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鼠癣螨(Myocoptes musculinus)分子鉴定和感染调查
目的 建立鼠癣螨(Myocoptes musculinus)快速鉴定方法,并对50个生产厂家843批5109只SPF实验动物鼠癣螨感染的检查结果进行分析,为制定鼠癣螨的净化策略提供科学数据和技术支持.方法 直接镜检实时动态显微视屏摄录技术结合形态学鉴定方法,进行鼠癣螨感染筛查.多重PCR方法鉴定分离的鼠癣螨cytb(细胞色素b)、cox2(细胞色素C过氧化物酶亚基2)和ATP6(ATP合成酶F0亚基6)基因,从分子水平上进一步确认鼠癣螨感染.结果 基于直接镜检实时动态显微视屏摄录技术,检出鼠癣螨阳性样本39份,阳性率为0.76％,检出形态为鼠癣螨虫卵、幼虫、若虫和成虫.根据鼠癣螨的虫卵、幼虫、若虫、雌雄成虫的大小和形态初步确定虫种.从阳性样本中分离的单个鼠癣螨的虫卵、幼虫、若虫和成虫扩增其cytb、cox2和ATP6基因,结果表明,39份形态学阳性样本,分子鉴定均为阳性,且与其他不同种属的寄生虫无交叉反应.序列比对结果显示,不同个体间鼠癣螨的cytb、cox2和ATP6部分基因序列核苷酸相似性达100％.结论 直接镜检实时动态显微视屏摄录技术联合多重PCR技术检测鼠癣螨具有高的灵敏性和特异性.检测的实验动物样本中确有鼠癣螨阳性,提示我国实验动物病原学检查需进一步强化.本研究首次对中国实验动物的鼠癣螨进行了分子鉴定和感染调查,为净化鼠癣螨策略提供数据和技术支持.
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中国实验动物中鼠管状线虫的分子鉴定和感染调查
目的：对鼠管状线虫进行分子鉴定和感染调查，为国家标准的修订提供参考依据。方法923批5199只SPF动物（包括：1批5只猴，3批25只小型猪，28批55只兔，13批248只地鼠，37批198只豚鼠，93批459只大鼠，742批4179只小鼠，5批25只鸡和1批5只鸭）和145批1389只清洁动物（包括：1批3只兔，4批31只地鼠，16批157只豚鼠，32批268只大鼠和92批930只小鼠）来自全国50个不同的厂家。应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术结合形态学鉴定方法，进行鼠管状线虫感染筛查。应用多重PCR和测序技术，鉴定分离的鼠管状线虫ITS（内转录间隔区）、28S rRNA（28S核糖体RNA）、nad1（NADH脱氢酶亚单位1）和cox1（细胞色素C过氧化物酶亚基1）基因，从分子水平上确证鼠管状线虫感染。结果应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术，从动物中检出鼠管状线虫的虫卵、幼虫和成虫。根据鼠管状线虫的卵细胞、幼虫、雌雄成虫的大小和形态来鉴定虫种。应用多重PCR测序技术，能从分离的单个鼠管状线虫的虫卵、幼虫和成虫中鉴定出ITS、28S rRNA、nad1和cox1基因，与其他不同种属的寄生虫无交叉反应。应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术，从5199份SPF和1389份清洁动物样本中分别检出鼠管状线虫阳性样本285份和135份。应用多重PCR和测序技术，鉴定证明这些阳性样本中确实含有鼠管状线虫特异性的DNA。测序结果显示，不同动物分离的鼠管状线虫的ITS、28S rRNA、nad1和cox1部分基因序列核苷酸相似性达100％。 SPF和清洁动物的鼠管状线虫感染率分别为5?5％（285／5199）和9?7％（135／1389）。结论应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术联合多重PCR测序技术能够快速精准检测鉴定出鼠管状线虫。鼠管状线虫的人兽共患本质可以视作为公共卫生的一个预警。良好的动物质量控制对保护人类身体健康和保障人民用药安全具有重要作用。本研究对中国SPF和清洁动物的鼠管状线虫进行了分子鉴定和感染调查。
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循环肿瘤细胞在临床运用中的研究进展
循环肿瘤细胞(CTCs)是一种存在于外周血液循环的、来源于原发病灶或是转移病灶的肿瘤前体细胞,在一定程度上可反映肿瘤的进展情况及侵袭能力.对CTCs的分析有可能实现肿瘤无创性的检测、药物筛选、实时治疗监测及预后评估.目前所研发出来的诸多针对此类细胞的分离富集和分子鉴定技术,是实现上述目标的关键.
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国境口岸首次截获贪食睡鼠的分子鉴定及核酸序列分析
目的 利用分子鉴定技术,对辽宁大窑湾口岸截获的1只鼠样本(从来自塞尔维亚的原木的集装箱中采集)进行种类鉴定.方法 提取已风干鼠样本的基因组DNA,采用动物线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ (COⅠ)的通用引物(COⅠ-1和CO Ⅰ-2),进行靶DNA扩增并进行核酸序列分析.结果 截获鼠样本的DNA条形码序列与GenBank中贪食睡鼠(Glis glis)的序列相似性高为100％,鉴定为贪食睡鼠.为国境口岸首次截获该鼠种.结论 加强出入境交通工具及集装箱鼠类监测工作,保障国境口岸的卫生安全.
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DNA条形码技术在媒介蝇类分子鉴定中的应用
蝇类隶属双翅目(Diptera),其医学重要性是机械传播疾病.目前已证实,蝇类能携带的细菌有100多种,原虫30多种,病毒20种,此外还可携带螨类体外寄生虫,传播疾病并危害人类健康,是重要的医学媒介生物.蝇类传播疾病的另一特点是孳生习性不同的蝇种其携带病原体的类型也不同.对媒介蝇类进行相关科学研究的基础和前提是鉴定和识别,因为对蝇类的鉴定和识别是监测与控制蝇类传播疾病发生的基础,是检疫、疾病预防与控制的核心步骤.
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DNA条形码技术鉴定贝母属植物
目的 采用DNA条形码技术,比较了条形码序列ITSl和ITS2在贝母属植物中的鉴定效果.方法 从8个贝母属21个样品中提取了基因组DNA,进行ITS1、ITS2序列的PCR扩增和测序,并比较了各样品DNA提取率、PCR扩增率及测序成功率.测序数据采用BLAST搜索法评价2种序列的鉴定能力,采用SPSS软件进行遗传距离分析,采用MEGA软件进行系统发育树的构建.结果 对比不同物种ITS1、ITS2序列的一级结构差异,发现其ITS1序列长度为205～229 bp,有信息位点27个(所占比例11.8％),鉴定成功率为72.2％;ITS2序列长度为236～244 bp,有信息位点20个(所占比例8.2％),鉴定成功率为100％.ITS1序列的种内及种间遗传距离分别为0.001 8和0.066 1,而ITS2序列的种内及种间遗传距离分别为0.000 5和0.046 8,且种内高度保守;系统发育树构建结果显示,2种ITS序列能准确区分出浙贝母类群、川贝母类群和北方贝母类群,而ITS2序列所构建的系统发育树准确度更高.结论 ITS2序列能够更准确鉴定不同物种贝母,适合作为贝母属植物的通用条形码序列.
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基于ITS2序列的羌活及其混伪品的DNA条形码鉴定
目的 对羌活及其混伪品进行分子鉴定,以确保该药材的质量以及临床疗效.方法 利用PCR测序法,对样品进行核基冈1TS2片段扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA 4.0进行相关数据分析,并构建邻接(NJ)树.利用已建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构.结果 羌活与宽叶羌活ITS2序列长度均为228bp,二者种内平均K2P(Kimura-2-parameter)遗传距离均远远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离；由所构建的系统聚类树图可以看出,羌活与宽叶羌活均表现出了单系性,而同时又与其他混伪品明显分开；比较ITS2二级结构发现,羌活基原植物与其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异.结论 ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别羌活及其混伪品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据.
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铁线莲属8种药用植物ITS序列分析
目的:通过测定并比较柱果铁线莲、单叶铁线莲、威灵仙、山木通、毛蕊铁线莲、转子莲、女萎和天台铁线莲的ITS序列,为铁线莲属药用植物的分子鉴定提供依据.方法:利用PCR法从叶片基因组DNA中扩增ITS,借助ClustalX、MEGA、DNASTAR等软件比较和分析ITS的序列特征.结果:铁线莲属8种药用植物ITS1与ITS2之间的长度为534～561bp,变异位点50个,信息位点22个；天台铁线莲与转子莲的遗传距离小,与女萎遗传距离大,亲缘关系远.序列已提交至NCBI数据库,登录号为JF714638-JF714645.结论:获得铁线莲属8种药用植物的ITS序列,为分子鉴定奠定了基础.
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杜仲叶和果实中内生真菌的分离及抑菌活性
目的 从杜仲Eucommia ulmoides叶和果实中分离具有抑菌作用的内生真菌.方法 采用平板培养法从杜仲叶片和果实中分离内生真菌,通过对峙法和生长速率法考察这些内生真菌的抑菌活性,并通过HPLC法考察其具有代谢产生杜仲有效活性成分的能力.对具有良好抑菌效果和能够代谢杜仲活性成分的内生真菌进行ITS序列测定,鉴定其归属.结果 从健康叶片和果实中分离到52株内生真菌,其中2个菌株的提取液中含有绿原酸,11个菌株至少对4种病原菌具有抑制作用,其中29号菌株(链格孢属Alternaria sp.)对芽孢杆菌Fusarium graminearum的抑制效果好,其抑制率高达82.6％.通过与GenBank数据比对,这些内生真菌分别属于链格孢属Alternaria、黑孢属Niqrospora和座囊菌纲(Dothideomycetes).结论 从杜仲叶和果实中分离到11株具有抑菌作用的内生真菌,这些具有抑菌作用的内生真菌可用于生物制药和农业产业.
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半夏及近缘种叶绿体非编码区序列分析
目的 通过测定半夏及近缘种的DNA叶绿体的非编码区序列,为半夏的分子鉴别和遗传多样性研究提供依据.方法 在我国半夏主要分布区收集到43份半夏及滴水珠和虎掌半夏2个近缘种,采用PCR法克隆叶片基因组DNA中psbK-psbI和atpF-atpH两段序列,借助生物信息学软件进行比对分析.结果 半夏atpF-atpH序列长为337～342 bp,较为保守,仅含变异位点7个,其中信息位点1个,遗传距离为0～0.024.半夏psbK-psbI序列长为432～435 bp,变异位点37个,其中信息位点17个,遗传距离为0～0.069.聚类分析结果均显示出与表型以及地理居群的不一致.结论 psbK-psbI序列较atpF-atpH有更好的鉴别能力,在半夏种内具有较丰富的变异位点.
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藏红花病毒病原的分子鉴定
目的 研究栽培藏红花的病毒病原.方法 综合运用病毒粒子形态和细胞病理学电镜观察、DAS-ELISA检测、RT-PCR检测及序列测定等技术进行病原鉴定.结果 透射电镜负染色观察到病株汁液含有600～900 nm的线状病毒粒子;超薄切片观察到病株细胞质内有大量线状病毒粒子、Ⅱ型风轮状内含体和电子致密无定型体,符合菜豆黄花叶病毒Beamyellow mosaic virus (BYMV)的病理学特征.应用BYMV抗体进行病株DAS-ELISA检测结果为阳性,应用马铃薯Y病毒属特异性引物Sprimer和M4对病株进行RT-PCR检测结果为阳性,对阳性结果进行分子克隆及序列测定发现目标序列与BYMV有99％的同源性.结论 综合检测结果判明侵染浙江藏红花的病毒病原为BYMV.
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细辛属8种药用植物rDNA ITS的克隆与序列分析
目的 克隆和分析8种细辛属药用植物的ITS序列,为开展该属植物分子鉴定和遗传多样性研究奠定基础.方法 以基因组DNA为模板,利用PCR法克隆ITS全长序列,借助生物信息学软件对序列进行比对分析,并构建系统发育树.结果 测序结果表明,8种细辛属植物的ITS全长为637～646 bp,其中的5.8S序列为保守,长度和碱基组成完全一致;ITS1与ITS2均存在一定的变异,它们的长度分别为255～257 bp和226～232bp,序列中出现大量插入/缺失和转换/颠换现象,ITS1、ITS2的可变位点和简约信息位点数分别为46/30和14/9.系统发育分析结果表明,8种细辛属植物在进化树上可分为4组,与传统分类结果完全一致,Ⅰ～Ⅳ分别对应细辛组、华细辛组、长花组和杜衡组.结论 8种细辛属植物ITS序列具有丰富的信息位点,可用于这些植物的分子鉴定.
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中国不同地区绞股蓝ITS序列分析
目的 比较中国不同地区绞股蓝的nrDNA ITS碱基序列的差异,以期分析绞股蓝的地理分布与ITS基因型的相关性,为我国不同地区绞股蓝的鉴别提供分子依据.方法 PCR克隆测序,MegAlign(DNASTAR)软件对序列进行对位排列,PAUP4.0b10软件进行系统发育分析,构建大简约树.结果 绞股蓝ITS区长度为658～659 bp,变异位点为8.48%,信息位点为2.72%.不同地区的样品在碱基的量、信息位点的碱基位置和遗传距离等方面存在一些差异.系统发育分析表明ITS基因型与绞股蓝的地理分布具有一定的相关性,但也有部分不一致,可能主要是因为纹股蓝种内复杂的倍性.结论 ITS序列可作为中国不同地区绞股蓝的一种良好的分子标记,而要确定不同地区的绞股蓝合理的亲缘关系还需要结合其他方面的证据.
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我国不同地区天门冬核DNA ITS序列分析
目的 研究我国不同地区天门冬核DNA ITS序列差异及其与地理位置的关系,为不同居群天门冬的鉴定和道地产区的确定提供理论依据.方法 运用PCR法对25个地区的75个样本ITS序列扩增后双向测序,用软件DNAMAN和MEGA4分析测序结果.结果 每个地区的3个样本的ITS序列基本相同,不同地区样本间的ITS全序列存在一定差异,ITS2片段变异高于ITS1.贵州产天门冬遗传分化度较大,变异位点和信息位点较多.ITS序列构建的系统树表明,同一个地区的3个样本优先聚类,然后是同省的样本聚类,位于北纬24.6°～36.6°和22.2°～24.4°的样本分别聚为1大支;第1大支中包括青海、湖南和贵州省的样本,第2大支则包括浙江、广东、云南和广西4省的样本.结论 ITS序列可鉴定不同产地的天门冬,贵州省是天门冬药材道地产区之一,不同地区天门冬的亲缘聚类主要与纬度相关,与经度关系不大.
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不同种质来源孩儿参的rDNA ITS区序列分析及鉴别
目的 通过分析不同种质来源孩儿参ITS序列,为孩儿参种内鉴别提供DNA分子标记.方法 利用特异性引物进行PCR扩增、克隆和测序,对孩儿参的rDNA ITS区间碱基序列进行测定,比较其差异.结果 参试的9个不同种质来源孩儿参的整个ITS长度变异为623～624 bp;其中ITS1为224 bp,G+C量为52.91％～54.26％；5.8 SrDNA为155 bp,G+C量为54.49％～55.13％；ITS2为244～245 bp,G+C量为55.55％～56.41％.整个ITS区共有17个变异位点(2.72％),ITS1、ITS2和5.8S的变异位点分别为7、7和3个,不同种质来源孩儿参均有若干个特异性的单核苷酸变异位点；各样品的序列同源性均在99.9％以上；序列间的遗传距离为0.003～0.013.显示了不同产地、不同种质孩儿参的变异是不超过1个种的范围内的变异.结论 可利用ITS区序列差异,鉴别不同种质来源的孩儿参.
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中成药DNA提取技术优化及其在人参类制剂分子鉴定中的应用
目的 建立并完善从中成药及保健品中提取DNA的有效方法,并在人参类制剂中进行验证.方法 使用中成药和保健品中常用的辅料(如淀粉、蔗糖、葡萄糖等)模拟CTAB法提取DNA过程,用以筛选影响提取DNA效率的因素;使用甲醇作为沉淀试剂优化传统的CTAB法,并使用MAS-PCR方法对市场上人参类中成药及保健品进行分子鉴定,以验证优化的技术.结果 中成药及保健品中的淀粉(包括药源性淀粉和辅料添加的淀粉)通过CTAB反应后生成极性较大的复合物,其与70％乙醇不能互溶,而且在碱性条件下对DNA有强烈的溶解作用,从而影响了CTAB法提取DNA的提取效率;利用甲醇作为沉淀试剂能够有效去除CTAB裂解过程中产生的高极性复合物的影响,70％甲醇-醋酸钠溶液能够有效提取中成药及保健品的DNA;利用优化的DNA提取方法和MAS-PCR法实现了11种市售人参类制剂的快速分子鉴定,结果显示8种与商品描述一致、1种有掺伪情况、2种为伪品.结论 使用甲醇作为沉淀试剂优化传统的CTAB法,可以较好地克服中药制剂中淀粉对DNA提取的不利影响,可以有效地实现基于DNA的中药制剂分子鉴定.
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DNA条形码技术在中药鉴定中的应用进展
DNA条形码(DNA barcoding)技术利用标准的一个或多个DNA片段对物种进行鉴定,是近年来生物学研究的热点领域,也是生物学发展迅速的方向之一.总结了植物DNA条形码研究的发展历程及新进展,重点讨论了超级条形码在近缘物种鉴别中的应用前景,以及DNA条形码在中药材基原物种鉴定、道地药材鉴别以及中药材溯源系统研究中的应用,并强调了植物DNA条形码在中药资源评价、保护和可持续利用中的重要地位和作用,为药用植物DNA条形码研究提供新的思路.
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白花蛇舌草和水线草的鉴别与药用进展比较
白花蛇舌草Hedyotis diffusa与水线草H.corymbosa同为茜草科(Rubiaceae)耳草属Hedyotis Linn.植物,均具有清热解毒功效,且有一定的抗肿瘤活性,故水线草常作为白花蛇舌草的替代品使用,目前关于二者替代使用的可行性和合理性尚无定论.鉴于此,从本草考证、药用沿革、混用情况、商品状况、性状及显微特征、化学成分、药理活性等方面对二者进行系统比较,发现二者性状、显微特征较为相似,但成分、活性等方面存在较为明显的差异,可以通过分子鉴定方法对二者进行快速鉴别,故建议二者在使用上应予以区别.
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核酸等温扩增技术及其在中药分子鉴定中的应用研究概况
中药品种的准确鉴定是中药质量控制的首要环节,寻找高效、便捷、准确的鉴定方法,是中药鉴定技术的发展趋势.相对于以表型标记为鉴定特征的传统方法,DNA分子遗传标记鉴定技术具有更加准确、可靠的特点,适用于近缘混淆及多来源品种的鉴定,但同时受PCR技术的限制,存在成本高、步骤复杂、时间长的缺点,无法实现快速鉴定.环介导等温扩增是一种新型核酸扩增技术,具有高特异性、高灵敏性、简便、快速、低成本等优点,成为继PCR技术之后的又一新兴技术,可成功实现对中药材的快速分子鉴定.通过对常见的核酸等温扩增技术及其在中药材分子鉴定研究中的应用情况进行综述,为中药材的快速分子鉴定体系研究提供参考.
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前胡及其混伪品的中药鉴定学研究进展
白花前胡Peucedanum praeruptorum作为前胡药材的基原具有降气化痰、疏风散热等功效,多用于呼吸道和肺动脉高压治疗,特别是在防治心血管疾病方面具有很高药用价值.通过收集国内外相关研究资料,综述了近年来前胡及其混伪品鉴定方面的研究成果.DNA条形码技术在药用植物和药材鉴定方面表现出较强的应用能力,为此阐述了现代分子生物学技术和传统鉴定手段应用于前胡及混伪品鉴定的新进展,同时对各方法优缺点及实用性进行了总结,以期为中药的快速、准确鉴定提供新的研究思路和解决方案.
