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Bar-HRM技术在人参和西洋参药材鉴定中的应用研究
目的:采用高分辨率熔解曲线技术(HRM),应用ITS2序列对人参和西洋参药材进行快速鉴别,为规范市场药材管理提供一个新的分子检测手段.方法:收集人参、西洋参以及购买人参商品粉末药材,提取DNA,选择ITS2作为鉴别序列.在HRM-PCR条件下,建立人参和西洋参的标准高分辨熔解曲线、熔解曲线模型并确定Tm值;应用该方法检测市场随机收集的10份人参商品.结果:通过比较分析,人参和西洋参能够很好的区分开,10份人参商品粉末的高分辨熔解曲线、熔解曲线的峰形和Tm值均与人参相吻合,初步说明这10份人参商品都含有人参.进而将其PCR产物测序,以验证该结果.结论:Bar-HRM方法可简单、快速、高通量化和可视化的实现人参商品粉末药材的快速检测.
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ITS2序列鉴定“功劳叶”药材及其近缘混伪品＊
目的：中药材同名异物现象对临床安全用药造成了潜在的威胁。本研究对两种“功劳叶”药材及其近缘混伪品进行分子鉴定，以确保临床准确用药。方法：本实验收集枸骨、阔叶十大功劳和细叶十大功劳及其近缘混伪品共9个物种45份实验样品，用改良的CTAB法提取总DNA ，扩增ITS2序列并双向测序，采用CondonCode Aligner V 4.2.4对测序峰图进行拼接，应用MEGA 6.0进行序列变异分析，计算种内种间Kimura 2-Parameter（K2P）遗传距离，构建系统邻接（NJ）树。结果：基于ITS2序列的序列变异、近距离法和系统邻接树分析结果均表明，冬青属枸骨以及十大功劳属阔叶十大功劳和细叶十大功劳均能与其混伪品很好地区分开。结论：ITS2序列可有效区分两种“功劳叶”药材及其近缘混伪品，为临床准确用药提供依据。
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分子遗传标记技术在中药材鉴定中的应用
目前,用于中药材鉴定的分子标记技术主要有SCAR、RFLP、RAPD、PCR-RFLP、DNA测序和位点特异性鉴别PCR等.近5年来,通过这些分子标记技术的比较,我们发现位点特异性鉴别PCR技术以其简单、快速、准确、重现性好、成本低、抗污染等优点,将有十分广阔的应用前景.本文论述了位点特异性鉴别PCR技术以PCR反应为基础,通过对正品药材及其伪、混品的某些DNA片段的序列研究,找出正品药材的特异性位点,设计出只扩增正品药材的高度特异性的鉴别引物.用此引物对样品DNA进行一次PCR反应,经电泳检测便可准确鉴别样品的真伪.并对今后进一步开展此项工作提出了相应的建议.
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基于ITS2序列鉴定川贝母及其混伪品基原植物
本研究对川贝母5种不同基原植物ITS2序列进行PCR扩增和测序；同时扩大研究范围,从GenBank上下栽川贝母及其常见混伪品共10个物种13个样本的ITS2序列.用MEGA4.1计算其种间、种内的K-2-P距离,并分析各样本间ITS2序列二级结构的差异,后利用ITS2序列重构其系统发育树.结果显示川贝母基原植物种内大K-2-P距离为0.0276,与混伪品的种间小K-2-P距离为0.0583:川贝母及其混伪品的ITS2二级结构存在明显差异；重构的系统发育树显示川贝母不同基原物种聚为一支,能较好与混伪品区分.研究结果表明ITS2条形码序列能够成功鉴定川贝母及其混伪品的原植物,为川贝母混伪鉴别提供了新工具.
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高良姜及其混淆品的分子鉴定
目的:探讨基于ITS2条形码序列鉴定高良姜及其混淆品的新方法.方法:本研究对高良姜及其混淆品6个物种9份样品的ITS2序列进行PCR扩增和测序,同时扩大研究范围从GenBank上下载同属共15个物种37个样本.用MEGA4.1计算其种间、种内的K2P距离,并分析各样本间ITS2序列二级结构的差异,后利用ITS2序列重构其系统发育树.结果:高良姜基源植物种内大K2P距离为0.0171,与混伪品的种间小K2P距离为0.0469;高良姜及其混淆品的ITS2二级结构存在明显差异;重构的系统发育树显示高良姜的不同来源聚在一支,能较好与混淆品区分.结论:ITS2序列能够成功鉴定高良姜及其易混淆品,可以作为高良姜及其混淆品的分子鉴定工具.
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大青叶及其混淆品的ITS2序列鉴定研究
目的:对中药材大青叶及其混淆品进行分子鉴定,以确保该药材的质量以及临床疗效.方法:采用PCR直接测序法,测定核基因ITS2区,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,构建NJ(邻接)树,并利用Koetschan等建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构.结果:大青叶基源植物菘蓝ITS2序列长度为191bp,其种内平均K2P遗传距离(0.002)远小于其与混淆品的种间平均K2P遗传距离(0.882);由所构建的系统聚类树图可以看出,各物种均表现出了单系性,而同时又与其它物种明显区分开;比较ITS2二级结构发现,各物种在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异.结论:ITS2作为条形码可以方便快捷的鉴别大青叶正品及其混淆品,对药典中其它药材的相关研究也具有重要的参考价值.
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耳草属岭南药材DNA分子鉴定研究
目的:本研究应用ITS2序列作为DNA条形码对9种广东耳草属药材进行鉴定研究.方法:收集广东耳草属药材样本,通过植物基因组DNA提取、PCR扩增以及产物的双向测序获得ITS2序列,所得序列采用CodonCode Aligner进行拼接.用MEGA 6.06进行比对,分析种内和种间遗传距离,并构建系统进化树.结果:9种耳草属植物65条序列长度范围为208-224 bp,共有92个碱基变异位点,种内遗传距离(0.002)明显小于种间遗传距离(0.202).NJ和ML聚类树结果基本一致,除耳草与金毛耳草关系较近难以区分外,其余7个物种种内样本分别聚在一支,表现出单系性.结论:ITS2序列基本能够准确的鉴定广东耳草属药材,可作为耳草属药材基原植物鉴定的候选条形码序列.
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基于DNA条形码的岭南特色药材广东海桐皮、木棉花与其混淆品的分子鉴定
目的:本研究主要应用第二内转录间隔区(ITS2)序列作为DNA条形码进行分析,建立对岭南中药广东海桐皮、木棉花与其混淆品的快速鉴定法.方法:收集广东海桐皮等9个物种样本,提取样本基因组DNA,扩增ITS2基因片段,对其产物进行双向测序.所得序列采用CodonCode Aligner进行拼接.利用MEGA 6.06软件进行种间变异及遗传距离分析,并构建系统进化树.结果:9个物种的ITS2序列长度范围为224-237 bp,物种的种内遗传距离(0.000-0.017)明显小于种间遗传距离(0.045-0.820),NJ和ML聚类树显示,各物种样本独聚一支,表现出单系性.结论:ITS2序列能够有效鉴别植物海桐皮、木棉花与其混淆品,为其基原植物鉴定提供依据,为保证用药真实及其临床疗效提供分子鉴定方法.
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应用ITS2条形码鉴定岭南药材余甘子及其混淆中药品种
目的:本研究应用ITS2序列作为DNA条形码,建立余甘子及其混淆品分子鉴定方法.方法:收集8种共17份余甘子及其混淆品植物样本,提取基因组DNA,扩增ITS2基因并双向测序.所得序列采用Codon Code Aligner进行拼接,同时,从GenBank数据库中获3条相关ITS2序列用于比较分析.利用MEGA 6.06软件分析其种内及种间遗传距离,并构建系统进化树.结果:余甘子ITS2序列长度为208 bp,与其他各物种种间变异位点较多,遗传距离较大,为0.174-0.823.聚类树结果显示,余甘子基原植物独聚一支,与其他混淆品能够容易区分.结论:本研究采用ITS2序列能够有效鉴别余甘子及其混淆品基原植物,可为保证临床用药真实安全提供技术支撑.
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基于ITS序列位点特异性PCR鉴别桃仁与苦杏仁
目的:对桃仁和苦杏仁进行分子鉴定研究,建立基于ITS序列位点特异性的PCR鉴定方法.方法:收集桃仁、苦杏仁样品,提取基因组总DNA,用ITS通用引物进行测序,通过BioEdit软件进行序列比对,根据特异位点设计鉴别引物进行特异性PCR反应,并对PCR反应条件进行了优化.结果:基于ITS序列设计的特异性鉴别引物G4-7可以用于桃仁和苦杏仁的鉴别研究,在位点特异性PCR反应条件考察中,25 μL反应体系DNA模板用量适宜范围为0.05 ～1 ng,退火温度在59℃时特异性佳,实验建立的方法对不同DNA聚合酶和PCR仪均具有普适性.结论:该研究设计的位点特异性引物在一定条件下的PCR反应中,桃仁能够扩增出333 bp清晰条带,而苦杏仁没有该条带,从而实现了桃仁与苦杏仁的快速、准确鉴别.
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基于ITS2条形码鉴定水红花子及其混伪品
目的:利用ITS2条形码对中药材水红花子及其混伪品进行鉴定研究.方法:为对该中药材进行准确鉴定,共收集71份样本,包含药材正品及其混伪品.通过对样品进行DNA提取、PCR扩增、双向测序,利用CodonCode Aligner软件进行序列质量评价与拼接,获得ITS2序列.用MEGA软件进行序列比对、变异位点及遗传距离分析,采用近距离法和构建NJ(邻接)树法来评价ITS2条形码的鉴定能力.结果:水红花子药材基原物种红蓼ITS2序列种内遗传距离为0～0.0124,与其混伪品水蓼、酸模叶蓼以及春蓼的种间遗传距离分别为0.0334～0.0508、0.0688～0.0875、0.0379～0.0467.红蓼种内大遗传距离小于其与混伪品的种间小遗传距离,表明ITS2条形码可以准确鉴定水红花子与其混伪品.此外,基于ITS2序列构建的NJ树也可将水红花子及其混伪品明显区分开.结论:ITS2条形码是鉴别水红花子药材的有效工具,可为保障该药材生产投料安全提供新的技术手段.
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基于ITS2条形码鉴别半枝莲及其混伪品
目的:运用Internal Transcribed Spacer 2 (ITS2)条形码对半枝莲及其混伪品进行鉴别研究,为该药材的安全用药提供依据.方法:提取样品基因组DNA,对IrTS2序列进行PCR扩增和双向测序,所得序列经CodonCode Aligner V5.0.2.0拼接,采用MEGA6.0软件进行序列比对,计算种内和种间遗传距离.采用近距离法(Nearest Distance)和构建邻接树(NJ Tree)分析ITS2条形码对半枝莲的鉴定能力.结果:半枝莲ITS2序列种内遗传距离为0～0.008 4,与其混伪品半边莲、韩信草和荔枝草的种间遗传距离分别为0.3547～0.3696、0.0442～0.0542、0.2719～0.3018.半枝莲种内大遗传距离小于其与混伪品的种间小遗传距离,表明ITS2条形码可以准确鉴定半枝莲与其混伪品.基于ITS2序列构建的NJ树也可将半枝莲及其混伪品明显区分开.结论:ITS2序列可以快速、准确鉴别半枝莲与其混伪品,是鉴别半枝莲、保障其药材质量的有效条形码.
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黄精属药用植物 DNA 条形码鉴定研究
目的：评价 DNA 条形码候选序列对黄精属药用植物的鉴定能力。方法：对44份黄精属样品应用通用引物扩增其叶绿体 rbcL、matK、psbA-trnH 及核 ITS2和 ITS 序列，分析其种内种间变异和 barcoding gap，应用 BLAST 和 Nearest Distance方法计算物种鉴定效率。结果：ITS2和 ITS 序列通用引物扩增效率低，叶绿体 matK 序列获得率低，rbcL 高，三条序列种内与种间变异均较小，无明显的 barcoding gap。基于 BLAST 和 Nearest Distance 方法计算，三条叶绿体序列对黄精属药用植物的鉴定效率均较低。结论：DNA 条形码候选序列 psbA-trnH、matK 及 rbcL 不适用于黄精属药用植物的鉴定，叶绿体全序列或通过叶绿体全序列筛选合适的 DNA 片段可能是该属药用植物分子鉴定的方向。
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羚羊角塞特异性PCR鉴别方法研究
目的:为解决中药羚羊角塞与羚羊角相比因失去"通天眼"等传统鉴别特征而鉴别困难的问题,建立准确鉴别鉴定羚羊角塞的方法.方法:通过比对羚羊角塞基原动物赛加羚羊与其7种常见混伪品的细胞色素C氧化酶亚基I(Cyto-chrome coxidase I,COI)序列,根据差异位点设计出仅扩增赛加羚羊DNA的特异性鉴别引物.结果:进行PCR时,当退火温度为64 ℃,循环数为33个时,仅羚羊角塞正品扩增获得约300 bp大小的条带,混伪品无条带.结论:该方法可作为准确有效检测待检样品是否来源于赛加羚羊的方法,用于羚羊角类样品的DNA鉴别.
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快速PCR方法在山药真伪鉴别中的应用
目的:采用快速聚合酶链式反应(PCR)方法建立快速、准确、有效的山药药材真伪分子鉴定方法.方法:收集不同地区山药正品及其混伪品材料,对所有样品进行总DNA的提取,通过对山药及其混淆品DNA条形码rbcL片段进行同源对比分析,根据鉴别位点,设计中药山药的鉴别引物,引物序列为Sy89:5'-AAGGACGATGCTACCACATCGACAC-3',Sy90:5'-ATCCCAATAGGGGACGGCCA-3'.采用2步法进行PCR扩增,并对PCR反应体系和反应程序影响因素进行考察,从而对山药进行真伪鉴别.结果:通过对影响PCR退火温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行反应程序的优化,并对不同Mix进行考查,获得了山药快速特异性PCR反应程序.PCR扩增反应液为50 μL,包括Premix TaqTM 25 μL,上、下游引物各1.5 μL,DNA模板1.5 μL,加无菌双蒸水至50μL.PCR扩增程序为98℃预变性1 min,98℃变性10 s,68℃复性15 s,30个循环,72℃后延伸30 s.以1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物在250 bp附近处有一清晰条带,而混淆品无条带.结论:快速特异性PCR方法可以简单快速鉴别山药的真伪,为实现中药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑.
关键词： 快速特异性聚合酶链式反应 山药 分子鉴定 -
含当归中成药的DNA提取及其分子鉴定
目的:优化含当归中成药的DNA提取方法,并利用叶绿体trnL-F基因及当归特异分子标记对当归中成药进行鉴定.方法:采用传统十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法,十二烷基磺酸钠(SDS)法,磁珠法以及改良CTAB法对10种含有当归成分的中成药进行DNA提取,利用微量紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳检测所得总DNA的完整性、纯度和浓度.对10份当归中成药的trnL-F序列进行扩增、测序,对序列进行比对分析并构建系统发育树.利用当归特异鉴别分子标记对10种当归中成药中的当归成分进行分子鉴别.结果:利用改良CTAB法获得了纯度较高,质量较好的DNA.10种中成药中当归的trnL-F序列与正品当归序列相似度为99.88％～100％,系统发育树显示10份中成药中的当归与正品当归聚为一类.利用当归特异性鉴别分子标记进行验证,10种中成药DNA样品均能得到明亮的扩增条带.结论:改良CTAB法可以有效提取当归中成药中的基因组DNA.利用trnL-F序列和当归特异性鉴别分子标记,成功对10份市售当归中成药进行了分子鉴别,为当归类中成药的分子鉴定奠定了基础.
关键词： 当归中成药 DNA提取方法 叶绿体trnL-F序列 特异性鉴别分子标记 分子鉴定 -
基于DNA条形码技术鉴别4种龙胆科“地格达”类蒙药基原植物
目的:建立一种快速、准确和标准化的龙胆科“地格达”类蒙药材的DNA条形码鉴别方法,为“地格达”类蒙药材的分子鉴定提供依据.方法:对蒙药地格达类药用植物进行通用引物PCR扩增,PCR扩增产物直接测序,并对序列进行分析.结果:测得4种“地格达”的rbcL,ITS,trnH-psbA和matK全长序列,4种序列长度的范围为388 -940 bp,rbcL,ITS,matK序列都可以将其鉴别出来.结论:tmH-psbA序列不适合用于4种“地格达”的鉴别,ITS序列可作为地格达类蒙药材一种良好的分子标记.通过DNA条形码鉴别方法可对4种龙胆科“地格达”进行准确、可靠、有效的分子鉴别.
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DNA条形码鉴定与功效组分测定在紫草质量评价中的应用
目的:利用DNA条形码技术对中药紫草进行基源鉴定,并建立紫草的功效多组分含量测定方法,为全面评价紫草药材质量提供依据.方法:对不同产地紫草进行DNA条形码基原鉴定;采用高效液相色谱法测定紫草中萘醌类成分与含量,Thermo BDS Hypersil C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相0.2％冰乙酸-乙腈梯度洗脱,流速0.8 mL· min-1,检测波长275 nm,柱温35℃.结果:经DNA条形码鉴定了11批药材,均为紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma的干燥根;测定了11批新疆紫草的8种萘醌类功效组分含量,各组分均显示良好分离;不同成分在线性范围内线性关系良好,平均回收率在95.26％ ～ 101.40％,RSD均在0.7％～1.8％(n=6).结论:DNA条形码鉴定确保了新疆紫草药材基源的准确性,组分含量测定方法准确可靠、重复性好,二者结合可作为紫草的质量控制方法.
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基于ITS2序列及其二级结构对防己及其混伪品的鉴定
目的:利用核糖体DNA第2内部转录间隔区(ITS2)及其二级结构对传统中药材防己及其混伪品进行分子鉴定及聚类分析.方法:从GenBank上下载36条防己及其混伪品的ITS序列,利用Geneious R11.0.3进行序列比对,运用MEGA 7.0计算种内、种间K2P遗传距离,构建邻接(NJ)系统进化树,同时利用ITS2数据库在线软件预测各样本的二级结构,并利用4Sale软件进行二级结构的比对,终运用ProfDistS软件基于距离法构建了PNJ进化树.结果:各种间平均遗传距离均远大于种内平均遗传距离,NJ树显示防己及其混伪品聚为6个分支;混伪品与正品的二级结构均有一定的差异;PNJ进化树比NJ树显示出更多的分支和更高的分辨率.结论:虽然ITS2可以作为防己及其混伪品的DNA条形码,但是若包含ITS2二级结构所蕴含的系统发育信息,鉴定结果更加精准.
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不同产地栽培及野生喜马拉雅紫茉莉的分子鉴定研究
目的:利用分子技术测定喜马拉雅紫茉莉的DNA分子序列,比较不同产地栽培及野生喜马拉雅紫茉莉的差异,为栽培品的合理使用提供依据.方法:提取喜马拉雅紫茉莉药材的DNA,以ITS序列通用引物进行PCR扩增,扩增产物经纯化后测序,利用NCBI数据库及MEGA 5.0等软件对数据进行分析.结果:喜马拉雅紫茉莉样品间DNA遗传距离差异较小,在0.000-0.040之间;样品分子间碱基变异位点少;系统发育树中,所有样品聚为一大类,Boerhavia spicata.聚为一类,二者显著分开.而安国XZAGZP及甘南州GSGLYS聚为一类,其余样品聚为一类.结论:不同产地栽培及野生的喜马拉雅紫茉莉药材在DNA分子序列方面的差异较小,为栽培品的合理使用提供了理论依据.
