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抗性家蝇para基因的选择性剪接和位点突变
为了在分子水平上研究拟除虫菊酯抗性家蝇靶标抗性机制,根据昆虫para型钠通道Ⅱ区S4至S6及Ⅱ与Ⅲ连接区的保守区域,设计简并引物,利用降落RT-PCR,克隆拟除虫菊酯kdr(R品系)家蝇para型钠通道704bp的cDNA,根据此序列用Primer Premier 5.0设计特异引物,分别扩增敏感(SS品系)、 super-kdr(RR品系)家蝇各651bp的cDNA.结果SS无有义突变,R和RR在ⅡS6 CTT到TTT的替换导致Leu 1014到Phe的保守性突变,RR在Ⅱ S 4～5细胞内片段接头处没有与超-kdr抗性相关的Met到Thr突变;另外首次发现kdr(R品系)家蝇在Ⅱ与Ⅲ连接区出现39bp的选择性剪接,构成家蝇para钠通道亚型(命名为xych,GenBank登陆号为AF411452).
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自然种群淡色库蚊钠通道基因全长的克隆及序列分析
本研究采用反转录多聚酶链式反应（ RT-PCR）的方法对野外采集的河北种群淡色库蚊的钠离子通道基因进行了克隆和序列分析。得到的克隆序列与GenBank中公布的序列能够吻合，说明成功克隆出淡色库蚊的钠通道基因全长，为抗性突变的研究奠定了基础。本研究在淡色库蚊钠通道基因上发现了多处氨基酸突变（A32T、 T336A、 S342P、 K535E、 L1035F、 N1595S和F1982L）和7处可变剪接。其中，包括经典的抗性突变L1014F （ L1035F）。但这些突变和可变剪接与蚊虫抗性的关系有待进一步研究。
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北京地区德国小蠊(Blattela germanica)对氯菊酯抗性相关的钠通道基因点突变的研究
应用RT-PCR扩增技术,克隆了北京地区自然种群德国小蠊(Blattela germanica)的钠离子通道基因片段,片段长度为162bp,并对其进行了测序.将推导的氨基酸序列与德国小蠊敏感品系的相应序列进行比较,发现在钠离子通道ⅡS4-ⅡS6的993同源位点上存在ku(TTG)→Phe(TTC)突变,表明该品系的抗药性可能与击倒抗性(knockdown resistance,kdr)有关.
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离子通道病研究的现状和展望
离子通道(ion channels)在细胞分子水平对维持机体的正常生理功能至关重要.当离子通道由于某些先天性的或后天获得性的原因导致其结构和(或)功能发生改变时,其所承载的功能必将发生异常,从而可能导致离子通道病(channelopathy)的发生.作为近年新兴的一门交叉型前沿学科,目前离子通道病的研究模型和方法日渐完善,对于离子通道病的研究不仅为这类疾病的早期诊断和治疗提供了基础,并且将有助于对某些离子通道功能的进一步认识和了解.
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钠通道基因SCN5A突变与扩张型心肌病
心脏钠通道基因SCN5A突变可以导致多种心律失常,近年研究发现该基因突变与扩张型心肌病也有关,但致病机制不甚清楚.本文通过比较与扩张型心肌病有关的多个已发现SCN5A突变的电生理特点,提出该基因突变可能通过改变细胞内钠浓度来影响细胞内钙稳态而导致扩张型心肌病;新近发现的A1180V突变携带者表现出的异常心电图,很可能为某些扩张型心肌病患者进行早期诊断,提供一种有效而简便的方法.
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蛋白脂蛋白1基因突变对少突胶质细胞功能的影响
蛋白脂蛋白1(PLP1)相关性疾病是X连锁隐性遗传的一类中枢神经系统髓鞘形成障碍性疾病谱系,致病基因为PLP1,在这类疾病谱系中基因型与表型存在明显的相关性.PLP1蛋白在少突胶质细胞表达,是髓鞘形成相关蛋白.新近研究表明PLP1不同突变类型通过不同的机制使得少突胶质细胞功能障碍,从而影响髓鞘正常发生发展过程,进而改变了突触功能与信息传导通路,终导致疾病的发生.在分子水平上探讨PLP1突变对少突胶质细胞功能影响可以阐明其可能的分子机制,这些研究结果将有可能了解本病及类似疾病的共同发生机制,并为它们的治疗提供新的靶点,也为早期干预提供理论依据.
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高分辨率熔解曲线分析幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药gyrA基因突变的研究
目的 优化和建立PCR-高分辨率熔解曲线(HRM)的方法,分析幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药基因gyrA基因突变,为临床选择个体化的幽门螺杆菌根除方案提供帮助.方法 收集2013年5月至2013年10月南通大学附属东台医院消化内科进行胃内窥镜检查的45例消化性溃疡患者的胃黏膜组织,微需氧条件(5%O2、10%CO2、85%N2)下培养出23株幽门螺杆菌临床分离菌株,采用E-test法进行左氧氟沙星药敏试验.提取患者胃黏膜组织和临床分离菌株DNA,PCR扩增gyrA基因部分片段后进行序列分析,采用PCR-HRM分析gyrA基因突变.结果 左氧氟沙星的耐药率为47.8%(11/23).11株耐药菌株中10株菌株gyrA基因发生突变,突变形式主要为C261A、G271T、A272G+G514A.9.1%(1/11)耐药菌株和所有敏感菌株gyrA基因均未发生突变.PCR-HRM方法的特异度和重复性均为100%,低检测限为102 copies/μl.结论 PCR-HRM方法能准确、快速检测幽门螺杆菌gyrA基因突变.
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碳青霉烯类抗生素诱导耐药铜绿假单胞菌外膜蛋白D2表达与编码基因多点突变
目的 探讨对碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌编码外膜蛋白D2(OprD2)基因变异与OprD2表达的关系.方法 由临床分离敏感铜绿假单胞菌,使用不同浓度亚胺培南与美罗培南含药琼脂平板法筛选耐药菌株.应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、凝胶成像系统分析OprD2.应用聚合酶链反应及测序分析OprD2基因编码区.结果 人工诱导能产生出与临床分离株一样的对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株.在SDS-PAGE图谱上亚胺培南与美罗培南耐药株与同源敏感株相比均有OprD2的减少.测序结果显示在多株耐药菌中,OprD2基因编码区3个基因位点同时出现碱基突变:在+84位点产生突变,胞嘧啶突变为胸腺嘧啶(C→T);在+401位点突变(C→A),造成第134位氨基酸苏氨酸突变为天冬氨酸(Thr→Asp);在+959位点突变(A→G),造成第320位氨基酸赖氨酸突变为精氨酸(Lys→Arg).结论 同时出现3个或更多的碱基点突变可能导致铜绿假单胞萧OprD2缺失或表达减少,可能是对碳青霉烯类抗生素产生耐药性的原因.
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Prostasin基因与高血压关系的研究进展
原发性高血压是环境因素与遗传因素相互作用所引起的多基因、多因素疾病.1990年Yang等[1]从分子水平揭示了原发性高血压可能的发病机制,认为人类可能存在多种原发性高血压易感基因,这些基因的突变、缺失、重排和表达水平的差异可能是导致原发性高血压的基础.
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一种BRAF基因突变检测方法的建立
目的 建立一种适用于临床样品检测的BRAF基因V600E突变的检测方法.方法 利用已知BRAF基因野生型、突变型样品,以BRAF基因15外显子V600E突变为靶位点设计特异性扩增引物和测序引物,建立BRAF基因V600E突变的SYRB Green PCR-Sanger测序检测方法,并对该方法进行方法学评价和21例结直肠癌临床样品检测.结果 成功建立了BRAF基因V600E突变SYRB GreenPCR-Sanger测序检测方法,该方法的灵敏度达5.0×101拷贝/ul,检测线性范围5×101～ 5×107拷贝/ul,且检测的重复性好.检测21例结直肠癌临床样品,突变率为9.5％(2/21).结论 成功建立了BRAF基因V600E突变SYRB Green PCR-Sanger测序检测方法,该方法可用于临床样品的检测.
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表达Cys548雌激素受体突变型cDNA的真核载体构建及其促转录活性分析
目的 考察一个548位点C→T单核苷酸突变的雌激素受体(ER)在体外条件下,对乳腺癌细胞株(MCF-7)信号通路的影响,以探讨ER单核苷酸突变引起非雌激素依赖性性早熟的可能机制.方法 用重叠延伸PCR定点诱变技术对548位点的碱基进行定点突变.构建定点突变表达载体pSG5-MuER.构建含雌激素受体反应元件(ERE)的萤光素酶报告基因载体pGL3-ERE-Luc.将野生和突变ER质粒分别和pGL3-ERE-Luc共转染MCF-7细胞,观察萤光素酶的变化,以检测突变ER反应活性的变化.结果 成功构建ER突变质粒psG5-MuER和ER报告质粒pGL3-ERE-Luc,psG5-MuER较pSG5-ER能够增加萤光素酶的产生.结论 该突变雌激素受体在体外具有高促转录活性特征,构建的载体可用于进行进一步的相关研究.
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富氢水和乳果糖对环磷酰胺处理小鼠的抗突变作用
目的 探讨饮用富氢水和产氢营养因子乳果糖的抗突变作用.方法 36只昆明小鼠按随机数字表分为6组,每组6只.空白对照组(A组)、富氢水处理组(B组)和乳果糖处理组(C组):这3组小鼠正常喂养3d后,第4～6天分别使用蒸馏水、富氢水、50％乳果糖灌胃(20 ml/kg、1次/d);抗生素对照组(D组)、抗生素+富氢水处理组(E组)和抗生素+乳果糖处理组(F组):这3组小鼠第1～3天随意饮用含抗生素的水,第4～6天分别使用蒸馏水、富氢水、50％乳果糖灌胃(20 ml/kg、1次/d).末次灌胃后小鼠腹腔注射环磷酰胺(0.04 g/kg),24 h后处死小鼠,进行骨髓细胞学检查,计算各组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率.结果 A、B、C、D、E、F组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率分别为(16.00±0.67)‰、(15.11±0.25)‰、(10.17±0.35)‰、(22.39±0.51)‰、(15.44±0.44)‰、(18.67±0.37)‰.与A组比较,C组微核率显著减少,D组微核率显著增加(均P＜0.01).与D组比较,E组和F组微核率显著减少(均P＜o.o1).与C组比较,F组微核率显著增加(P＜0.01).结论 富氢水和乳果糖均可拮抗环磷酰胺的致突变作用,抗生素预处理可以显著降低乳果糖的抗突变作用.
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MED12基因突变与子宫平滑肌瘤发病关系的荟萃分析
目的 探讨MED12基因突变与子宫平滑肌瘤发病的关系.方法 检索1995年7月-2013年1月Medline、EMBASE、Ovid、Springer数据库、Cochrane图书馆收录的英文文献,以及1994年1月-2013年1月中国知网全文数据库(CNKI)和1978年1月-2013年1月中国生物医学文献数据库(CBMdisc)收录的中文文献.选择研究子宫肌瘤MED12基因突变情况的文献,探讨MED12基因突变与子宫平滑肌瘤发病的关系,分析不同人种子宫肌瘤MED12突变的情况和MED12突变类型在不同地区的分布.结果 纳入研究9篇文献合并分析共计641例患者,MED12基因突变率为64.90％(416/641),非子宫平滑肌瘤的对照组为0.79％(17/2146),差异有统计学意义(x2=1 540.848,P＜0.001).MED12突变是子宫肌瘤发病的危险因素(OR=61.83,95％CI:33.82～ 113.03).不同人种合并分析显示,白人的MED12基因突变率为68.99％(238/345),黑人为62.75％(32/51),黄种人为63.39％(71/112),不同人种间的突变率比较差异无统计学意义(均P＞0.05).不同地区人群子宫肌瘤MED12基因突变率合并分析显示,亚洲人群突变率为63.39％(71/112),欧洲人群突变率为65.29％(222/340),美洲人群突变率为67.70％(109/161),非洲人群突变率为50.00％ (14/28),非洲人群的突变率低于欧洲、美洲人群(均P＜0.05).结论 MED12基因突变与子宫平滑肌瘤发病危险有关,突变情况与种族无关,部分地区MED12基因突变率存在差异.
关键词： 肌瘤 子宫 RNA聚合酶Ⅱ转录调节物12 突变 Meta分析 -
乳腺增生病p53基因第7外显子突变检测
目的探讨p53基因在乳腺癌发生早期的作用及早期诊断乳腺癌的分子病理指标.方法用PCR-SSCP法检测36例乳腺单纯性增生、31例不典型增生、14例原位癌和16例浸润癌中p53基因第7外显子突变,并用DNA直接测序技术确定突变的碱基及其所在的密码子.结果乳腺单纯性增生、不典型增生、原位癌、浸润癌中p53基因第7外显子的突变率分别为0%、6.5%(2/31)、21.4%(3/14)、18.8%(3/16).8例突变中,3例发生于251密码子,4例发生于248密码子,1例发生于236密码子.表现为碱基替换(5例)、缺失(2例)、插入(1例)共三种突变方式.并在1例原位癌中首次发现了251密码子的同义突变(ATC→ATT,异亮氨酸→异亮氨酸).结论乳腺癌不典型增生中存在p53基因第7外显子突变,该突变可能在乳腺不典型增生发展到乳腺癌的过程中起重要作用,可作为早期诊断乳腺癌的辅助指标.
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人卵巢浆液性及黏液性交界性肿瘤中k-ras基因第12、13密码子突变分析
目的 探讨k-ras基因在卵巢浆液性及黏液性交界性肿瘤发病过程中的作用.方法 选用k-ras基因高频突变区引物1对,对53例卵巢肿瘤(包括15例浆液性典型交界瘤、7例浆液性微乳头型交界瘤、14例浆液性经典型癌、14例黏液性交界瘤、3例黏液性癌)用显微切割方法提取肿瘤细胞DNA,进行聚合酶链反应(PCR),直接测序分析PCR产物.结果 在14例黏液性交界瘤中有3例检测到了k-ras基因突变,在黏液性癌及所有浆液性肿瘤中均未发现k-ras基因突变.结论 k-ras基因突变在卵巢黏液性交界瘤的发生过程中可能有一定作用,在黏液性癌、浆液性交界瘤及经典型癌中的作用尚不明确.
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非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变与临床病理相关性研究
目的 探讨中国人群非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的临床病理学意义.方法 采用荧光定量PCR法检测347例NSCLC患者癌组织中EGFR基因18、19、20、21号外显子突变状况,分析EGFR突变与临床病理学之间的关系.结果 受检347例NSCLC样本中,检测出EGFR基因突变位点147个,发生在137例样本中(39.5％),其中18号外显子占总突变6.8％,19号外显子占40.1％,21号外显子占44.9％,20号外显子占8.2％,发现外显子存在同时突变的样本10例.其中女性患者突变率(56.5％)显著高于男性患者(25.9％),二者中差异极显著(P＜0.01).腺癌中变率为44.5％,鳞癌突变率为3％,低分化癌(非小细胞肺癌未分类)突变率为30.8％,腺鳞癌突变率为25％.腺癌EGFR突变率高于非腺癌(8/57),二者差异极显著(P＜0.01).年龄大小和取样不同与EGFR基因突变率无明显相关性.结论 NSCLC中EGFR基因突变常见于女性、腺癌,以第19号外显子缺失突变和第21号外显子点突变为主;利用荧光PCR法检测手术切除和穿刺活检样本突变率无明显差异,可有效用于EGFR基因突变检测.
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弥漫性大B细胞性淋巴瘤中CARMA1基因突变的检测及意义
目的 了解CARMA1基因在弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)中的突变情况,及其与DLBCL临床病理特征的关系.方法 采用免疫组化方法检测54例DLBCL中CD10、bcl-6、mum-1和Ki-67表达情况以确定DLBCL细胞来源及增殖活性;进行石蜡组织DNA的提取.聚合酶链反应(PCR)扩增CARMA1基因外显子5、6、7、8、9,DNA直接测序检测其突变情况,并进行临床资料分析及随访.结果 54例DLBCL标本中有4例发生错义突变(7.4％),突变位点为第8外显子的110850碱基处,G突变为A.4例均为结外(胃肠)DLBCL,其中1例为GCB-DLBCL(5％),3例为ABC-DLBCL(8.8％).4例Ⅳ期3例,Ⅲ期1例,均浸润消化道全层并累及肠外脂肪组织,1例并出现淋巴结受累.LDH均升高,国际预后指数(IPI)3例为4分(高危),1例为3分(中高危);4例中3例死亡,有2例存活时间仅2年.结论 在少部分DLBCL中存在CARMA1基因的错义突变,且该突变可能与DLBCL的不良预后有关.
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非小细胞肺癌中EGFR和K-ras基因突变检测分析与病理特征的关系
目的 探讨不同分型非小细胞肺癌的EGFR与K-ras基因突变及其相关病理特征的关系.方法 基因测序方法检测260例非小细胞肺肿瘤患者肿瘤组织中的EGFR(18,19,20,21外显子)和K-ras(12,13,61密码子)基因的突变.结果 260例样本中,EGFR基因突变检出率为48.8％ (127/260),突变主要集中在19号外显子的缺失和21号外显子的点突变.K-ras基因突变检出率为10％ (26/260),其中12、13和61密码子均发现突变.受检的所有样本中没有发现EGFR与K-ras基因同时出现突变的情况.腺癌的EGFR突变检出率明显高于鳞状细胞癌等其他组织类型.在分化程度上,高分化与中分化癌基因突变检出率和中分化与低分化突变检出率比较差异显著(P＜0.01).EGFR突变与有无淋巴结转移无关(P＞0.05).K-ras基因突变与组织类型、患者性别、分化程度、有无淋巴结转移间无相关性.结论 非小细胞肺癌EGFR基因突变检出率较高,K-ras基因突变检出率较低,且两种突变并不同时出现.EGFR基因突变与性别、肺癌组织类型、分化程度有关,存在多种突变.
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脑星形胶质细胞瘤中PTEN基因缺失、突变意义的探讨
目的探讨人脑星形胶质细胞瘤中PTEN基因缺失、突变的意义.方法从32例人脑星形胶质细胞瘤组织中抽提RNA,经RT-PCR同管共扩增PTEN基因和GAPDH基因,计算机凝胶图像分析系统计算PTEN的相对表达量,同时采用PCR-SSCP法检测PTEN基因突变.结果本组星形胶质细胞瘤中PTEN缺失率为12.5%(4/32),均为肿瘤Ⅳ级,占Ⅳ级肿瘤的40%(4/10);PTEN相对表达量Ⅳ级(0.8323)显著低于Ⅱ(4.3533)、Ⅲ级(2.4487)(P＜0.01).PTEN突变率为10.7%(3/28),主要分布在肿瘤Ⅲ级5%(1/20)和Ⅳ级33.3%(2/6)中.PTEN的缺失和突变总检出率为21.9%(7/32),占Ⅳ级星形胶质细胞瘤60%(6/10).结论PTEN基因缺失和突变是星形胶质细胞瘤从低级别向高级别进展的晚期基因事件,特别在Ⅳ级中PTEN缺失与突变是常见的分子现象.
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RET原癌基因c.1901G＞A突变遗传性甲状腺髓样癌1例报道
甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)发病率低,占甲状腺恶性肿瘤1％ ～ 2％[1].MTC分为散发型和遗传型,遗传型为常染色体显性遗传,发病与RET原癌基因突变密切相关[2].现报道1例家族性髓样癌,分析其临床病理特征、诊断与鉴别诊断、RET基因检测结果及治疗与预后并复习相关文献.
