有白细胞介素2(IL-2)信号肽的CVB3 VP1基因拼接,构建真核表达质粒pcDNA3/sVP1-C3d3.BALB/c小鼠随机分为3组,分别肌肉注射pcDNA3/sVP1-C3d3、pcDNA3/sVP1和pcDNA3质粒,于不同时间检测小鼠血清中和抗体滴度、特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性、血中病毒滴度,并观察疫苗的免疫保护作用.结果 小鼠的中和抗体滴度随免疫次数增加而提高,第3次免疫后pcDNA3/sVP1-C3d3组中和抗体滴度(33.6±1.7)和特异性CTL杀伤率(66.1%±2.9%)均明显高于pcDNA3/sVP1组(28.3±1.7,52.8%±3.3%,均P＜0.05);以致死量CVB3感染小鼠后,经融合基因免疫的小鼠血中病毒滴度显著降低,生存率达50%,而pcDNA3/sVP1组仅为25%,pcDNA3组无存活.结论 C3d可以显著增强sVP1基因免疫诱导的特异性免疫应答.
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含融内体多肽的新型B3型柯萨奇病毒DNA疫苗对小鼠病毒性心肌炎的预防作用
目的改良新型B3型柯萨奇病毒(CVB3)DNA疫苗chitosan-pcDNA3-VP1,增强其预防CVB3性心肌炎的效果. 方法合成含融内体多肽和多聚赖氨酸的"载体多肽"HApLys16,与pcDNA3-VP1、脱乙酰壳多糖(chitosan)依次复合制备chitosan-pcDNA3-VP1-HApLys16疫苗,以含200 μg DNA剂量疫苗隔周滴鼻免疫小鼠,3周后以3×半数致死剂量(LD50)CVB3感染小鼠致病毒性心肌炎,检测感染后体重、体重/心脏重比、心肌HE染色和心脏外观评价病毒性心肌炎预防效果.结果 (1) chitosan-pcDNA3-VP1-HApLys16疫苗免疫组黏膜sIgA分泌增高.(2)病毒感染后体重显示:pcDNA3组减重4.50%,chitosan-pcDNA3-VP1组和chitosan-pcDNA3-VP1-HApLys16组分别增重1.75%和5.44%.(3)感染后体重/心脏重比值显示:chitosan-pcDNA3-VP1-HAplys16组比值大,为193.77,病毒性心肌炎的体征轻.(4)感染后心肌病理显示:pcDNA3组100%发生严重病毒性心肌炎;chitosan-pcDNA3-VP1组发病率16.7%,程度轻;chitosan-pcDNA3-VP1-HApLys16组不发病,心肌完全正常.(5)心脏外观显示:pcDNA3组心脏增大有疤痕状白斑;chitosan-pcDNA3-VP1组心脏基本正常;chitosan-pcDNA3-VP1-HApLys16组心脏正常,提示无病毒性心肌炎发生.结论含融内体多肽的chitosan-pcDNA3-VP1-HApLys16新型疫苗可有效增强chitosan-pcDNA3-VP1 DNA疫苗预防病毒性心肌炎的效果.
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呼吸道九联检检测对儿科呼吸道疾病的诊断价值
目的 观察国产呼吸道感染病原体抗体IgM检测试剂盒(九联检)对儿科住院患儿的临床应用价值,为儿科临床合理用药提供流行病学依据.方法 采用间接免疫荧光法对医院2017年1-12月入院后开展该项检验的患儿1556例检测结果进行回顾性分析.结果 入选病例1556例,检测出抗体阳性670例,占比43.06％(其中混合感染335例,占比21.53％),其中肺炎支原体感染率高为37.40％(582例),腺病毒次之为16.20％(252例);病原体混合感染335例,占阳性病例50.00％,其中二联感染占15.17％(236/1556);肺炎支原体感染无明显季节性,肺炎衣原体和副流感病毒集中在春季,腺病毒夏季和冬季较高,柯萨奇病毒B组秋冬季多见,乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒冬季多见;甲型流感病毒全年散在出现;1～5周岁年龄组患儿检出率较高.结论 呼吸道九联检检测试剂盒因灵敏度高、特异性强、检测快速便捷,能为儿科医师提供诊断及合理用药的实验室检测依据.
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两种检测柯萨奇病毒B组IgG抗体胶体金方法的建立及比较
目的:建立两种胶体金反应体系检测柯萨奇病毒B组IgG抗体并进行比较,选出合适的检测方法.方法:利用胶体金标记柯萨奇重组抗原做金标垫,鼠抗人IgG包被做检测线建立捕获法反应体系;利用胶体金标记鼠抗人IgG做金标垫,包被柯萨奇重组抗原做检测线建立间接法反应体系,通过实验选出性能较好的试剂盒并与进口试剂盒(酶联免疫法)进行临床标本比对实验.结果:捕获法同临床已知样本的阳性符合率和阴性符合率分别为97.96％和98.80％,总符合率达到98.67％,间接法同临床已知样本的阳性符合率和阴性符合率分别为93.88％和98.80％,总符合率达到98.00％;在抗干扰实验中,捕获法与间接法对ANA阳性、高脂、黄疸共47例干扰因子样本均有较好的抗干扰性能;但在检测RF阳性样本时,间接法体系研制而成的试剂出现1例假阳性反应;对600例临床样本进行检测,柯萨奇病毒B组IgG抗体捕获胶体金检测试剂与进口试剂盒的阳性符合率和阴性符合率分别为97.82％和99.40％,总符合率达到99.17％.结论:经初步临床应用,表明利用捕获法原理建立的检测试剂盒比利用间接法建立的更灵敏,抗干扰性能更强,而且与进口试剂盒比对,有较高的灵敏度和特异性,具有较好的应用前景.
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病毒性心肌炎的分子生物学机制研究进展
近年来病毒性心肌炎在儿童中的发病率逐年上升,随着检测技术的不断提高,通过在分子水平上进行研究,发现了一些新的机制参与病毒性心肌炎的发生及发展.如近期已发现参与病毒侵入所需的受体及其信号转导途径,与病毒感染相关的宿主细胞基因异常与自身免疫反应激活的途径,以及心肌细胞修复时期的分子生物学基础等.这些机制的发现对于进一步探索治疗病毒性心肌炎的新方法提供了重要的依据.
