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细胞凋亡抑制剂防护晶状体上皮细胞氧化损伤及信号转导机制
目的:探讨细胞凋亡抑制剂阿魏酸钠(SF)、五味子乙素(Sch B)、菊花(FC)、车前子(SP)对过氧化氢(H2O2)所致氧化损伤的晶状体上皮细胞(LEC)活性以及细胞内钙(Ca2+)、环磷酸腺苷(Camp)、环磷酸鸟苷(Cgmp)的影响,研究四种细胞凋亡抑制剂防治白内障的细胞信号转导机制.方法:将传代培养的牛LEC与H2O2共同孵育复制氧化损伤的模型,同时加入SF和Sch B单体及Fc和SP水提取液孵育后,采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测LEC活性,采用荧光分光光度法检测LEC内钙离子的浓度([Ca2+];)、放射免疫分析法检测LEC内Camp和cGMP含量,并探讨不同浓度和不同孵育时间(12h、24h、36h)的影响.结果:①It:02组LEC活性下降,SF、Sch B、Fc、SP均可明显增强氧化损伤的LEC活性(P<0.01),呈浓度依赖关系和时间依赖关系.②H2O2组LEC的[Ca2+]i升高,SF、Sch B、FC、Sp均可显著降低氧化损伤I.EC的[Ca2+]i(P<0.01),呈时间.效应关系.③H2O2组LEC的eAMP浓度升高、cGMP浓度下降,SF、Sch B、FC、SP均可使氧化损伤的LEC的cAMP水平显著降低(P<0.01)、cGMP水平显著升高(P<0.01),也呈时间.效应关系.结论:四种细胞凋亡抑制剂SF、sch B、FC、SP可明显抑制LEC氧化损伤及凋亡,通过[Ca2+];、Camp、Cgmp信号转导及相互作用调节生物学效应可能是其主要的细胞和分子生物学机制.
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羟基喜树碱抑制体外培养兔晶体上皮细胞的生长
为研究羟基喜树碱(HCPT)对体外培养兔晶体上皮细胞(RLECs)生长的作用,取2～3代的RLECs在96孔板中培养24h后,用不同浓度的HCPT分别作用24及72h,用甲基噻唑四唑(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色测定法观察其对RLECs增殖的影响.结果显示HCPT能抑制RLECs的增殖,24h的半数抑制量(ID50)为96.041mg/L,72h的ID50为1.34mg/L;且HCPT还可抑制RLECs的贴壁.提示HCPT可能在用于降低后发性白内障的发生方面有一定作用.
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转化生长因子β2及其Ⅱ型受体在老年人核性皮质性白内障晶体上皮细胞中的表达
不同类型白内障晶体上皮细胞的密度及增殖状态存在明显差异,转化生长因子β(TGFβ)是一类具有多种生物学功能的细胞分裂调节剂,对细胞的影响包括:调控其增殖、细胞外基质的产生和调整、调控细胞的终分化[1].我们应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法比较老年人核性及皮质性白内障晶体上皮细胞中TGFβ2mRNA的表达;采用免疫组化染色方法检测转化生长因子βⅡ型受体(TGF RⅡ)在老年人核性及皮质性白内障晶体上皮细胞的分布及表达.
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三氧化二砷对兔晶体上皮细胞增殖的影响
目的:体外试验研究三氧化二砷(As2O3)对兔晶体上皮细胞(RLECs)增殖的影响.方法:取第3代RLECs,分为正常组和加入不同浓度三氧化二砷的实验组,分别于作用24小时、72小时和5天后观察各组LECs的形态学改变,用MTT比色法测定As2O3对LECs的影响. 结果:As2O3作用于LECs 24小时的IC50为3.101μmol/L,72小时的IC50为1.743μmol/L,5天的IC50为1.094μmol/L.结论:As2O3为剂量依赖性和时间依赖性药物,对体外培养的LECs增殖有明显抑制作用.
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改良的兔晶体上皮细胞体外培养
目的:建立一种改良的兔晶状体上皮细胞体外培养的方法,提高晶体上皮细胞原代培养的成功率.方法:利用改良消化法对兔晶体上皮细胞进原代培养,对培养的细胞进行形态学观察.结果:接种48小时～72小时后即可见上皮细胞贴壁生长,具备上皮细胞的形态特点;约7天后融合.传至5代后,细胞明显成纤维细胞化.结论:此种方法经济简便,可为各种实验提供兔晶体上皮细胞.
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SD 大鼠在高血糖刺激下晶体上皮细胞中MiRNA-29a-5p 的变化
目的：高血糖刺激下晶状体上皮细胞异常凋亡，导致晶状体发生病理性改变，在糖尿病性白内障的形成中发挥着至关重要的作用，但其潜在的分子机制尚不清楚，本实验主要是研究在高血糖刺激下，随着大鼠晶状体逐渐混浊，晶状体上皮细胞中 MiRNA-29a-5p 表达变化，促凋亡因子 BMF 的表达变化以及两者间的关系。方法分别从正常大鼠和注射 STZ 2周、4周的糖尿病大鼠眼取出晶状体上，通过 qRT-PCR 检测 miRNA-29a-5p 及 BMF 的 mRNA 的表达值。结果实验组大鼠晶状体2周时基本透明，4周时开始出现絮状混浊。对照组大鼠晶状体一直保持透明。实验组miRNA-29a-5p 呈下调表达，BMF 呈上调表达。结论白内障的形成过程较为复杂，在不同的发展阶段会有不同的病理因素干预，其形成早期晶状体上皮细胞的异常凋亡起到了启动子的作用，而 miRNA-29a-5p 低表达很可能对诱导细胞的异常凋亡起到了重要的作用。BMF 可能在 miRNA-29a-5p 影响细胞凋亡过程中扮演了重要的角色。
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受低强度微波辐射后兔晶体上皮细胞的早期改变
目的通过流式细胞技术定量检测受低强度微波辐射后兔晶体上皮细胞的早期损伤改变来验证微波安全接触标准的可靠性并探讨其发生机理。方法用强度分别为5mW/cm2和10mW/cm2的微波连续照射兔眼3h，流式细胞AnnexinⅤPI（碘化丙啶）双染色法定量检测兔晶体上皮细胞受辐射损伤的早期变化，以自身防护眼作对照比较。结果 5mW/cm2实验组兔晶体上皮细胞多数发生了早期凋亡。10mW/cm2实验组兔晶体上皮细胞受辐射后多数经早期凋亡发展到了细胞继发性坏死阶段。两组比较，10mW/cm2的微波对细胞的损伤明显大于5mW/cm2的微波。结论 5mW/cm2及10mW/cm2的低强度微波均导致兔晶体上皮细胞发生了不可逆的损伤，这种损伤是细胞水平上微波"非热"效应的结果。
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还原型GSH、卡林-U、内障清对H2O2损伤的牛晶状体上皮细胞的影响
目的:观察还原型谷胱甘肽(GSH)、卡林-U、内障清对过氧化氢(H2O2)损伤的牛晶状体上皮细胞(BLEC)的保护作用.方法:通过MTT法,观察GSH、卡林-U或内障清与H2O2同时作用以及先加H2O2后再加GSH、卡林-U或内障清后BLEC生长情况.结果:加50 μmol/L或125μmol/L H2O2组培养24,48 h时吸光值明显低于阴性对照组(P<0.01);同时作用,除加400μmol/L或2mmol/LGSH组吸光值明显高于单加H2O2组外(P<0.05),其余各组与之比较差别均无统计学意义(P>0.05);先后作用,加各浓度GSH、卡林-U或内障清组吸光值与单加H2O2组比较差别无统计学意义(P>0.05).结论:400μmol/L和2mmol/LGSH通过对H2O2的抑制保护BLEC.
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外源过氧化氢酶基因在晶体上皮细胞中的表达及其抗氧化能力
目的:构建外源过氧化氧酶基因表达载体并使其在晶体上皮细胞中稳定表达,从而提高晶体上皮细胞的抗氧化能力减少白内障的发生.方法:克隆过氧化氢酶基因,测序确定.构建过氧化氢酶基因plRESneo3表达载体.利用转染的方法将过氧化氢酶基因导入晶体上皮细胞SRA01/04中,筛选稳定表达克隆.以SRA01/04细胞和稳定转染过氧化氢酶基因的SRA01/04细胞为研究对象,使用过氧化氢为处理因素,MTT方法测定过氧化氢对晶体上皮细胞的半数致死量.结果:经上述方法处理后,获得过氧化氢酶高表达晶体上皮细胞SRA01/04-CAT,其过氧化氢酶的表达水平是SRA01/04细胞的3.5倍.过氧化氢对SRA01/04细胞的IC50是32.24 μmol/L,对SRA01/04-CAT的IC50是85 32 μmol/L,转染过氧化氢酶基因后SRA01/04细胞对过氧化氢的耐受能力提高2.65倍.结论:外源过氧化氢酶基因能够在晶体上皮细胞中稳定表达并使晶体上皮细胞的抗氧化能力提高.
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柔红霉素对人晶体上皮细胞生长抑制和角膜内皮细胞毒性试验研究
目的:研究柔红霉素对体外培养人晶体上皮细胞增殖的抑制作用和对角膜内皮细胞的毒性,探索使用柔红霉素预防后发障的适宜浓度.方法:第三代人晶体上皮细胞接种于24孔培养板内,24h后加入不同浓度柔红霉素作用10min后,吸出药物并冲洗后再培养48h,细胞计数.原代培养人角膜内皮细胞,加入不同浓度柔红霉素作用10min,观察细胞生长形态学变化.结果:柔红霉素依浓度梯度抑制晶体上皮细胞增殖,其LD50为4.9μg/ml,10μg/ml以下浓度对角膜内皮细胞无损害.结论:柔红霉素有可能作为预防后发障的辅助药物之一,选择适宜浓度是防止其对其他组织产生毒性的关键.
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5一Fu抑制后囊混浊及其角膜毒性的研究进展
白内障摘除联合后房型人工晶体植入是现代白内障治疗的主要方法.然而术后的主要并发症“后囊混浊”是影响术后视力的重要原因,其发生率3～5年达50%,儿童几乎是100%.国内外研究表明术后残留的晶体上皮细胞(1ens epithelial cells,LEC)向后囊表面的增殖和移行在后囊混浊的发生过程中起着重要作用.激光后囊打孔可以解决部分患者的后囊混浊,但此法影响了眼前节的完整性.改善人工晶体本身的特性,改良人工晶体的固定方式,术中彻底清除残留的LEC,以及术后抑制LEC的增殖无疑是减少后囊混浊的主要措施.
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人类晶体上皮细胞的体外培养与观察
目的:建立人类晶体上皮细胞培养的简便方法并观察原代和传代细胞的生物学特征和组织学变化.方法:将人工晶体植入术中取下的前囊膜分割成小碎片,吸管转移至培养瓶底部进行原代培养,7～10 d后常规方法进行传代培养,采用相差显微镜观察活体细胞的增殖活动和形态学变化.结果:人类晶体上皮细胞在体外培养时可以存活并传代,但是其生存能力与供体年龄有关.传代后期细胞发生纤维化改变.结论:本方法简便,有效,可用于实验研究.
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Genistein抑制兔晶体上皮细胞膜酪氨酸蛋白激酶及蛋白激酶C磷酸化的研究
目的:研究genistein对兔晶体上皮细胞增殖及胞膜酪氨酸蛋白激酶(TPK)、蛋白激酶C(PKC)活性的影响,探索使用genistein防治后发性白内障.方法:兔晶体上皮细胞培养,应用Casnetllie改良法检测不同浓度genistein及bFGF作用后,兔晶体上皮细胞膜TPK活性的变化;同位素掺入法检测genistein及bFGF作用后,兔晶体上皮细胞胞膜及胞浆PKC活性的变化.结果:不同浓度genistein作用后兔晶体上皮细胞TPK活性均较对照组明显下降,genistein可抑制bFGF诱导的TPK活性升高,genistein对PKC活性无明显抑制作用,但可抑制bFGF诱导的PKC活性升高.结论:genistein在体外可通过抑制生长因子激活的蛋白激酶活性升高而抑制兔晶体上皮细胞增殖.
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基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9在后发性白内障形成中的变化
目的:探讨兔眼晶状体皮质吸出术后不同时期MMP-2、MMP-9的变化,推断其在后发性白内障形成过程中的作用.方法:选用中国医科大学实验动物部提供的白色家兔42只,随机分成实验组(35只)及对照组(7只).实验组肌肉注射氯胺酮15mg/kg进行麻醉,由专人行双眼透明晶状体皮质吸出术.术后1%阿托品眼膏散瞳双眼,分别于术后1周、1、2、3、5个月各处死7只兔;对照组不做处理,直接处死.石蜡标本进行免疫组织化学定位检测MMP-2、MMP-9,冷冻标本用Zymography方法进行MMP-2、MMP-9活性测定.结果:①兔眼后发性白内障形成情况:术后不同时期裂隙灯下观察可见术后前3d前房内炎症反应明显,虹膜充血;术后1周可见前囊截缘出现白色环状混浊,但后囊尚透明;术后2周后囊呈薄纱状;1个月出现线条状混浊,2～3个月成条索状混浊,术后5个月后囊明显混浊.②免疫组化结果:对照组晶体上皮细胞胞浆及细胞间质中没有明显的MMP-2、MMP-9表达,实验组MMP-2于术后1～3个月表达增强.③Zymography凝胶检查:对照组可检测到极低的MMP-2、MMP-9活性(呈淡条带);实验组MMP-2活性明显强于对照组,MMP-9无明显差异.④活性分析:对照组MMP-2活性为(0.75±0.10),实验组分别为(3.68±0.12)、(5.18±0.11)、(5.62±0.11)、(6.58±0.11)和(1.19±0.10);实验组MMP-9活性与对照组相比无显著性差异.结论:正常兔晶体囊膜中有MMP-2、MMP-9活性;术后2～3个月囊膜中MMP-2活性增强;术后2～3个月,囊膜中MMP-9无变化;MMP-2与MMP-9比较,前者与后发性白内障的发病关系更密切.
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兔眼人工晶体植入术后TIMPs在晶体上皮细胞的表达及其意义
目的观察白内障囊外摘除及人工晶体植入(ECC+IOL)术后基质金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)在晶体上皮细胞的表达,探讨TIMPs以ECCO+IOL术后后囊膜混浊的影响.方法 25只健康成年家兔,均一只眼行晶体囊外摘除及人工晶体植入术,另一只未手术眼作为对照组.每5兔为一组,分别于术后1、3、7、14、30 d取出晶状体后囊膜,用RT-PCR检测各标本中的TIMPs mRNA的表达, 对扩增产物用凝交成像系统进行定量分析,以TIMP/GAPDH的比值表示TIMPs mRNA的相对表达水平,并用羟脯氨酸试剂盒检测晶体囊膜羟脯氨酸量的变化.结果在常晶体上皮细胞组织均有TIMP-1、-2、-3和-4mNA的表达;术后第1天,TIMP-1、-2、-3和-4mRNA均明显升高,术后第7天,TIMP-1、-2和-3RNA的表达量达到大,此后表达式量逐渐下降,术后第30天的表达量仍高于对照组,术后TIMP-4mRNA则表现为下降;结论白内障囊外摘除及人工晶体植入术后TIMPsmRNA在晶体上皮细胞的表达均明显升高,提示TIMPs可能是抑制白内障囊外摘除及人工晶体植入术后细胞外基质降解的主要因素,TIMPs可能是后囊膜混浊的形成和纤维化的重要原因之一.
关键词： 晶体上皮细胞 基质金属蛋白酶抑制因子 后囊膜混浊 兔 -
层粘蛋白、纤维连接蛋白对兔晶体上皮细胞粘附和移行的影响
目的探讨层粘蛋白(laninin,LN)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)对兔晶体上皮细胞(RLECs)粘附性和移行性的影响.方法观察外源性FN、LN对兔晶体上皮细胞粘附、移行及其细胞骨架的影响.结果随着FN、LN浓度升高,RLECs在相应的细胞外基质上粘附和移行能力增强,低浓度时增加幅度较大;加入相应抗FN、LN抗体,RLECs在相应基质上的移行产生不同程度的抑制作用,细胞骨架也不能充分铺展,并且这一变化与细胞粘附性和移行性呈正相关.结论 FN、LN可诱导RLECs移行、粘附,因而可能在后囊膜混浊的形成中起重要的作用.
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高浓度葡萄糖对晶状体上皮细胞形态及细胞周期的影响
目的观察高浓度葡萄糖状态对培养的兔晶状体上皮细胞RNA、DNA、超微结构的影响,以探讨糖尿病性白内障的发病机理.方法高浓度葡萄糖(4.5 g/L)作用于培养的兔晶体上皮细胞24、72、144 h后采用流式细胞仪检测晶体上皮细胞RNA、DNA、细胞周期、增殖指数.且以倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜进行晶体上皮细胞形态学的研究.结果高浓度葡萄糖作用于培养兔晶体上皮细胞24 h各指标无明显变化,72 hRNA量、S期细胞增加,G2/M期细胞减少,144 G2/M期细胞增加,但分裂指数并未相应提高;形态学上可见实验组细胞微绒毛及细丝丢失,细胞膜破裂,细胞染色质分布不均,细胞器减少、肿胀,髓样体出现.结论高浓度葡萄糖(4.5 g/L)能诱导晶体上皮细胞进入有丝分裂,但又阻碍有丝分裂的完成;同时对细胞膜、细胞核、细胞器均产生有害影响,使晶体上皮细胞的形态结构发生改变,细胞更趋老化,为糖尿病性白内障的发生奠定了基础.
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全反式维甲酸对后发型白内障形成的抑制作用
目的证明全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对兔眼晶体囊外摘除术后后发性白内障(after cataract)形成有抑制作用同时初步确定其药物作用的有效浓度.方法应用含不同浓度全反式维甲酸的手术灌注液在兔眼晶体囊外摘除术中进行灌注冲洗,观察术后一个月时后囊膜PCO的形成情况作为评判后发性白内障的指标并与空白对照相比较.同时对晶体后囊膜进行光镜、电镜的组织形态学检察.结果后发性白内障的形成随着全反式维甲酸的浓度升高而减轻,各组间在统计学上差异显著(P＜0.01),但10μg/mL与20μg/mL之间的差异不显著(P=0.544).组织学检查结论相同.结论全反式维甲酸能有效地抑制兔眼晶体囊外摘除术术后早期残留晶体上皮细胞的增殖,进而预防后发性白内障的形成.在以手术灌注液方式应用时,其药物有效作用浓度为2～10μg/mL.
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Wistar大鼠晶体上皮细胞原代培养及鉴定
目的探讨Wistar大鼠晶体上皮细胞原代培养方法,在形态学方面及晶体蛋白的特异性表达方面,对原代和第二代细胞进行鉴定.方法在无菌条件下,取新生Wistar大鼠乳鼠晶体,解剖镜下剔除粘附的虹膜及悬韧带;室温条件下,于终浓度0.08%的胰蛋白酶液中消化5～10 min后离心,用199培养液调细胞至适当浓度,37℃5%CO2条件下培养,3～4 d换液1次;待细胞长成连续单层后,以1:2或1:3传代.结果原代及第二代细胞形态呈典型的上皮细胞表型,从第三代起细胞形态发生了较大变化,提示细胞已开始分化.以Northern印渍杂交对培养细胞晶体蛋白的特异性表达进行了鉴定,发现原代及第二代细胞内仅存在α晶体蛋白mRNA.结论原代和第二代细胞尚未进入分化状态,可用作进一步实验的材料.
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芸香苷对人晶体上皮细胞氧化损伤和凋亡保护作用的初步研究
目的 研究黄酮类化合物芸香苷(Ru)对过氧化氢(H2O2)诱导的人晶体上皮细胞(HLEC)氧化损伤和凋亡的保护作用.方法 用不同浓度Ru(0、25、50、100μmol/L)预处理HLEC 1 h,再加入200 μmol/L H2O2,分别检测各组细胞增殖活性以及超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)水平,观察细胞凋亡形态并计算凋亡指数(AI).结果 200 μmol/L H2O2组HLEC增殖能力及SOD、GSH含量较对照组显著下降,MDA和AI较对照组明显增高(P ＜0.01)；Ru预处理组与H2O2组相比,细胞生存率、抗氧化水平明显提高,凋亡细胞数量显著减少(P＜0.01).结论 Ru通过提高细胞增殖能力保护H2O2引起HLEC的氧化损伤和凋亡.
