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四川省CRF01_AE和CRF07_BC亚型HIV-1毒株耐药性分析
目的 分析2010—2013年四川省感染CRF01_AE和CRF07_BC亚型HIV-1毒株艾滋病患者的耐药情况.方法 于2010年1月1日至2013年12月31日,以其间四川省正接受艾滋病抗病毒治疗6个月以上、HIV-1病毒载量>1 000拷贝/ml的患者为研究对象,各收集其血浆1.5 ml.采用自建基因型耐药检测方法进行HIV-1 pol基因区耐药检测,将发现HIV-1 pol基因区耐药的患者作为有效研究对象.本研究共成功测序1 213例患者的HIV-1 pol基因序列.采用χ2检验或Fisher确切概率法比较感染不同亚型HIV-1毒株患者的耐药情况.结果 1 213例成功测序患者中,558例(46.0%)的序列发生耐药突变,其中感染CRF01_AE亚型毒株患者为327例(58.6%),CRF07_BC亚型毒株为126例(22.6%),CRF08_BC亚型毒株为46例(8.2%),B亚型毒株为33例(5.9%),C亚型毒株为4例(0.7%), CRF02_AG亚型毒株为1例(0.2%),不详亚型毒株为21例(3.8%).对CRF01_AE和CRF07_BC亚型毒株分析耐药突变分析,L33、F116、L74、Q151和T69耐药突变仅在CRF01_AE中出现,A71、K43和Q58耐药突变仅在CRF07_BC中出现;核苷类逆转录抑制剂(NRTIs)和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)中,CRF01_AE亚型毒株高度耐药率均高于CRF07_BC、CRF08_BC、B亚型毒株,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论 四川省HIV-1耐药毒株主要以CRF01_AE、CRF07_BC亚型为主,且其耐药突变情况不同.
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艾滋病和丙型肝炎病毒感染吸毒者的树突状细胞表面分子基因多态性分析
目的 研究吸毒人群中艾滋病病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染者与未感染者中,等位基因树突状细胞表面特异性分子同源物(DC-SIGNR)的分布情况,筛选出HIV或HCV抗性基因.方法 选择深圳市戒毒所吸毒人群血液样本500份,其中313份来自静脉注射吸毒者,对他们进行HIV及HCV抗体筛查,并提取外周血基因组DNA,对DC-SIGNR颈区基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测和基因序列测定分析.结果 检出97例HIV阳性吸毒者,均为静脉注射吸毒者,且全部为HCV阳性;HIV阴性吸毒人群中,HCV抗体阳性率57.57%(232/403);HIV阴性静脉注射吸毒者中,HCV阳性率63.89%(138/216);而采用鼻吸等其他方式吸毒者的阳性率为50.26%(94/187),静脉注射吸毒与其他方式吸毒者阳性率的差异具有统计学意义(x2=7.61,P=0.0058).x2检验结合确切概率法分析显示,HIV阳性的吸毒者中,DC-SIGNR颈区5/6和5/8等位基因型的出现频率[4.55%(4/88)和2.27%(2/88)]高于HIV未感染组[1.04%(4/384)和0(0/384),确切概率法P=0.043和P=0.034],具有统计学意义;HCV阳性吸毒人群中,各类杂合子及纯合子的出现频率与HCV阴性吸毒人群间差异无统计学意义,静脉注射吸毒者与其他方式吸毒者之间差异无统计学意义.结论 在吸毒人群中,DC-SIGNR颈区等位基因分布与HCV感染无明显相关性,而等位基因型5/6可能与HIV感染相关,但由于频率较低,仍需进一步验证.
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乙基亚硝基脲对人白血病细胞HPRT基因的影响
目的探讨乙基亚硝基脲(ENU)诱导人次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因突变的分子图谱和发生机制.方法采用单细胞克隆培养、双向筛选计数、多重聚合酶链反应扩增和电泳分析等方法.结果随着ENU剂量的增加,细胞接种存活率非常显著下降(100～200 μg/ml剂量组)、突变频率显著升高(12.5～200.0 μg/ml剂量组).自发突变没有全部基因外显子缺失型,只有7.7%检测出单个外显子缺失;而ENU诱发突变中却有79.7%显示缺失改变,其中缺失突变可以发生于HPRT基因的每个外显子,且诱发突变中大多数是多个外显子连锁缺失(88.1%).结论 ENU诱发HPRT基因突变图谱与自发突变完全不同,易诱发较大遗传结构改变,提示其具有较强的致突变作用.
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辽宁省2004-2008年人类免疫缺陷病毒感染者原发耐药基因特征
目的 了解辽宁省自2004年至2008年治疗前人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者中耐药基因突变新变化及HIV-1耐药株的流行率.方法 应用抽签法选取经确诊但未接受过治疗的HIV-1感染者血浆样本20份,提取RNA.通过病毒载量检测,HIV-1蛋白酶(PR)全长和部分反转录酶(RT)基因区通过逆转录PCR(RT-PCR)法和巢式PCR法得到扩增样本.经测序,运用Contig Express对序列拼接、编辑和校正,上传耐药序列至斯坦福大学HIV耐药数据库(http://hivdb.stanford.edu)进行分析,寻找耐药位点,评价目前未治疗感染者中病毒基因耐药新变化和耐药株流行趋势.结果 20例未治疗确诊感染者血浆中,13份病毒载量检测值大于1000拷贝/ml的样本得到有效扩增,经测序得到65条有效序列.耐药基因型分析发现2个在辽宁省新出现的亚型H和CRF10_CD.13份样本均未发现核苷类反转录酶抑制剂(NRTIs)相关突变,4份存在非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTIs)相关耐药突变,突变位点分别为P225H、K238S、V179D、K238T,突变率为30.8%(4/13);1份(7.7%)样本蛋白酶抑制剂(PI)主要相关耐药位点154S发生突变,发生PI多重交叉耐药.3份样本仅在PR区分别有1处次要耐药突变,突变位点分别为L10V、A71V,但对蛋白酶基因耐药没有仟何影响.结论 辽宁省HIV-1耐药基因型发现新亚型,PR区基因发现主要耐药突变,应考虑启用二线蛋白酶抑制剂药物.
关键词： HIV-1 HIV感染 多药耐药相关蛋白质类 突变 -
镍诱导pSP189质粒的非定标性突变及其与DNA损伤的关系
目的检测醋酸镍诱导pSP189质粒在Vero细胞中的非定标性突变及其DNA损伤，分析其间的关系，为探讨镍的致癌机制提供线索。方法醋酸镍染毒Vero细胞2.5 h，再常规培养24 h后，转染野生型质粒pSP189，获取经该哺乳动物细胞复制过的质粒，转化其进入大肠杆菌MBM7070，通过特殊培养基筛选突变子；用改良的单细胞凝胶电泳法检测开始转染时Vero细胞的DNA损伤。结果醋酸镍浓度为250 μmol/L和1 000 μmol/L剂量组诱导出了非定标性突变，其突变率分别为9.46×10-4和15.01×10-4，是对照组的4.41和6.98倍，各剂量组的DNA链断裂、DNA-蛋白交联和DNA-DNA交联均显著高于对照组，但无剂量-效应关系；突变率和DNA-DNA交联均出现了剂量跳跃现象。结论醋酸镍在穿梭质粒系统中可诱导出非定标性突变，并与宿主细胞的DNA-DNA交联效应可能相关。
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耐多药结核分枝杆菌pncA基因突变特征及与吡嗪酰胺耐药相关性研究
目的 了解耐多药MTB的pncA基因突变特征及其与吡嗪酰胺(PZA)耐药之间的关系.方法 收集2007-2009年深圳市耐多药MTB共127株,采用BACTEC MGIT 960系统检测其PZA耐药性,并用Wayne法检测吡嗪酰胺酶(PZase)活性；对pncA基因进行测序,分析其突变情况和分布特征,对PZA药物敏感性与PZase活性、pncA基因突变进行相关性分析.结果 127株耐多药菌株中有62株对PZA耐药,耐药率为48.8％.耐PZA菌株中有55株PZase阴性.62株耐药株中有48株发生了pncA基因突变,突变率为77.4％,突变形式包括碱基置换(33株)、移码突变(12株)和整码突变(3株).48株pncA突变的耐药菌株中,PZase阴性为45株.全部65株敏感株酶活性均为阳性,其中1株菌株发生了pncA基因突变(N11D).pncA基因突变分析中发现了5个新的突变类型位点:H57P、P62Q、G108R、D110Y、G162V.耐多药菌株对PZA的敏感性与PZase活性(r=0.895,P＜0.05)、pncA基因突变(r=0.779,P＜0.05)存在相关.结论 pncA基因突变类型多样,突变随机分布整个基因片段,发现了5个此前未曾报道过的新突变类型,所有突变主要分布于PZase活性位点和金属结合位点及其相邻区域上,且与PZA耐药存在较高相关性.
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2型糖尿病患者β3-肾上腺素能受体基因突变与肥胖的关系
目的研究2型糖尿病患者β3-肾上腺素能受体基因突变与肥胖的关系.方法采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测了154例2型糖尿病患者β3-肾上腺素能受体基因Trp64Arg错义突变;同时检查体质指数、腰臀比值、血压及测定血脂等指标.结果糖尿病伴有肥胖者Trp64Arg基因型的频率为42.5%,Arg64等位基因的频率为22.6%;突变频率在糖尿病伴有肥胖者与糖尿病体重正常者之间差异有显著性.突变与体质指数、收缩压、舒张压及HDL-C相比有统计学意义.结论糖尿病患者β3-肾上腺素能受体基因突变与肥胖可能有关.
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2010-2012年宁波市乙型流行性感冒病毒血凝素及神经氨酸酶基因差异分析
目的 分析2010-2012年宁波市乙型流行性感冒(简称流感)病毒的流行状态及表面抗原基因血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)进化情况.方法 收集宁波市2010-2012年流感样患者的咽拭子和含漱液标本3440份,进行流感病毒分离鉴定;同时采集2010年正常人群血清628份,进行抗体滴度测定.选择不同时期乙型流感分离株进行HA和NA基因序列测定,分析病毒表面抗原基因的进化方向与流行规律的关系.结果 共计109份临床样本分离出乙型流感病毒,其中Victoria系102份(93.6％),Yamagata系7份(6.4％);在628份正常人群血清中,Victoria和Yamagata系乙型流感病毒抗体阳性率分别为321 (51.1％)和300 (47.8％),差异无统计学意义(x2=1.405,P＞0.05).进化分析显示,2010-2012年Victoria系HA基因均聚集在疫苗株Malaysia/2506/2004分支中,而NA基因则出现了不同方向的进化分支.Victoria系流行株与Brisbane/60/2008在HA基因中仅1～5个氨基酸位点的差异,而NA基因上有6～16个位点的差异.相比HA基因,Victoria系NA的进化速度更快.结论 2010-2012年宁波市Victoria系乙型流感的NA基因进化速度比HA基因快;综合HA与NA基因序列分析对观察流感病毒的基因变异更为灵敏可靠.
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p53基因甲基化和突变与燃煤污染型砷中毒关系研究
目的 探讨燃煤砷污染对人体p53基因甲基化(启动子区及第5外显子)和突变(第5外显子)的影响,分析其与燃煤型砷中毒的关系.方法 在贵州省兴仁县燃煤型砷中毒病区选择112例砷中毒患者,根据病情将其分为轻度中毒组(38例)、中度中毒组(43例)和重度中毒组(31例);根据有皮肤病理学诊断患者(43例)的病理结果,将其分为非癌变组(24例)和癌变组(19例).选择条件相似的非砷暴露村90名居民作为对照组.在知情同意原则下,采集上述观察对象的外周血,应用限制性内切酶-PCR法检测p53基因启动子区及第5外显子甲基化情况,应用PCR-单链构象多态性技术及PCR产物克隆测序技术检测p53基因第5外显子突变情况.结果 p53基因启动子区甲基化阳性率在轻、中、重度组分别为13.16%(5/38)、27.91%(12/43)、45.16%(14/31),与对照组[1.11%(1/90)]比较差异均有统计学意义(χ2值分别为8.679、23.690、41.199,P值均＜0.017);在非癌变组和癌变组分别为25.00%(6/24)和63.16%(12/19),与对照组[1.11%(1/90)]比较差异均有统计学意义(χ2值分别为18.762、57.497,P值均＜0.025).p53基因第5外显子甲基化阳性率在轻、中、重度组分别为55.26%(21/38)、51.16%(22/43)、48.39%(15/31),与对照组[88.88%(80/90)]比较差异有统计学意义(χ2值分别为18.151、23.168、22.420,P值均＜0.017);在非癌变组和癌变组分别为54.17%(13/24)和42.11%(8/19),与对照组[88.88%(80/90)]比较差异有统计学意义(χ2值分别为15.201、22.075,P值均＜0.025).p53基因第5外显子突变率在轻、中、重度组分别为5.26%(2/38)、16.28%(7/43)、25.81%(8/31),中、重度组与对照组(0.00%)比较差异均有统计学意义(χ2值分别为15.465、24.870,P值均＜0.017);在非癌变组和癌变组分别为16.67%(4/24)、31.58%(6/19),与对照组(0.00%)比较差异均有统计学意义(χ2值分别为15.545、30.077,P值均＜0.025).启动子区高甲基化与第5外显子突变相关(列联系数为0.294,P＜0.05);第5外显子低甲基化与第5外显子突变相关(列联系数为0.410,P＜0.05).结论 燃煤砷污染可致人体p53基因启动子区高甲基化、第5外显子低甲基化和突变,上述甲基化改变均与p53基因突变相关联;p53基因甲基化改变可能是砷致p53基因突变以及砷致病或致癌的重要原因之一.
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2011年山东省抗病毒治疗艾滋病患者中HIV毒株耐药基因变异情况
目的 了解2011年山东省抗病毒治疗艾滋病患者中HIV毒株耐药基因的变异情况.方法 于2011年5-10月采集山东省17个地级市758例正在接受抗病毒治疗且治疗时间超过6个月艾滋病患者的抗凝全血,对病毒载量大于1000拷贝/ml的样本进行HIV蛋白酶(PR)全长和部分逆转录酶(RT)基因的RT-PCR和巢式PCR扩增并进行基因序列测定,将序列提交斯坦福大学耐药数据库分析耐药相关突变位点及对各药物的敏感性.结果 病毒未抑制率为9.1％(69/758),共获得53份序列用于耐药基因型分析.23例患者的HIV毒株耐药基因发生突变,总耐药率为3.1％(23/742).核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)的耐药率分别为2.4％(18/742)和3.0％(22/742),此两类药物的主要耐药突变位点分别为M184V和Y181C,未发现对蛋白酶抑制剂(PI)产生耐药的HIV毒株.在23例发生耐药基因突变的研究对象中,78.3％(18/23)的HIV毒株对NRTI产生耐药性,95.7％(22/23)的HIV毒株对NNRTI产生耐药性,73.9％( 17/23)的HIV毒株对NRTI和NNRTI双重耐药.结论 山东省抗病毒治疗艾滋病患者中HIV毒株耐药基因的变异尚处于较低水平,但耐药突变已呈现多样化.
关键词： HIV 抗药性 病毒 突变 高效抗逆转录病毒治疗 -
天津首例输入性人感染H7N9禽流感病例病原特征分析
2013年3月,上海、安徽发生了急性下呼吸道感染,标本经中国疾病预防控制中心鉴定,确认病原为新型H7N9禽流感病毒[1].截至2016年12月11日,共报告人感染H7N9禽流感实验室确诊病例810例,死亡324例,病死率为40%[2],大部分病例发生于我国华南及华东,以及台湾、香港等地区.天津位于我国华北地区,截至2016年6月11日,未报道过人感染H7N9禽流感病例.本研究对天津首例输入性人感染H7N9禽流感病例病原特征进行了分析,以期为疫情防控提供依据.
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利用TaqMan-MGB探针检测A(H3N2)亚型流行性感冒病毒E119V耐药突变
目的 建立快速检测A(H3N2)亚型流行性感冒病毒(简称流感病毒)神经氨酸酶(M)基冈E119V奥司他韦耐药突变位点的双重实时荧光定量逆转录PCR(rRT-PCR)方法.方法 由GenBank获取2000-2012年A(H3N2)亚型流感病毒NA基因序列26条,据此设计特异性靶向NA E119V突变位点的TaqMan-MGB探针进行双重rRT-PCR反应,并利用耐药参考株、临床分离株进行敏感性、特异性和重复性评价.结果 建立了快速检测NA基因E119V位点的双重rRT-PCR检测方法.本方法在A(H3N2)病毒(HA=8)稀释度至10-5仍可检测到荧光信号,病毒滴度的对数与Ct值之间呈线性相关,具有较高的灵敏度；与无耐药突变的A(H3N2)流感病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,两条TaqMan-MGB探针之问不存在交叉反应,具有很高的特异性,并能够检测耐药株和敏感株混合病毒中的耐药突变,在较高浓度的混合病毒中对耐药突变的检测限是5％,在低浓度混合病毒中的检测限是50％.重复性试验得到H3N2-119E和H3N2-119V两组探针批内平均变异系数(CV)值分别为2.32％和0.57％,批间CV值分别为1.77％和0.97％,具有较好的重复性.对其中20株病毒的NA基因序列进行分析,证实这些毒株的NA基因119位点均为谷氨酸(E),表明本研究设计的方法与序列测定结果一致.结论 建立了基于TaqMan-MGB探针检测A(H3N2)亚型流感病毒E119V耐药突变的双重rRT-PCR方法,该方法灵敏、特异、重复性好,实验过程和结果判读简单易操作.
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副溶血弧菌生物膜相关基因突变株的构建
目的 构建副溶血弧菌生物膜相关基因突变株并进行验证.方法 采用PCR方法扩增得到靶基因的上下游同源臂片段,然后以上下游同源臂片段为模板,PCR扩增得到同源臂融合片段.将同源臂融合片段经酶切处理后克隆到自杀质粒pDS132中.通过结合转移的方式将携带有同源臂融合片段的重组质粒转入副溶血弧菌RIMD 2210633中,利用同源重组得到突变株.用PCR方法筛选和鉴定突变株,同时对突变株进行表型分析,从而在分子水平和表型试验上验证突变株是否构建成功.结果 构建得到了分别携带副溶血弧菌生物膜相关基因vbfR、crp、hns、swrZ、swrT、cpsR融合同源臂片段的重组质粒,通过PCR扩增,分别得到了大小为1190、1128、1136、953、1242、1112 bp的片段；用重组质粒构建了相应的突变株(ΔvbfR、Δcrp、△hns、ΔswrZ、ΔswrT和ΔcpsR),进行PCR鉴定时,突变株得到了大小分别为1190、1128、1136、953、1242、1112 bp的扩增产物,比阳性对照分别小610、739、421、542、427、1367 bp;用靶基因内部的引物进行扩增时,无扩增产物；选其中一株突变株Δhns进行生物膜形成能力表型分析,结果表明突变株Δhns生物膜形成量与野生株相比明显增加.结论 构建得到了6株副溶血弧菌生物膜相关基因突变株,并从分子和表型试验上验证了突变株构建正确.
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针灸对小鼠骨髓细胞染色体畸变率、骨髓嗜多染红细胞微核率的影响
目的:研究针灸的抗突变作用.方法:以小鼠为实验动物,以环磷酰胺为诱变剂.随机分正常对照组、模型组、艾灸组、针+灸组.艾灸组艾灸大椎、肾腧穴.针+灸组:小鼠针刺足三里、艾灸关元穴,检测各组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率、骨髓细胞染色体畸变率的差异.结果:模型组与正常对照组比较骨髓细胞染色体畸变率和小鼠骨髓细胞嗜多染红细胞微核率明显升高,而针灸各组与模型组比较明显降低,统计学处理具有显著性差异.结论:针灸可以拮抗由环磷酰胺诱导的小鼠骨髓细胞染色体畸变率和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的升高,针灸具有抗突变作用.
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灸足三里百会治疗变应性鼻炎
变应(过敏)性鼻炎是指以突然和反复发作的鼻痒,喷嚏、流清涕、鼻塞为主要症状的鼻病是耳鼻科的常见病、多发病之一,属中医学鼻鼽范围,本病的发作与体质及环境因素关系密切,可常年发作,亦可季节性发作,或在气侯突变和异气、异物刺激时发作,部分患者可能并发哮喘.笔者采用:灸足三里、百会穴治疗变应性鼻炎.
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黄芪总黄酮抗突变作用实验研究
目的:探讨黄芪总黄酮(TFA)是否具有抗突变作用.方法:设3个浓度的药物组和突变物对照组,采用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验、小鼠睾丸精子畸变实验和体外哺乳类动物细胞V79/HGPRT基因突变试验.
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中国人Wilson病ATP7B基因Arg778Leu/Gln点突变与中医证型的相关性研究
目的:探讨中国人Wilson病(WD)ATP7B基因Arg778Leu/Gln点突变与中医证型的关系.方法:应用PCR技术分别扩增90例WD患者和30名健康人ATP7B基因的第8外显子,其PCR产物行限制性内切酶MspⅠ酶切分析.90例WD患者进行中医辨证分型.结果:90例WD患者有34例Arg778Leu/Gln点突变;WD患者中医辨证分型属肝风内动者Arg778Leu/Gln点突变占20例.结论:Arg778Leu/Gln点突变组患者的发病年龄迟于未见该点突变组的患者,Arg778Leu/Gln点突变可能与中医肝风内动证型相关.
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无偿献血者中隐匿性乙型肝炎病毒感染及表面抗原突变分析
采用多种免疫学检测和核酸检测相结合的方法调查了我国南方某城市无偿献血者中隐匿性乙型肝炎病霉(HBV)感染的存在情况.结果在9 023例乙肝表面抗原(HBsAg)阴性的无偿献血者中,共发现17例HBV DNA阳性,隐匿性HBV感染者的发生率为0.19%(95%CI:0.11～0.30%).序列分析显示其中6例在HBsAg"a"表位(aa124～aa147)存在不同程度氨基酸突变,突变发生率为42.9%(6/14,有3例未扩增出"a"表位片段序列),G145R突变是该地区隐匿性HBV携带者中发生频率高的突变(4/6,66.7%).隐匿性HBV感染者中基因型C的比例(10/17)显著高于HBsAg阳性的HBY感染者(0/15,P<0.01).
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我国常见乙型肝炎病毒基因型与基本核心启动子及前C区突变关系的初步研究
收集81份HBV DNA阳性血清标本,经PCR扩增和序列测定确定其中有50份属于基因型C,31份属于基因型B;C基因型的基本核心启动子BCP T1762/A1764的突变率(38%)明显高于B基因型(12.9%,P＜0.05);前C区A1896的突变在B、C两基因型间无显著性差异,B基因型为9.7%,C基因型为12%,P＞0.05;HBeAg的表达与否与BCP双突变或前C区A1896突变均无明显相关性.经定量PCR检测证明,HBeAg阳性组中的HBV DNA含量明显高于抗-HBe阳性组,P＜0.05.组内BCP双突变株和野生株及前C1896突变株和野生株的HBV DNA含量无显著性差异.
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H5N1亚型禽流感病毒HA糖基化位点缺失突变株的构建及生物学特性
不同H5亚型禽流感(AIV) HA上糖基化位点的分布是不同的,然而不同糖基化位点对病毒的作用仍不十分清楚.本研究利用定点突变和反向遗传操作构建了3个不同糖基化位点单缺失突变病毒,并对其增殖特性和毒力进行了测定.结果表明,通过HA基因序列测定和免疫印迹分析证实已成功去除了特定糖基化位点.158位糖基化位点缺失突变株rS△158在鸡胚中的EID50和MDCK细胞上TCID50比野生型rS略低,空斑直径显著减小;而单独去除169位和290位糖基化位点的rS△169和rS△290的EID50和TCID50略高于野生型rS,空斑直径相近,但空斑数要比后者高出10倍以上.所有突变株及野生型病毒在CEF上增殖速率相同,对SPF鸡均是高致病性的.因此,糖基化位点可影响病毒的体外增殖,但结果因细胞而异.
