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正交试验法优选莲子心提取物制备工艺
目的 采用正交试验法优选莲子心提取物的制备工艺.方法 采用RP-HPLC法测定莲子心提取物中的甲基莲心碱含量,填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶,以乙腈∶ 0.015 mol/L十二烷基磺酸钠溶液∶冰醋酸(68∶ 31∶ 1)为流动相,柱温25℃,检测波长282 nm,流速1.0 mL/min,进样量为20 μL;采用L9(34)正交试验设计,以甲基莲心碱的提取含量作为考察指标,确定佳工艺.结果 所考察的4个因素中,乙醇浓度和回流次数有显著意义;对甲基莲心碱含量影响顺序为:乙醇浓度＞回流次数＞乙醇用量＞回流时间.佳制备工艺为:用10倍量浓度为75%的乙醇回流3次,每次提取1 h.结论 RP-HPLC法测定莲子心提取物中甲基莲心碱,方法 简便,快速,线性关系良好,为莲子心提取物质量控制及工艺优化提供了可靠的检测手段;所得到的提取工艺简便,合理可行.
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RP-HPLC同时测定莲心总碱中的3种生物碱含量
目的:建立同时测定莲子心中莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱含量的反相高效液相色谱法.方法:以Hypsil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)为固定相,甲醇-磷酸盐缓冲液(73∶27,pH 9.0)为流动相,检测波长为286 nm及230 nm,流速1 mL·min-1.结果:3种生物碱分离良好,在20～700 μg·mL-1线性关系良好,日内、日间RSD在0.24%～4.83%,3种生物碱的加样回收率分别为97.9%,98.4%,98.1%.利用该方法测定了不同批次不同方法提取的莲心总碱中3种生物碱含量,结果显示莲心总碱的甲醇提取方法优于乙醇提取方法.结论:本法简单、快捷、适合于测定莲子心中莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱的含量.
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甲基莲心碱对LPC诱导内皮细胞损伤的保护作用及与ADMA的关系
目的:观察甲基莲心碱对溶血性磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)诱导血管内皮细胞损伤的保护作用及其与非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)的关系.方法:10 mg·L-1的LPC孵育人脐静脉内皮细胞株(HUVEC-12)24 h或0.1,1.0,10.0 μmol·L-1甲基莲心碱预处理HUVEC-12细胞1 h,再予LPC孵育细胞24 h,收集细胞卜清液测定一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA),ADMA含量和收集细胞测定细胞内活性氧(ROS)水平.结果:LPC孵育HUVEC-12细胞24 h后细胞上清液中MDA,ADMA含量及细胞内ROS水平显著性增加(P<0.05),细胞上清液中NO含量显著性降低(P<0.05);0.1,1.0,10.0μ mol·L-1的甲基莲心碱预处理组ROS水平,MDA,ADMA含量显著降低,NO含量显著性升高(P<0.05).结论:甲基莲心碱对LPC诱导的血管内皮细胞损伤有保护作用,该作用可能与其降低ADMA水平有关.
关键词： 甲基莲心碱 内皮细胞 溶血性磷脂酰胆碱 非对称性二甲基精氨酸 脂质过氧化 -
甲基莲心碱对肝星状细胞Collagen-Ⅰ,TIMP-1及MMP-2的影响
目的:观察甲基莲心碱对肝星状细胞Collagen-I,TIMP-1及MMP-2 mRNA表达及蛋白分泌的影响.方法:体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,随机分为5组:对照组、血小板衍生因子(PDGF)组、甲基莲心碱低、中、高剂量组(2,6,10 μmol.L-1).分别加入各组药物培养48 h后,收集细胞提取总RNA,采用RT-PCR检测Collagen-I,TIMP-1及MMP-2 mRNA表达,并收集细胞上清液采用ELISA检测3个因子的蛋白含量.结果:与对照组相比,PDGF可明显增加肝星状细胞Collagen-I,TMIP-1及MMP2 mRNA表达及蛋白分泌.与PDGF组相比,甲基莲心碱中、高剂量组Collagen-I及TMIP-1 mRNA表达及蛋白分泌明显减少,且随着浓度的增加,减少更明显,而甲基莲心碱低剂量组Collagen-I及TMIP-1表达及分泌无明显变化.与PDGF组相比,甲基莲心碱3个剂量组的MMP-2 mRNA表达及蛋白分泌均无明显变化.结论:甲基莲心碱可抑制PDGF诱导的HSC的Collagen-I和TIMP-1的mRNA表达及蛋白分泌,且随浓度的增加,抑制作用加强,但对MMP-2的表达及分泌无明显影响.
关键词： 肝星状细胞 甲基莲心碱 Collagen-Ⅰ TIMP-1 MMP-2 -
小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对HERG通道表达的影响
目的:利用免疫荧光化学染色法和Western blot法分别定性、定量地检测不同浓度的小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对稳定转染在HEK-293细胞中HERG钾通道表达的影响,以及不同浓度的小檗碱对大鼠心肌组织Ikr通道蛋白表达的影响,探讨小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱的抗心律失常机制.方法:Western blot法检测HERG-HEK细胞上HERG通道蛋白的表达；免疫荧光化学染色法并利用共聚焦显微镜定性测定不同浓度的小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对HERG通道蛋白表达的影响；Western blot法定量检测不同浓度的小檗碱对大鼠心肌组织Ikr通道蛋白表达的影响以及小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对稳定转染在HEK-293细胞中HERG钾通道蛋白表达的影响.结果:Western blot法检测稳定转染有HERG基因的HEK293细胞能高水平的表达HERG通道蛋白.10,30μmol· L-1的小檗碱明显抑制HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达(P＜0.0l).10,20 mg·kg-1的小檗碱抑制大鼠心肌组织Ikr通道蛋白的表达(P＜0.05).3,10,30μmol·L-1的莲心碱促进HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达(P＜0.05).甲基莲心碱不影响HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达.结论:稳定转染的HERG-HEK细胞能高水平的表达HERG通道蛋白；小檗碱对体外HERG-HEK细胞和大鼠心肌组织Ikr通道的蛋白表达均有抑制作用；莲心碱促进HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达；甲基莲心碱对HERG通道蛋白表达无影响.
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影响莲心总碱中甲基莲心碱稳定性因素的试验研究
莲心总碱是从中药莲子心中提取的总生物碱,主要为莲心碱(liensinine)、异莲心碱(isoliensinine)及甲基连心碱(neferine),其中甲基莲心碱含量高[1],它们的主要药理作用有降血压、抗心律失常、抗心肌缺血、抗血小板聚集等[2-4].
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甲基莲心碱增强蒽环类药物对K562/A02 细胞增殖抑制作用实验研究
目的比较甲基莲心碱体外对三种不同蒽环类抗肿瘤药物的化疗增敏作用.方法利用MTT法观察甲基莲心碱合用表阿霉素或柔红霉素或吡喃阿霉素处理K562/A02细胞后细胞增殖的变化.结果吡喃阿霉素合用甲基莲心碱处理细胞后,与同浓度的表阿霉素或柔红霉素合用甲基莲心碱比较,前者对K562/A02细胞的抑制率明显高于后者(P＜0.01).结论甲基莲心碱对三种不同的蒽环类抗肿瘤药物均具有化疗增敏作用,而甲基莲心碱能更好地增强吡喃阿霉素对K562/A02细胞的抗肿瘤作用.
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正交实验优选莲子心提取工艺
目的优选莲子心的佳提取工艺条件.方法以甲基莲心碱转移率为评价指标,采用正交实验法对莲子心的提取工艺进行优选.结果佳提取工艺条件为:莲子心药材用70%的乙醇回流提取2次,第1次6倍量,回流30min,第2次4倍量,回流30min.结论优选出的工艺科学合理.
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HPLC法测定莲子心提取物及其胶囊剂中三种主要生物碱的含量
目的 建立HPLC法同时测定莲子心提取物中莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱的含量.方法 采用Hedera ODS-2色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:甲醇-0.05％三乙胺溶液(72.5∶27.5);检测波长:283 nm;柱温:25 c℃;流速:1.0ml ·min-1.结果 3种生物碱分离良好,莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱分别在3.92 ～ 117.60、3.84～ 115.20、5.44～ 163.20μg ·ml-1范围内呈现良好的线性关系.利用该法测定莲子心提取物及其胶囊剂中生物碱的含量,平均总碱含量高于76％.结论 该测定方法准确性高、重复性好、专属性高,可用于同时测定莲子心提取物及其胶囊剂中莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱的含量.
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粉防己碱、甲基莲心碱和蝙蝠葛碱增强长春新碱诱导人乳腺癌MCF-7多药耐药细胞凋亡
目的 观察粉防己碱、甲基莲心碱和蝙蝠葛碱与长春新碱合用对多药耐药肿瘤细胞诱导凋亡的作用。方法 采用荧光染料Hoechst 33342和碘化丙锭联染技术、流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳技术，检测长春新碱及其与上述单体合用诱导耐药株瘤细胞MCF-7/Dox的凋亡程度。结果 单用长春新碱可引起约10%细胞凋亡，而长春新碱与粉防己碱、甲基莲心碱或蝙蝠葛碱合用明显地增加细胞凋亡的百分率，其中粉防己碱的作用强。联合用药的细胞凋亡数显著地大于单用长春新碱的作用。结论 粉防己碱、甲基莲心碱和蝙蝠葛碱均有明显的增强长春新碱诱导人乳腺癌MCF-7多药耐药细胞的凋亡作用。
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甲基莲心碱在大鼠肝脏中的代谢产物及其途径
大鼠灌胃给予甲基莲心碱20 mg·kg-1,采用液相色谱-串联质谱联用法对大鼠肝脏中的代谢产物进行分析;并建立肝微粒体温浴及NADPH再生体系,采用高效液相色谱.紫外检测法研究CYP450亚型的特异性抑制剂对甲基莲心碱体外代谢的影响.在正离子检测方式下,除甲基莲心碱外共检测到4种代谢产物M1、M2(主要代谢产物)、M3和M4.其中,M2和M4通过与对照品的色谱和质谱比对,确认为莲心碱和异莲心碱,而M1和M3可能为去甲基莲心碱和去甲基异莲心碱.CYP3A1的特异性抑制剂酮康唑和CYP2D1的特异性抑制剂奎尼丁均可抑制甲基莲心碱在肝微粒体温孵液中的代谢,其主要代谢产物莲心碱的生成抑制率分别为25.7%和80.5%.因此提示,甲基莲心碱在肝脏中的主要代谢途径是苄基和喹啉环上的甲氧基脱甲基化,其主要代谢物为莲心碱,CYP2D1和CYP3A1均参与了其生物转化.
关键词： 甲基莲心碱 高效液相色谱法 液相色谱-串联质谱法 代谢产物 微粒体 -
甲基莲心碱对AngⅡ诱导血管平滑肌细胞增殖及ERK/NF-κB通路的影响
目的:观察甲基莲心碱(neferine,Nef)对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)诱导的血管平滑肌细胞增殖及ERK/NF-κB通路的影响.方法:培养Wistar大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),MTT比色法及流式细胞术测定Nef对血管平滑肌细胞抑制增殖率;考马斯亮蓝法测定蛋白含量;免疫印记法测定p-ERK1/2,NF-κB(p65)及其抑制物(Ⅰ-κBα)表达.结果:Nef能显著抑制Ang Ⅱ诱导的VSMC增殖;抑制VSMC胞核NF-κB(p65)表达,同时抑制胞浆Ⅰ-κBα磷酸化及p-ERK1/2表达.结论:Nef明显抑制Ang Ⅱ诱导的VSMC增殖,机制与下调ERK/NF-κB通路有关.
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对《中国药典》2015年版一部莲子心含量测定方法的改进
目的:改进并优化莲子心中有效组分莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱的含量测定方法.方法:80％乙醇浸泡30 min,超声处理30 min进行提取,采用TSKgelODS-100V(4.6 mm×250 mm,5μm)柱;流动相为乙腈-0.015 mol·L-1十二烷基磺酸钠溶液(取十二烷基磺酸钠0.41 g,加水100 mL使溶解)-冰醋酸(54∶ 45∶1);流速1.0 mL·min-1;检测波长230 nm,柱温35℃.异莲心碱、甲基莲心碱含量以莲心碱计.结果:莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱能得到较好分离.进样量在0.050 04 ～1.251 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,r =1.000 0(n=7),平均回收率为88.6％,RSD=1.5％ (n =6).修改后方法对莲心碱的提取率是药典方法的192％.结论:本法比药典方法提取率高,所用试剂毒性小且操作简便,HPLC图谱分离好,测定准确、稳定、重复性好,可用于市售莲子心的质量评价.
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甲基莲心碱对LPS诱导人脐血管内皮细胞损伤中NF-KB信号通路及相关因子表达的影响
目的 观察甲基莲心碱对LPS诱导的与平滑肌细胞共培养的人脐血管内皮细胞中NF-κB信号通路及相关黏附因子的表达的影响,探讨甲基莲心碱抗动脉粥样硬化的分子机制.方法 Transwell板建立人脐血管内皮细胞及平滑肌细胞共培养体系后,通过脂多糖(LPS)建立损伤模型,分别用含梯度浓度(0、0.1、0.3、1、3μmol·L-1)甲基莲心碱的培养液培养24 h.采用免疫印迹法(Western blot)检测人脐血管内皮细胞(HUVECs)内NF-κB信号通路相关蛋白表达的变化;采用实时荧光定量PCR方法检测黏附因子TNF-α和细胞间黏附因子-1(ICAM-1) mRNA的相对表达.结果 在甲基莲心碱干预LPS诱导损伤的VEC-SMC共培养体系后,降低了NF-κB p65的表达,提高IκB-α的表达;下调TNF-α和ICAM-1相关炎性因子的表达,且成—定的浓度依赖性.结论 甲基莲心碱通过抑制血管内皮细胞NF-κB信号通路,下调相关炎性因子的表达,减少炎症反应,从而抗动脉粥样硬化.
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发展基于活细胞的FlexStation3高通量钙荧光方法及筛选TRPV3通道抑制剂
为了建立高通量筛选TRPV3通道调节剂的方法,本研究利用FlexStation3酶标仪,针对瞬时转染TRPV3通道的HEK293T细胞的密度、Cal-520染料的浓度及染料孵育时间进行了条件优化.结果显示,40 000个细胞/孔、5.0％的Cal-520染料浓度及1.5 h的染料孵育时间为佳实验条件.应用该筛选方法,筛选并发现来源于睡莲科植物的有效成分甲基莲心碱(neferine)能够抑制TRPV3通道,该抑制作用经全细胞膜片钳实验证实并测得其IC50为24.5±4.1 μM(n=6).对其它TRPV通道成员的选择性电生理学评价结果显示,甲基莲心碱对TRPVl和TRPV4通道无抑制作用.总之,实验数据显示,FlexStation3高通量钙荧光筛选可以用于发现TRPV3以及其他TRP通道的调节剂,筛选发现的天然产物甲基莲心碱可以作为TRPV3通道的工具药研究通道的药理学功能.
关键词： TRPV3通道抑制剂 甲基莲心碱 FlexStation3 全细胞膜片钳 钙离子 -
甲基莲心碱对阿霉素药动学影响
阿霉素是一种蒽环类广谱抗肿瘤药物,用于治疗白血病、肝癌,乳腺癌等实体肿瘤.本研究的目的是探讨甲基莲心碱对阿霉素药动学影响.通过高效液相色谱法测定阿霉素的血浆和组织中的药物浓度,运用C18反相色谱柱进行分离,流动相是乙腈:磷酸水溶液比例为30∶70,流速为1 mL/min,检测波长为233 nm.药代动力学研究发现给予甲基莲心碱明显影响阿霉素的药动学.与对照组比较甲基莲心碱预处理组的AUC,CL和t1/2β明显改变.组织分布表明:心脏、肝脏和肾脏中的药物浓度在0.5和2小时明显高于阿霉素单独组药物浓度.甲基莲心碱预处理组与阿霉素组比较脾脏和肺脏药物浓度轻微的增加,但没有显著性差异.因此,当阿霉素与甲基莲心碱联用时应该考虑阿霉素的给药剂量.
关键词： 甲基莲心碱 阿霉素 药代动力学 高效液相色谱法 蒽环类广谱抗肿瘤药物 -
甲基莲心碱对肝星状细胞抑制增殖及促凋亡作用
目的 观察甲基莲心碱对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的抑制增殖及促凋亡作用,探索甲基莲心碱抗肝纤维化的分子机制.方法体外培养HSC-T6细胞,用不同浓度甲基莲心碱作用于HSC-T6,CCK-8试剂盒(cell counting Kit -8)法检测细胞增殖抑制率,半定量反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测与凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2 mRNA的表达.结果 甲基莲心碱不同浓度处理组对HSC-T6抑制增殖率均有显著统计学差异(P＜0.001),呈剂量依赖性,IC50为6.820±0.415μmol/L.甲基莲心碱不同浓度处理组Bax mRNA表达上调,Bcl-2 mRNA表达下调,与空白对照组比较有统计学差异(P＜0.005).结论 甲基莲心碱可抑制肝星状细胞增殖、上调Bax和下调Bcl-2的mRNA表达,通过线粒体凋亡途径促其凋亡,是一种有效作用肝星状细胞的药物,为其改善肝纤维化提供理论依据.
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莲心季铵碱的结构解析与鉴定
莲子心为睡莲科莲属植物莲Nelumbo nuciferaGaertn种子的幼叶及胚根收载于2000年版<中华人民共和国药典>Ⅰ部.莲子心味苦性寒,具有清心去热、固肾涩精的功效,用于心烦,目赤肿痛,遗精等症的治疗.临床报道其清心火、平肝火、泻胃火、降肺火,可治疗老年人心烦失眠、青年人心火亢盛的高血压.莲子心主要含有莲心碱(liensinine)、异莲心碱(isoliensinine)、甲基莲心碱(neferine)[1]、莲心季铵碱(lotusine)、荷叶碱(nuciferine)和前荷叶碱(pronuciferine)[2,3]等,均为异喹啉类生物碱.
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甲基莲心碱对有机磷酸酯抑制的小鼠脑胆碱酯酶的重活化作用
目的研究甲基莲心碱(Nef)对有机磷酸酯中毒小鼠脑胆碱酯酶(ChE)的重活化效应.方法采用微量二巯基双硝基苯甲酸(DTNB)法测定敌敌畏(DDVP)体内、体外抑制小鼠脑ChE活力,观察0.001～0.03 mg/LDDVP在体外对小鼠脑ChE活力的抑制作用,比较Nef和氯磷定体内、体外给药对DDVP中毒小鼠脑ChE的重活化效应.结果不同浓度的DDVP显著地抑制试管内小鼠脑ChE活力,呈现明确的量效关系,IC50为0.003 mg/L.Nef(2.4,4.8 mg/L)与氯磷定(5,12.5 mg/L)对0.02 mg/LDDVP体外抑制的小鼠脑ChE重活化效应随着浓度增高而加大.对sc DDVP(10 mg/kg)的小鼠分别ip Nef或氯磷定,其脑ChE活率分别为(41.6±10.9)%、(56.5士12.4)%(Nef 15,30 mg/kg)和(24.1士17.4)%、(28.4士11.9)%(氯磷定25,50 mg/kg),两者相比差异显著(P＜0.01).结论 Nef比氯磷定有更为显著的重活化ChE的作用,这与Nef能进入中枢复活脑中毒酶有关.
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正交设计与响应面法优化壳聚糖对莲子心提取液除杂工艺对比研究
目的 确定壳聚糖用于莲子心提取液除杂的佳工艺条件.方法 以固形物去除率、甲基莲心碱保留率为考察指标,分别考察壳聚糖用量、药液质量浓度、药液pH值、作用温度、搅拌时间对除杂效果的影响；在单因素分析的基础上采用正交试验设计及响应面法对比优化除杂工艺条件.结果 莲子心提取液除杂的优化工艺条件:药液质量浓度为生药0.2 g/mL(1∶5)或0.18 g/mL(1∶5.5),壳聚糖溶液(1％)用量为1.2 mL/g(壳聚糖溶液体积与生药量之比),作用温度为60℃,pH值为6.2,搅拌时间20 min.结论 正交设计与响应面法均可用于壳聚糖对莲子心提取液除杂的工艺条件优化,且除杂效果良好；但正交设计的试验次数相对较少,且方法简便,更加适合壳聚糖除杂工艺的优化.
