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基于二代测序技术的黄芪萜类合成酶基因挖掘与生物信息学分析
目的:对黄芪萜类合成酶(TPS)基因进行挖掘与生物信息学分析,为黄芪萜类化合物特别是三萜皂苷的合成、积累作用及其分子机制研究奠定基础.方法:通过二代测序技术构建黄芪转录组文库,根据基因注释信息进行TPS序列初步筛选,BLAST同源比对确认.运用MEGA 4.0构建邻接(NJ)系统进化树,采用在线工具开放阅读框(ORF) Finder,Compute pI/Mw,ProtComp 9.0进行生物信息学分析.结果:共获得76条TPS序列,其中13条拥有完整的ORF.获得的TPS序列中注释为TPS10序列多,其次为大根香叶烯D合成酶和单萜合成酶;选取17条代表性TPS序列进行同源性分析,发现黄芪TPS序列分为3个类群,每一类群均包括Ⅰ型和Ⅱ型萜类合成酶序列.此外,挖掘得3条环阿屯醇合酶(GAS)序列,其中原始编号为CL6827.Contig1和Unigene19112的CAS序列具有完整的ORF,所编码蛋白质序列长度分别为795,757个氨基酸,亚细胞定位于内质网,与已报道黄芪CAS序列同源性高.结论:利用黄芪转录组文库成功挖掘得黄芪单萜、倍半萜及三萜合成环化酶基因,定位于内质网的CAS序列与三萜皂苷主要由细胞质中的甲羟戊酸途径合成特征吻合.
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刺五加环阿屯醇合酶基因的克隆及其表达分析
目的 克隆刺五加的环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析.方法 采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加CAS基因的全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,并通过RT-PCR法检测CAS在不同生长发育时期和不同器官中的表达情况.结果 刺五加CAS基因的cDNA全长为2758bp,开放阅读框长2 277 bp,编码758个氨基酸的蛋白,包含三萜合成酶的标志性序列.CAS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中.RT-PCR的结果显示,刺五加CAS基因在各时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P＜0.05).其中果实基本成熟期的表达量高,是低量萌芽期的1.56倍,各器官中,叶片的表达量高,是低量叶柄的1.37倍.结论 首次分离并报道了刺五加的CAS cDNA克隆,并证实其在不同生长发育时期和不同器官中的表达量不同,为进一步研究CAS对刺五加皂苷量的影响和表达调控奠定基础.
关键词： 刺五加 环阿屯醇合酶 克隆 表达分析 cDNA末端快速扩增
