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RT-PCR技术快速检测水消毒效果的研究
目的：建立以mRNA为基础的RT-PCR方法用于大肠杆菌活菌检测，并初步用于水消毒效果评价。方法利用基因技术原理，建立以mRNA为模板的RT-PCR方法对大肠杆菌的uidA基因进行检测，并与平板培养法和普通PCR方法对比，评价水消毒效果。结果采用以UidA基因为模板的RT-PCR方法检测大肠杆菌的灵敏度为3．6×103cfu/ml；使用此方法检测经含氯消毒剂、二氧化氯消毒处理后的大肠杆菌，检测结果与平板培养法一致。而以DNA为模板的PCR方法则出现假阳性结果。结论所建立的RT-PCR检测方法可用于检测大肠杆菌活菌，在水消毒效果的评价中具有指示作用。
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一株新城疫病毒新强毒株(NL)的分离鉴定及F基因序列测定
1996年5月以来,我国各地鸡群暴发鸡新城疫,其发病特征是常规疫苗免疫无效.为研究此病毒的特征,对从华东某地分离的新城疫病毒毒株(NL株)进行了生物学研究.利用RT-PCR技术扩增出NL株融合蛋白基因(F基因)全序列,并测序.结果表明,NL株平均致鸡胚死亡时间(MDT)为28.2h,是目前所有公开报道的NDN毒株中致鸡胚死亡时间短的,其尿囊液中病毒滴度可达29,表明病毒繁殖速度快.F基因测序结果表明,NL株为一强毒株,与现今国外已发表的NDV株F基因同源性在84%～91%之间.氨基酸同源性为82%～93%.紧靠裂解位点附近的氨基酸与其它NDV毒株均不相同.据此认为,该新城疫病毒是一个新型毒株.
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福尔马林致痛大鼠背根节内5-HT受体亚型mRNA的表达变化
目的:探讨外周5-HT受体亚型在外周伤害性感受中的作用.方法:用反转录PCR技术观察大鼠单侧足底皮下注射福尔马林致痛后背根节内5-HT1～7受体亚型mRNAs的表达变化.结果:在大鼠足底皮下注射福尔马林后1 h,注射侧腰段背根节内5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A、5-HT3、5-HT4和5-HT7受体亚型mRNAs的表达水平显著升高,而5-HT1D、5-HT1F、5-HT2C、5-HT5A和5-HT6受体亚型mRNAs的表达在福尔马林致痛后无明显变化.在正常和福尔马林致痛大鼠的背根节内均未检测到5-HT1E、5-HT2B和5-HT5B受体亚型mRNAs的表达.结论:5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A、5-HT3、5-HT4和5-HT7受体亚型可能参与了福尔马林诱导的炎性痛,且它们在外周伤害性信息的传递方面可能发挥不同的作用.
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FOXC1 mRNA在鼻咽癌细胞中的表达及其意义
目的 探讨鼻咽癌细胞株中FOXC1 mRNA的表达及其意义.方法 体外培养永生化人鼻咽上皮细胞株NP69,低转移鼻咽癌细胞株6-10B及高转移鼻咽癌细胞株5-8F.通过反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)法检测FOXC1在RNA水平的表达情况.结果 FOXC1 mRNA在NP69细胞中表达低,鼻咽癌细胞株中5-8F高于6-10B.对三组细胞表达情况进行两两比较,发现5-8F和6-10B细胞的FOXC1 mRNA表达水平与NP69细胞相比均显著升高,有统计学意义(P5-8f,NP69＜0.01,P610BNP69＜0.01).鼻咽癌细胞株中,FOXC1在5-8F细胞中的表达高于在6-10B细胞中的表达(P＜0.01).结论 FOXC1 mRNA在鼻咽癌细胞株中高表达,其可能参与了鼻咽癌的发生及发展过程.鼻咽癌细胞株中,FOXC1在6-10B中的表达低于5-8F,可能与鼻咽癌的侵袭和转移有关,有潜力成为鼻咽癌治疗的一个新的靶点.
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Midkine基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
目的:构建妊娠中肾细胞因子(Midkine,MK)的原核表达载体并诱导其表达.方法:利用RT-PCR技术从人胎儿肾组织总RNA扩增MK成熟肽的DNA的编码序列,将扩增产物插入至温控表达载体pBV220中并转化E.coli DH 5α温度诱导表达.结果:琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物的长度与目的片段相符.对重组质粒分析表明,插入片段的序列与Gene Bank发表的人MK基因编码序列一致.SDS-PAGE电泳显示,重组菌高效表达出一个相对分子质量约为13×103的蛋白产物.结论:人MK编码序列已被克隆至表达载体pBV220中并在大肠杆菌诱导表达.
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针刺对缺血再灌注大鼠海马脑源性神经营养因子mRNA的影响
目的探讨针刺对缺血再灌注大鼠海马内脑源性神经营养因子(BDNF)基因表达的影响,推测针刺改善缺血再灌注的可能机制. 方法采用4-血管阻断法制备大鼠全脑缺血再灌注模型,电针刺激百会、肾俞、足三里穴后,利用RT-PCR检测BDNF mRNA. 结果正常组大鼠海马BDNF mRNA表达极低;缺血再灌注组大鼠海马BDNF mRNA表达明显增高,治疗15 d的针刺1、2组大鼠海马BDNF mRNA表达较缺血再灌注组更高,及早治疗且治疗时间为20 d的针刺3组大鼠海马BDNF mRNA表达降低. 结论缺血再灌注大鼠海马BDNF水平增高有利于损伤的神经元存活、恢复;针刺促进脑内细胞分泌内源性BDNF可能是针刺有效治疗缺血再灌注的机制之一.
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白毛藤生物碱对小鼠免疫功能及部分细胞因子mRNA表达的影响
目的探讨白毛藤生物碱对小鼠免疫功能及细胞因子IL-2,IL-12,IFN-γ和TNF-α mRNA表达的影响.方法将BALB/c小鼠随机分成4组:白毛藤生物碱高(H组)、中(M组)、低(L组)3个剂量组和生理盐水对照组(C组),连续腹腔注射7 d后,检测其单核巨噬细胞吞噬功能、二硝基氟苯(DNFB)诱导的小鼠迟发型变态反应(DTH)、胸腺指数和脾脏指数,并用RT-PCR的方法检测脾脏IL-2,IL-12,IFN-γ和TNF-α mRNA表达水平.结果 L组和M组的廓清指数(K)、吞噬指数(α)、DNFB诱导的小鼠迟DTH、胸腺指数和脾脏指数均显著高于C组,H组K和α显著低于C组;白毛藤生物碱3个剂量组均能提高IL-2,IL-12,IFN-γ和TNF-αmRNA表达水平,与C组相比,M组显著.结论白毛藤生物碱能有效提高机体的免疫功能及IL-2,IL-12,IFN-γ和TNF-αmRNA表达.
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膀胱癌肿瘤标记物研究进展
膀胱癌是泌尿系常见的恶性肿瘤,早期做出正确的诊断对疾病的治疗与预后有重要的临床意义.在膀胱癌中,90%以上是移行细胞癌(TCC),超过70%的TCC在治疗后复发,复发肿瘤中约30%出现恶性度增加.目前,用于膀胱癌诊断、监测的传统手段是尿液分析、膀胱镜和尿细胞学检查.它们都有一定的局限性:尿液分析缺乏特异性、敏感性;膀胱镜检查并做组织活检是膀胱肿瘤诊断的金标准,但这是有创检查,并且患者依从性差,价格比较昂贵,不宜作为常规检查;尿细胞学检查(UC)有较高的特异性,在不同的分级中检测率为50%～90%,但敏感性低,低度表浅性的肿瘤往往为假阴性,即使流式细胞学检查在临床上也没有发现比已往的细胞学检察存在更有价值的地方.膀胱癌生物学标记作为膀胱癌的早期诊断、监测以及预后评估的有效手段正受到越来越多的关注.
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基质金属蛋白酶-9 mRNA表达与食管癌侵袭转移的关系
目的:探讨基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA在食管癌组织中的表达及其与食管癌侵袭转移的关系.方法:用反转录PCR(RT-PCR)法检测41例食管癌患者的癌组织及其癌旁组织MMP-9 mRNA表达.结果:食管癌组织中MMP-9 mRNA表达率明显高于癌旁组织,并与食管癌淋巴结转移及静脉侵袭有关.髓质型食管癌组织中MMP-9 mRNA半定量值显著高于其它类型.结论:MMP-9过表达与食管癌的侵袭转移密切相关,是食管癌侵袭转移的标志.
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人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞的初步研究
目的:扩增人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,分别转染胃癌细胞SGC77901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR,以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系.方法:采用RT-PCR法扩增RPS13 cDNA片段编码区全长序列,利用DNA重组技术构建正、反义真核表达载体,经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR,筛选正、反义基因稳定转染细胞,RNA斑点杂交法检测正、反义稳定转染细胞mRNA水平的变化结果:从高表达RPS13的SGC7901/VCR耐药细胞中提取细胞总RNA,RT-PCR法成功扩增了RPS13 cDNA片段编码区全长序列,并经测序证实;目的基因按正、反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.10+),并经酶切鉴定证实;经脂质体介导将正义真核表达载体转染SGC7901细胞,反义真核表达载体转染SGC7901/VCR细胞,G418筛选获得稳定转染细胞:RNA斑点杂交试验证实:正义稳定转染细胞RPS13mRNA水平上调,反义稳定转染细胞RPS13mRNA水平下调结论:成功克隆了人RPS13编码基因序列,并构建了其正、反义真核表达载体.在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中得到稳定转染细胞株,正义转染细胞中RPS13 nRNA表达明显增加,反义转染细胞中表达明显受抑.
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构建脊髓慢性压迫损伤模型大鼠巢蛋白的表达规律
背景:既往应用的脊髓损伤动物模型难以达到一种慢性渐进性的压迫效果,与人体慢性脊髓压迫损伤机制有很大的不同.目的:构建一种新的脊髓慢性压迫性损伤模型大鼠,探究慢性压迫损伤后脊髓损伤区域巢蛋白的表达规律及其意义.方法:Wistar大鼠40只随机分为实验组30只和对照组10只.实验组大鼠取下胸7、8椎板,植入压迫材料,形成慢性压迫脊髓损伤模型.植入后第1,3,7,14,28天,取压迫处脊髓组织,行病理学检查及巢蛋白免疫组织化学染色,半定量反转录PCR反应测定巢蛋白mRNA的表达,同时测量压迫段椎管直径及缓膨胀材料侵占厚度.结果与结论:随压迫时间的延长,实验组大鼠椎管侵占率逐渐增加,脊髓组织出现坏死等情况,大鼠BBB评分降低,压迫处脊髓组织中Nestin mRNA及蛋白表达至伤后7 d时达到高峰,而后表达逐渐下降,说明实验成功建立慢性脊髓压迫损伤动物模型,且慢性脊髓压迫损伤大鼠脊髓组织Nestin mRNA及蛋白呈动态变化.
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曲安奈德鼻喷雾剂对鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞及其趋化因子-2表达的影响
目的 观察局部应用曲安奈德鼻喷雾剂对鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞(EOS)浸润情况及EOS趋化因子-2(Eotaxin-2)表达的影响.方法 采用逆转录-聚合酶链反应方法检测24例鼻息肉患者接受曲安奈德鼻喷雾剂治疗6~8周和未经治疗的鼻息肉组织中Eotaxin-2 mRNA的表达水平(各12例),并观察比较鼻息肉组织苏木精伊红染色(HE)片中EOS的浸润情况.结果 ①治疗组比未治疗组的鼻息肉组织中Eotaxin-2 mRNA的表达水平显著下降(P<0.01);②治疗组鼻息肉组织HE片中嗜酸性粒细胞浸润情况较未治疗组显著下降(P<0.05).结论 曲安奈德鼻喷雾剂具有减少Eotaxin-2 mRNA的表达,抑制EOS炎性反应的作用.
关键词： 鼻息肉 嗜酸粒细胞 嗜酸粒细胞趋化因子-2 反转录PCR 曲安奈德鼻喷雾剂 -
三叶因子2、表皮生长因子在大鼠胃溃疡愈合中的作用
目的 探讨胃黏膜三叶因子2(TFF2)和表皮生长因子(EGF)在大鼠实验性胃溃疡愈合中的变化及意义.方法 胃前壁黏膜下注射冰乙酸制备大鼠胃溃疡模型,免疫组织化学法及RT-PCR法检测溃疡组和正常组大鼠胃组织TFF2、EGF的表达变化.结果 免疫组化结果显示大鼠胃黏膜TFF2阳性细胞自溃疡术后1d即显著增多(P＜0.01),至溃疡术后6 d TFF2积分光密度值达到高峰,阳性细胞以靠近黏膜肌层信号较强,壁细胞、颈黏液细胞可见阳性表达；之后积分光密度值渐低,但仍高于正常对照组(P＜0.05).EGF阳性细胞在溃疡术后1d略有增多(P＜0.05),至溃疡术后4～10 d EGF阳性细胞明显增多,表达明显增强；10 d积分光密度值达到高峰,可见表达于壁细胞、内分泌细胞、颈黏液细胞等,除胞质表达外,也可见胞膜表达；之后积分光密度值虽略有降低,但仍显著高于对照组(P＜0.01).RT-PCR结果显示TFF2 mRNA以溃疡术后4～10 d表达为强烈；EGF mRNA 4～23 d表达均较强.结论大鼠胃溃疡自愈时期胃黏膜能特异性表达内源性TFF2和EGF,二者共同参与了胃溃疡愈合过程.
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一步反转录PCR技术在检测4种人疟原虫中的初步应用
目的 探讨应用一步反转录PCR (RT-PCR)技术检测4种人疟原虫的可行性和特异性. 方法 取恶性疟(1例)、间日疟(1例)、卵形疟(1例)和三日疟(5例)患者全血,提取疟原虫总RNA和基因组DNA.应用一步RT-PCR和一步实时荧光RT-PCR分别扩增经脱氧核糖核酸酶(DNase)消化的疟原虫RNA样品中的18S rRNA序列,应用普通PCR和一步RT-PCR技术分别扩增不同稀释浓度的疟原虫RNA(未经DNase消化和经DNase消化)和DNA样品中的疟原虫18S rRNA序列和18S rDNA序列,比较2种检测技术可检测到目标序列的样品低稀释浓度. 结果 患者全血基因组DNA经一步RT-PCR分别扩增出310、394和323 bp条带,测序结果显示分别为恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、卵形疟原虫(P.ovale)和间日疟原虫(P.vivax)的18S rRNA序列特异性条带,但未扩增出三日疟原虫(P.malariare)特异条带.一步实时荧光RT-PCR结果显示,4种人疟原虫RNA样品均出现相应的荧光信号,除三日疟原虫样品外,各溶解曲线均仅有单一的扩增峰.因4种人疟原虫DNA和RNA原液样品中模板量的差异,一步RT-PCR可检测到的低稀释浓度从1至10-4不等,但可检测到的DNA样品的低稀释浓度与未经DNase消化的RNA样品相同或较后者低一个数量级,且两者低稀释浓度均低于经DNase消化的RNA样品.与普通PCR的检测结果比较发现,同一样品均以一步RT-PCR可检测到的稀释浓度低,较普通PCR的敏感性提高10～1 000倍. 结论 一步RT-PCR技术可检测出人血液样品中的恶性疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫DNA,但在检测三日疟原虫样品中的适用性有待进一步分析.
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肝细胞癌组织和正常肝组织中端粒酶亚单位的表达
目的检测肝细胞癌组织和正常肝组织中端粒酶RNA成分(human telomerase RNA component,hTR)和蛋白催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase,hTERT) 各自表达情况.方法以反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和套式聚合酶链反应(nested-PCR)分别检测肝细胞癌组织和正常肝组织中hTR和hTERT.结果 RT-PCR反应不足以清晰检出hTR的设计扩增条带,在RT-PCR基础上进行套式PCR,则正常肝组织和肝细胞癌组织均检出hTR内引物扩增条带,只是在肝细胞癌组织中hTR表达量相对更高一些.hTERT仅在肝细胞癌组织中检出,正常肝组织中检测不到.结论 hTR在正常肝组织和肝细胞癌组织中均能检测到;hTERT与端粒酶活性间关系更密切,端粒酶的激活可能至少包括两个层次:其一是端粒酶RNA成分的上调,其二是蛋白亚单位的表达.
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大鼠脊髓内5-HT2C,5-HT3,5-HT6和5-HT7受体亚型mRNAs的表达
目的:观察5-HT2C,5-HT3,5-HT6和5-HT7受体亚型mRNAs在大鼠脊髓不同节段的表达.方法:反转录PCR方法.结果:5-HT2C受体亚型mRNA在颈、胸、腰、骶段脊髓的背角(DH)和前角(VH)均有较强的表达;5-HT3受体mRNA在各节段脊髓DH的表达水平较高,而在VH则较低;与5-HT3受体亚型相反,5-HT6受体亚型mR-NA在脊髓VH的表达水平高于DH;5-HT7受体mRNA在脊髓的表达则与5-HT3受体相似,在各节段的DH均有较高水平的表达.不同的受体亚型在脊髓同一节段以及同一受体亚型在不同脊髓节段的表达水平存在差异.结论:本研究结果表明,上述四种5-HT受体亚型在脊髓具有不同的表达特点,提示它们在脊髓水平可能发挥着不同的生理作用,并为深入探讨5-HT受体参与伤害性感受和运动的调节机制提供了依据.
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应用cDNA微阵列技术筛选大鼠脊髓损伤修复相关基因
脊髓损伤是一类常见的、高致残率的中枢神经系统疾病,由于多种复杂因素影响其损伤后的修复过程,损伤脊髓的再生能力非常有限.本研究采用cDNA微阵列技术筛选大鼠脊髓损伤后出现的差异表达基因.实验组动物在T8-T9进行脊髓全横断手术,对照组动物只打开椎板;4.5 d后取脊髓进行RNA提取并在反转录过程中进行Cy3/Cy5标记,然后与预制的、带有4 041条特异性探针的芯片进行杂交.Cy5/Cy3信号比值≥2.0视为脊髓损伤后出现差异表达的基因.通过筛选,我们得到了65个上调表达基因(21个已知基因,30个已知EST和14个未知基因)和79个下调基因(20个已知基因,42个已知EST和17个未知基因).进一步通过半定量RT-PCR对其中的5个上调已知基因(Timp1,Tagln,Vim,Fc gamma receptor.Ctss)和三个下调已知基因(stearyl-CoA desaturase,F2,Ensa)的表达情况进行了验证,结果显示与芯片结果一致.这些基因可能在脊髓损伤后的修复过程中起一定的作用,对其深入研究将有助于揭示脊髓损伤修复的分子机制.
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过量表达Wnt-1基因诱导P19细胞的神经分化
Wnt-1基因在小鼠神经发育过程中起着重要作用.该基因在胚胎性癌细胞P19向神经分化过程中存在瞬时性表达.利用克隆到的Wnt-1基因转染P19细胞(Wnt-1/P19),可使细胞不经视黄酸(RA)诱导,自发向神经细胞方向分化.早期神经分化关键基因MASH-1在Wnt-1/P19细胞的神经分化过程中的表达,晚于RA诱导引起的P19细胞的分化过程.
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巢蛋白mRNA在小鼠中枢神经系统发育过程中的表达
巢蛋白(Nestin)属于中等纤维基因家族,在增殖较快的神经前体细胞中表达.该基因被克隆后,作为神经前体细胞的标记基因得到广泛应用.本文中,我们根据小鼠巢蛋白cDNA序列,设计了一对引物,在确定了反转录PCR反应的佳反应条件后,详细地考察小鼠巢蛋白mRNA在中枢神经系统发育过程中的表达规律,发现巢蛋白mRNA在小鼠第10天胚胎的脑中表达,到第14天表达量达到高,后下降;在出生后的小脑中,表达也有类似规律,出生后第5天,表达量高,其后下降.在成年小鼠各组织中,均未检测到巢蛋白mRNA的表达.
