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I-激活人甲状腺原代细胞容积敏感性氯通道的研究
目的:探讨I-诱导的人甲状腺原代细胞的氯通道的电生理学及药理学特性.方法:干贴壁法进行原代细胞培养;兔疫荧光法鉴定甲状腺原代细胞;全细胞膜片钳技术记录细胞氯通道电流;阴离子置换法研究氯通道离子选择性.结果:细胞外灌流NaI(1μmol/L)可激活甲状腺原代细胞膜氯通道开放,产生氯电流,该电流有明显外向优势,无电压及时间依赖性失活,其翻转电位接近氯离子平衡电位.该电流可被氯通道阻断剂NPPB抑制,同时该电流具有客积敏感性,能够被47％高渗溶液抑制.该通道对阴离子的通透性依次为:I->Br->Cl->Gluconate-.结论:NaI可以激活人甲状腺原代细胞客积敏感性氯通道,该通道对I-的通透性高于Cl-.
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动脉粥样硬化兔主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道变化及其对钙敏感性的研究
[目的]探讨动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道(Calcium-activated Potassium Channel, KCa)变化及其对钙的敏感性.[方法]用酶消化法获取单个主动脉平滑肌细胞,通过膜片钳记录技术检测AS兔主动脉平滑肌细胞KCa通道的活性,并在浴液中分别加入不同浓度的Ca2+,以Pclamp7.0应用软件实时采样记录通道的开放概率(Po)、平均开放时间(To)、平均关闭时间(Tc)和电流幅值(Am),并以加钙前作对照观察上述参数的变化.[结果]AS组KCa通道的活性明显高于对照组;与加Ca2+前比较,对照组Po增加了(22.35±9.43)倍,而AS组仅增加了(5.31±0.42)倍(P<0.01).[结论]AS兔血管平滑肌细胞KCa通道的活性明显增加,可能是AS血管发生代偿性扩张的机制之一;该通道对Ca2+的敏感性降低,可能是促进AS发展的因素之一.
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膜片钳技术在各学科研究中的应用
膜片钳技术作为先进的细胞电生理技术,已成为研究离子通道重要的手段.利用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性、分子结构进行进一步研究.膜片钳技术自发明以来,被广泛用于生物学、生理学、生物化学、药理学等多种学科的基础研究.基于此,就近年膜片钳技术的研究、记录方式,以及其在神经系统、胃肠道、心脏、视觉神经细胞、精子通道、药理学等方面的应用做一简要综述.
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膜片钳技术在经络信息传递研究中应用探讨
膜片钳技术自上世纪70年代建立以来,被广泛应用于生理学、药理学等多种学科的基础研究和应用研究中,为解决生物信息的跨膜信号转导问题提供了先进的研究手段.针灸通过经络从多方面、多水平、多途径产生的治疗效应,也是一种生物信息的传递,其作用是否与药物一样引起了细胞电生理、细胞生物学的变化,应用此技术予以深入研究,将会阐明其原理.
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Inhibition of P2X7 Receptor by Extracts of Chinese Medicine
目的:探讨中草药石菖蒲粗提物SCP01及其纯化物SCP02(α-细辛脑)和迷迭香抽提物X0728对人肥大细胞的作用.方法:用膜片钳技术全细胞记录人肥大细胞膜ATP激活的P2X7受体的电流.结果:40μg/mL SCP01抑制P2X7电流(27.6±2.0)%,而同样浓度的SCP02抑制(29.5±2.2)%(-100 mV电位下),笔者还比较了商业用α-细辛脑的效厘,42 μg/mL可抑制P2X7电流(52.2±2.0)%.相反,40 μg/mL X0728激活P2X7电流(28.6±2.8)%,所有这些作用都是电压依赖性的.结论:α-细辛脑对P2X7的抑制将阻滞胞内钙的增加,从而可以解释抑制神经元死亡的原因.而X0728刺激P2X7的药理学效应尚需进一步研究.
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心肌细胞内钙火花的动力学研究
2001年王世强等人把膜片钳技术和激光扫描共聚焦显微成像技术结合起来,首次记录到心肌细胞内由单个L型钙通道分子产生的局部钙信号,将其命名为Ca2+sparklet(钙星).实验结果证明单个钙通道开启所形成的钙星可触发单个钙火花,参与钙致钙释放的L型钙通道和RyR相距仅12～15纳米.
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黄连素对大鼠结肠上皮隐窝细胞基底膜钾通道的影响
目的 研究黄连素对结肠上皮隐窝细胞基底膜钙依赖钾通道[IK(Ca)]和环磷酸腺苷(cAMP)依赖钾通道[IK(cAMP)]的影响,探讨其治疗分泌性腹泻的机制.方法 用乙二胺四乙酸(EDTA)溶液分离结肠上皮隐窝细胞,运用EPC 10膜片钳放大器测量全细胞模式下50、100、500 μmol/L黄连素对结肠上皮细胞基底膜IK(Ca和IK(cAMP)的影响,并设PSS对照组.结果 50、100、500 μmol/L黄连素可抑制大鼠结肠上皮隐窝细胞基底膜IK(Ca)和IK(cAMP)(P值均＜0.05),当阶跃刺激为+80 mV时,其IK(Ca)分别为对照组的(71.43±3.61)%、(54.56±5.13)%、(38.66±3.85)%(P＜0.05);其IK(cAMP)分别为对照组的(78.55±5.72)%、(60.42±6.33)%、(43.78±6.47)%(P＜0.05).结论 黄连素能抑制大鼠结肠上皮细胞基底膜IK(Ca)和IK(cAMP)的开放,这可能是其治疗分泌性腹泻的机制之一.
关键词： 黄连素 结肠 膜片钳技术 钙依赖钾通道 cAMP依赖的钾通道 -
小檗碱对豚鼠结肠平滑肌细胞膜离子通道的影响
小檗碱(黄连素,Ber)是从毛茛科黄连属植物根状茎中提取的一种异喹啉生物碱,在中国及印度被用作止泻药已有三千余年的历史.传统上Ber主要用于治疗感染性腹泻,近年来国内外学者研究发现,Ber具有抑制小肠黏膜分泌作用[1].为了进一步探讨Ber对动力性腹泻的作用,采用膜片钳技术研究Ber对豚鼠结肠平滑肌细胞膜钙离子激活钾通道[IK(Ca)]和延迟整流钾通道[IK(V)]的影响,探讨其治疗运动性腹泻的机制.
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高压氧联合亚低温治疗脑外伤后Bcl-2基因家族表达变化的研究进展
脑创伤后病变的发生发展主要取决于脑创伤周围区缺血的情况,此区域是发生延迟性神经元死亡的主要区域.近的研究数据显示,细胞凋亡在脑创伤发生延迟性细胞死亡中起重要角色.Bcl-2基因编码多种蛋白对细胞凋亡有重要的调节作用,高压氧(hyperbaric oxygen,HBO)与亚低温治疗明显影响脑创伤动物模型半影区该基因的表达,而且亦可明显减少细胞凋亡数.国内外专家较多使用的有液压冲击法、气压冲击法、负压吸引法与自由落体法.依靠负压吸引法较自由落体法制作的模型有更多的优点,正如生理学研究细胞膜两侧离子时采用膜片钳技术一样,负压吸引法仅损及较小的区域,对白质、基底核、脑干等脑组织的影响较小,减少了一些混杂因素的干扰,所测数据较准确可靠.一、脑创伤后Bcl-2基因家族表达的变化有证据显示,脑创伤产生的动力性损伤程度并不限于直接受力部位及受伤当时的严重程度,关键是在损伤后病变的持续演变状况[2].与脑缺血相似,脑创伤也会产生细胞凋亡参与的迟发的继发性损害.
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甲基丁香酚对吸气抑制性气道迷走节前神经元突触活动的影响
目的 探讨甲基丁香酚(MEG)对吸气抑制性气道迷走节前神经元(Ⅱ-AVPNs)突触活动的影响.方法 应用逆行荧光示踪技术,标记位于出生后3～5d新生SD大鼠延髓疑核外侧区的气道迷走节前神经元(AVPNs);制备具有呼吸节律的离体延髓脑片;应用电生理学方法,记录舌下神经根的放电活动,鉴定Ⅱ-AVPNs并记录其突触活动;向离体延髓脑片灌流100μmol·L-MEG,分别将应用MEG前后所记录的舌下神经根放电活动及Ⅱ-AVPNs的突触活动分别作为对照组及MEG组.选择对照组后10个、MEG组呼吸节律消失前5个呼吸周期连续的突触活动进行统计学分析.结果 100 μmol· L-1 MEG能明显抑制Ⅱ-AVPNs吸气期相位性外向电流(POC)及相位性抑制性突触后电流(IPSCs).MEG组POC的幅度及面积分别为对照组的(46.37±6.74)％和(54.21±8.52)％,P均＜0.001.MEG组吸气间期自发性IPSCs、兴奋性突触后电流(EPSCs)的频率及幅度明显低于对照组[(0.62 ±0.28)vs(2.36±0.66) Hz,(23.61±1.79)vs(27.43±1.42) pA;(4.73 ±0.84)vs(5.13±1.02) Hz;(25.09±2.63)vs(38.85±3.93) pA;P均＜0.01].结论 MEG通过抑制Ⅱ-AVPNs吸气期相位性外向电流及兴奋性、抑制性突触活动来影响Ⅱ-AVPNs的兴奋性.
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槟榔碱对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流的影响
目的:研究槟榔碱(Are)对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)的影响.方法:利用全细胞膜片钳技术测定大鼠心室肌细胞的Ito.结果:10.0μmol·L-1Are可以降低Ito,使Ito幅值从(10.6±s 1.2)pA·pF-1降至(6.2±0.9)pA·pF-1(P＜0.01,n=20).在1～100μmol·L-1范围内Are的作用呈浓度依赖性,IC50为8.2μmol·L-1.10.0μmol·L-1 Are使稳态激活曲线右移,半激活电压(V1/2)从(-11.6±0.6)mV移至(-2.3±0.1)mV,但曲线斜率基本不变.Are对失活曲线影响不大,但10.0μmol·L-1Are使通道失活后恢复时间常数从(88±16)ms延长为(152±24)ms(P＜0.01,n=18).结论:Are浓度依赖地阻滞大鼠心室肌细胞的Ito.
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精氨酸加压素对大鼠背根神经节神经元GABA激活电流的增强作用
越来越多的研究表明,精氨酸加压素(arginine vasopressin,AVP)在痛觉调制中具有镇痛作用.已报道的研究专注于AVP镇痛的中枢作用机制,而本研究旨在研究AVP镇痛的的外周作用机制.应用全细胞膜片钳技术,在急性分离的大鼠背根神经节(DRG)神经元上,观察AVP对GABA激活电流(IGABA)的增强作用以及AVP对GABAA受体功能的影响.结果显示,AVP(1 × 10-10～1×10-5 mol/L)预处理后,IGABA增大,GABA剂量效应曲线上移,IGABA的大值较之对照增加约49.1％;而EC50值几乎不变,表示此种加强为非竞争性的,而且AVP对GABA电流的作用可能是电压非依赖性的.AVP对IGABA的加强作用几乎完全被Via受体的拮抗剂SR49059(3×10-6 mol/L)阻断.二次钳压技术胞内透析非水解GDP类似物GDP-β-S(5×10-4 mol/L)或PKC抑制剂GF109203X(2×10-6 mol/L)也可以阻断AVP对IGABA的加强作用.以上结果提示,AVP经由G蛋白耦联受体以及PKC信号通路上调DRG神经元GABAA受体的功能,可能是其诱导镇痛作用的基础.
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细胞内高镁对豚鼠心室肌细胞L-型钙通道活性的影响
本文旨在研究细胞内高镁对离体豚鼠心室肌细胞L-型钙通道的单通道门控特性的影响.急性酶消化法分离豚鼠心室肌细胞,应用膜片钳膜内向外单通道记录模式观察不同浓度细胞内镁([Mg2+]i)对心肌细胞L-型钙通道单通道电流的影响.结果显示,对照组([Mg2+]i 0.9 mmol/L)的心肌细胞L-型钙通道相对活性为(176.5±34.1)％,而高镁组([Mg2+]i 8.1 mmol/L)钙通道相对活性显著降低至(64.8±18.1)％(P＜0.05).另外,8.1 mmol/L [Mg2+]i使心肌细胞L-型钙通道的平均开放时间缩短至对照组的约25％(P＜0.05),但对通道平均关闭时间无明显影响.以上结果提示,细胞内高镁主要通过缩短通道平均开放时间抑制豚鼠心室肌细胞L-型钙通道的活性.
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不同年龄大鼠心肌细胞瞬时外向钾电流的变化
本文旨在研究心肌细胞瞬时外向钾电流(transient outward potassium current,Ito)的随龄变化及其药物反应性改变.Sprague Dawley大鼠28只,分为青年组(3～5月龄)、成年组(13～15月龄)和老年组(22～24月龄).酶法分离心室肌细胞,应用全细胞膜片钳技术记录各组Ito.并于细胞外液分别加入1.0 μmol/L异丙肾上腺素和2.0 mmol/L 4-氨基吡啶干预,观察Ito的变化.结果显示,与青年组和成年组相比,老年组Ito电流密度显著增加.门控动力学研究显示,老年组Ito电流稳态激活曲线左移,通道关闭态失活速率明显降低,稳态失活后恢复速率加快,而稳态失活过程无明显变化.老年组Ito对选择性抑制剂4-氨基吡啶的反应性与青年组和成年组相似,但老年组Ito对β受体激动剂异丙肾上腺素的反应性却明显弱于青年组和成年组,各组电流密度分别增加55.9％、127.5％和125.8％.上述结果提示,随着大鼠年龄的增加,心肌细胞Ito电流密度显著升高,与通道门控的激活、关闭态失活和失活后恢复机制改变有关,且老年鼠Ito对异丙肾上腺素的反应性降低.
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熊果酸激活低分化鼻咽癌细胞氯通道和减小细胞容积
本文旨在研究熊果酸对低分化鼻咽癌细胞氯通道的激活作用,以及熊果酸对其细胞容积的影响.采用膜片钳技术记录熊果酸激活的鼻咽癌细胞(CNE-2Z)全细胞氯电流,应用离子置换、改变细胞外渗透压、氯通道阻断剂等观察熊果酸诱导的氯电流的特性,活细胞动态图像分析技术测量细胞容积变化.结果显示,等渗条件下可记录到CNE-2Z细胞微弱且稳定的背景氯电流,细胞外灌流熊果酸可浓度依赖性(1～100 nmol/L)诱发氯电流的产生,在+80 mV电压钳制下,100 nmol/L熊果酸激活的氯电流的平均电流密度为(78.92±6.39) pA/pF和(-59.86±4.86) pA/pF,该电流具有较明显的外向优势,不表现明显的时间依赖性和电压依赖性失活.该电流翻转电位为(-4.83±0.30) mV,较接近Cl-平衡电位(-0.9 mV).熊果酸激活的氯通道对不同阴离子的通透性为:Cl-=I-＞ Br-＞葡萄酸根离子.该电流具有容积敏感性,可被细胞外高渗透压显著抑制；氯通道阻断剂他莫昔芬(tamoxifen)、5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸[(5-nitro-2-(3-phenylpro-pylamino) benzoic acid,NPPB]可抑制该电流.细胞外灌流熊果酸1h后,细胞容积减小,氯通道阻断剂NPPB可抑制该容积变化.以上结果提示,熊果酸可以激活低分化鼻咽癌细胞的氯通道,使Cl-外流,进而引起细胞容积减小.
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5-羟色胺和/或pH值的变化对大鼠舌下神经元漏钾电流的调制作用
克隆的TWIK相关酸敏感型钾通道1(TWIK-related acid-sensitive K+channel,TASK-1)对生理范围的pH值变化较为敏感(pK～7.4).近在多种脑干运动神经元上发现了TASK-1样通道,主要功能为编码背景性漏钾电流(TASK-1-like current).本文旨在研究舌下神经元漏钾电流的特性,以及5-羟色胺(5-HT)和/或灌流液pH值的变化对该电流的影响及其可能的机制.以出生后7～8 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠为研究对象,应用活脑片技术获取大鼠舌下神经核细胞,利用脑片全细胞膜片钳技术记录并分析运动神经元漏钾电流和超极化激活的阳离子电流(hyperpolarization-activated cationic current,Ih).结果显示,漏钾电流和,Ih可以被pH 6.0的酸性人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)所抑制,亦可被pH 8.5的碱性ACSF所激活.10μmol/L 5-HT可显著抑制漏钾电流和Ih,并可使舌下神经元去极化,诱发阈下震荡和/或动作电位.给予5-HT2受体拮抗剂Ketanserine,可以拮抗酸性ACSF对漏钾电流和Ih的抑制作用.以上结果表明,酸性ACSF对漏钾电流和Ih的调制作用可能是通过5-HT2受体介导的.
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慢性压力超负荷早期兔左心室肌中层细胞电重构的动态变化
我们以往的研究发现,慢性压力超负荷致心室肌细胞肥大过程中,中层细胞动作电位时程(action potential duration,APD)逐渐延长且易发生早期后除极(early after-depolarization,EAD).在本实验中,我们应用全细胞膜片钳技术进一步观察慢性压力超负荷早期兔左心室肌中层细胞电重构的动态变化,并探讨此变化的病理生理学意义.取新西兰兔64只,随机分为缩窄组和假手术组,采用肾上腹主动脉缩窄术制备兔左心室压力超负荷模型.分别在术后2周和8周采用胶原酶两步消化法分离获取左心室中层单个心肌细胞,全细胞膜片钳技术记录中层细胞慢激活延迟整流钾电流(IKs)、瞬间外向钾电流(Ito)及L型钙电流(ICa-L).结果显示,术后2周,与假手术组比较,缩窄组中层细胞IKs尾电流(IKs,tail)密度降低33.3%,Ito密度降低51.5%,ICa-L密度无明显改变;术后8周,与假手术组比较,缩窄组中层细胞IKs,tail密度降低37.0%,Ito密度降低49.2%,ICa-L密度仍无明显改变.上述结果提示,在慢性压力超负荷的早期,兔左心室肌中层细胞电生理特性即发生明显改变,表现为IKs和Ito下调,导致APD延长,可能与恶性心律失常发生有关.
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豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞胆碱能受体通道特性
本文旨在探讨豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上有无胆碱能受体存在,并对其相应的离子通道特性进行研究.应用全细胞膜片钳技术检测急性分离的豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞对乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)的反应.结果显示,7.5%(21/279)的Ⅰ型前庭毛细胞对10～1000μmol/L ACh敏感,引发明显的外向电流.该电流对ACh的反应呈浓度依赖性,半数激活浓度(EC50)为(63.78±2.31)μmol/L,但该电流为非电压依赖性.在-50mV钳制电压和正常细胞外液中,100μmol/L ACh激活一持久缓慢的外向电流,电流幅值为(170±15)pA,该电流幅值依赖于胞外钙离子浓度,可被胞外给予的钙依赖性钾通道拮抗剂TEA阻断.Ⅰ型前庭毛细胞的再次激活时间不小于1min.长时间暴露在ACh的情况下,受体离子通道不会发生自发性关闭.以上结果提示,部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上存在胆碱能受体,胞外给予ACh可激活一持久缓慢的外向电流,其胆碱能受体通道对于ACh的作用呈浓度依赖性和外钙依赖性、非电压依赖性或失敏性.本研究结果对于阐明前庭传出神经的功能及其作用机制,证实并揭示Ⅰ型前庭毛细胞上存在传出神经递质受体以及日后临床指导眩晕疾病的康复治疗具有重要的意义.
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激活δ阿片受体可抑制大鼠心室肌细胞L-型钙电流和瞬时外向钾电流
本研究采用全细胞膜片钳技术观察了SNCl62(一种选择性δ阿片受体激动剂)对人鼠心室肌细胞L型钙电流(L-type Ca2+current,ICa-L)和瞬时外向钾电流(transient outward K+current,Ito)的影响.结果显示,SNCl62明显抑制大鼠心室肌细胞,Ica+L和Ica+L,对Ica+L.和k的大抑制率分别为(46.13±4.12)%和(36.53±10.57)%.1x10-4mol/L SNCl62使,Ica+L的甲均电流密度从(8.98±0.40)pA/pF下降到(4.84±0.44)pA/pF(P<0.01,n=5),Ito的平均电流密度从(18.69±2.42)pA/pF降低到(11.73±1.67)pA/pF(P<0.01,n=5).单独应用naltrindole(一种选择性δ阿片受体拮抗剂)对大鼠心室肌细胞Ica+L和Ito无显著作用,但预先应用naltrindole可以消除SNCl62对Ica+L和Ito的抑制作用.结果表明,通过δ阿片受体,SNCl62(1x10-6～1x10-4mol/L)浓度依赖性地抑制人鼠心室肌细胞Ica+L和Ito这可能是激动δ阿片受体产生抗心律失常效应的重要机制.
关键词： SNCl62 膜片钳技术 心肌细胞 naltrindole -
UTP经PLC-IP3信号通路调控猪冠状动脉平滑肌细胞自发性瞬时外向电流
本文采用全细胞穿孔膜片钳技术研究uTP对急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞(coronary artery smooth muscle cells,CASMCs)自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents,STOCs)的作用,探讨细胞内Ca2+释放在UTP产物三磷酸肌醇(inositol 1,4,5.trisphosphate,IP3)调控STOCs过程中的作用机制.结果显示:(1)UTP(40 gmol/L)可明显激活CASMCs的STOCs,使其幅度和频率分别增~0(57.54±5.34)%和(77.46±8.42)%(P<0.01,n=38).(2)磷脂酶C(phospholipase C,PLC)阻断剂U73122(5 gmol/L)可明显抑制STOCs的活性,使其幅度和频率分别降低(31.04±7.46)%和(41.65±16.59)%(P<0.05,,n=10);细胞外再加入UTP小能再次激活STOCs(n=7).(3)L型电压依赖性钙通道(L-type voltage-dependent Ca2+channels,L-VDCCs)阻断剂verapamil(20 gmol/L)和CdCl2(200 gmol/L)几乎不影响UTP对STOCs活性的调节(n=8).(4)1 gmol/L的bisindolylmaleimide I[Bisl,蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的特异性阻断剂]可明显激活STOCs,使其幅度和频率分别增加(65.44±24.66)%和(61.35±21.47)%(P<0.01,n=12),细胞外再加入UTP(40 gmol/L)可使STOCs的幅度及频率进一步明显增加(P<0.05,P<0.01,n=12),细胞外继续加入ryanodine(50 gmol/L)则可完全阻断STOCs.(5)UTP(40 gmol/L)预处理细胞后,IP受体(IP3 receptors,IP3Rs)阻断剂2-aminoethoxydiphenyl borate(2-APB,40 gmol/L)可使STOCs的幅度降低(24.08±3.97)%(P<0.05,n=8),对其频率的影响较小(n=8);而80 gmol/L的2-APB则可明显抑制STOCs的活性,使其幅度和频率分别降低(31.43±6.34)%和(40.59±19.01)%(P<0.05,P<0.01,n=6),细胞外继续加入高浓度的ryanodine(50 Bmol/L)可完全抑制STOCs(n=6).用2-APB(40 gmol/L)或ryanodine(50 gmol/L)预处理细胞后,UTP(40 gmol/L)不能再次激活STOCs.以上结果提示:UTP主要通过PLC-IPl信号通路激活急性酶分离的猪CASMCs的STOCs,IP3Rs和ryanodine受体(ryanodine receptors,RyRs)介导的细胞内Ca2+释放在此过程中发挥重要作用.
