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液体活检-通向精准医疗的桥梁
组织活检是癌症的标准诊断程序,然而,由于肿瘤异质性和进化,基于组织活检的癌症诊断在癌症发展、预后的评估中具有局限性.液体活检是检测患者体液中含原发肿瘤生物特性分子的技术,包括循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA和外泌体等的检测.液体活检被广泛的应用于辅助诊断、疗效评价、预测预后、监测复发转移、辅助靶向治疗等方面.本文将对液体活检的生物特性及临床应用进展进行综述.
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细胞外囊泡与肿瘤相关性的研究
细胞外囊泡是细胞间信号传递的新方式,在生理或病理条件下皆发挥重要的调节作用.细胞外囊泡根据直径、形态学的不同,可分为外泌体和微囊泡.细胞外囊泡中具有多种内容物,并具有将其内容物传递给受体细胞、调节受体细胞生物学行为的能力,因而受到广泛关注.大量研究表明,细胞外囊泡可促进肿瘤细胞的生长、介导上皮间质转化、增强肿瘤远处转移能力及诱导耐药的作用.此外,细胞外囊泡具有广泛的临床应用前景,在肿瘤的早期诊断、作为核酸药物载体及预测肿瘤治疗预后等方面皆崭露头角,具有独特的临床应用价值.
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人脐血清源性外泌体对肝癌Hep3B细胞活力的影响
目的:探究脐血清源性外泌体对肝癌Hep3B细胞活力的影响.方法:提取健康足月胎儿脐血清源性外泌体,加入细胞培养基孵育24小时,MTT检测细胞活力变化,倒置显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Cleaved-Caspase3表达变化.结果:脐血清源性外泌体能显著抑制肝癌Hep3B细胞活力,导致细胞发生形态学改变、凋亡细胞比例增加及活化的Caspase3水平上升.结论:脐血清源性外泌体能诱导肝癌细胞发生凋亡,具有潜在的抑制肿瘤的生物学活性.
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胃癌耐药细胞EXOs的提取鉴定及可能存在的耐药信息传递作用的初步探讨
目的:探讨胃癌耐药细胞(SGC7901/Adr)分泌的外泌体(exosomes,EXOs)在细胞间可能存在的耐药信息传递作用.方法:选用胃癌亲本细胞SGC7901及其阿霉素耐药细胞SGC7901/Adr为模型,用PEG方法提取EXOs;透射电子显微镜观察鉴定细胞EXOs形态;Western Blot检测CD9、CD63、TSG101、Calreticulin以及P－糖蛋白(P－gp)的表达;运用激光共聚焦显微镜观察胃癌SGC7901和SGC7901/Adr细胞及加入阿霉素耐药细胞SGC7901/Adr外泌体处理后的敏感细胞内阿霉素药物浓度变化.结果:透射电子显微镜下观察到,胃癌SGC7901和SGC7901/Adr细胞来源的EXOs为直径在30～100 nm之间的囊性小泡,呈圆形或椭圆形,大小均匀一致.Western Blot检测胃癌SGC7901和SGC7901/Adr细胞来源的EXOs,携带有外泌体生物标记分子CD9(四次跨膜分子)、CD63(四次跨膜分子)以及TSG101表达,Calreticulin为阴性表达.进一步检测发现在SGC7901/Adr细胞来源的EXOs中存在P－gp蛋白表达.经过阿霉素耐药细胞SGC7901/Adr外泌体处理后的敏感细胞,胞内可见阿霉素聚集减少,核区分布减少,荧光强度减弱.结论:胃癌耐药细胞分泌的EXOs可能通过传递P－gp蛋白的形式,具有传递耐药信息的作用.
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间充质干细胞源性外泌体及其在肿瘤治疗中的研究进展
外泌体（exosomes）是细胞内多囊泡体（multivesicular bodies，MVBs）与细胞膜融合后释放到细胞外直径为40～100nm 的囊泡样小体。作为一种重要的细胞间信息传递分子及遗传物质传递载体，外泌体内含有蛋白质、RNA 等多种活性物质，广泛分布于血液、尿液等体液中。目前发现多种类型细胞均可产生外泌体，尤其是间充质干细胞（MSCs）被认为是产生外泌体能力强的细胞，并且 MSCs 源性外泌体（MSC －exo-somes）与 MSCs 同样具有向炎症组织及肿瘤组织迁移的特性，为肿瘤治疗提供了一种新思路。由此，本文将从 MSC －exosomes 生物学特性、分离鉴定方法、肿瘤治疗潜能三方面进行综述。
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液体活检在非小细胞肺癌中的应用
随着精准医疗和个体化治疗在肺癌领域中的发展，对肿瘤分子生物学特性进行实时监测的要求越来越高。“液体活检”以其标本获取简便、创伤小、重复性高的特点在近年来引起了广泛关注。在所有肺癌患者中，非小细胞肺癌（ non small cell lung cancer，NSCLC）占85%~90%，针对NSCLC，特别是肺腺癌驱动突变的发现及相应靶向治疗的成功应用极大地改写了肺癌治疗的篇章，与此同时也对NSCLC相关分子生物学标志物的实时检测提出了更高的要求。本文以液体活检标志物的检测为起点，就其在NSCLC患者中的临床应用做一综述。
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一种绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞源性外泌体的构建及鉴定
目的:构建稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem ceils,MSCs),获得GFP标记的MSCs源性的外泌体(exosomes).方法:全基因合成CD63序列,连接到穿梭载体,酶切验证后转染293T细胞,测定病毒滴度后感染MSCs,72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞.荧光定量PCR检测CD63在MSCs中的表达.取其无血清培养72 h的上清液,获得提取物,经透射电镜和Western Blot验证.结果:提取物为类圆形囊泡,大小约为40～ 100 nm,具有CD63和Alix表达.结论:成功构建携带GFP标记的MSCs源性的外泌体,为研究外泌体在细胞中的摄取及信号传递提供了工具.
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外泌体参与中枢胶质细胞-神经元之间信息交流和疾病发生的研究进展
外泌体(exosome)是机体细胞释放到细胞外直径约30～100 nm大小的双层磷脂膜囊泡,其内含有核酸、蛋白质等多种生物活性分子.外泌体参与机体的生理和病理进程,目前被认为是细胞间远程物质传递和信息交流的一种重要方式[1-3].Wolf于1967年首次发现血小板来源的囊泡样外泌体,并证明其参与凝血过程的重要生理作用[4].随后Schekman、Südhof和Rothman等三位科学家因为揭示了细胞间囊泡运输功能与调控机制的重要贡献获得2013年诺贝尔生理学或医学奖.
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外泌体定量技术研究
在上世纪80年代Trams等[1]早于培养的绵羊红细胞上清液中发现外泌体(exosomes,ES),并首先提出了ES概念.ES是由细胞主动分泌的直径在40～100 nm的囊泡结构[2],由磷脂双分子层包裹了细胞质组成,它包含亲代细胞的蛋白质、DNA、RNA、小分子等.近年来,研究人员陆续观察了不同类型细胞中ES的形成过程,并且能够从血浆、尿液、脑脊液等不同体液中提取到ES[3].在中枢神经系统,神经元和胶质细胞均可产生并释放ES.
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外泌体miR-146a对N9型小胶质细胞介导炎症反应的作用
目的 探讨外泌体源性微小RNA-146a(micro RNA-146a,miR-146a)对N9型小胶质细胞介导的炎症反应的作用和机制.方法 利用装载有miR-146a的质粒转染人胚肾293(human embryonic kidney 293,HEK293)细胞.然后应用SBI(system biosciences)试剂盒提取外泌体,通过电镜观察和蛋白印迹法(Western Blot,WB)鉴定外泌体.将外泌体加入N9型小胶质细胞培养皿内,用脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导炎症反应后利用聚合酶链法(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测N9型小胶质细胞内miR-146a的含量,用RT-PCR和WB法检测Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)信号通路上肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor6,TRAF6)和白细胞介素-1受体相关激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)的表达水平,用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测与神经炎症相关因子干扰素β(interferon-β,IFN-β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β )、白介素6(interleukin-6,IL-6)的表达水平.结果 通过质粒转染和SBI试剂盒成功获取了内含有miR-146a的外泌体,应用该外泌体干预N9型小胶质细胞后可以提高miR-146a的含量.与单纯采用LPS刺激相比,用内含miR-146a的外泌体干预后再接受LPS刺激作用可明显降低IFN-β 、TNF-α、IL-1β和IL-1的表达水平,同时明显降低细胞内TRAF6分子的mRNA和蛋白表达,而对IRAK1的表达没有影响.结论 外泌体源性miR-146a提高了N9型小胶质细胞内MiR-146a的表达量,并通过调控TLR4信号通路中TRAF6分子的表达负反馈抑制N 9型小胶质细胞介导的炎性反应.
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SSc患者外周血外泌体通过microRNA-21介导成纤维细胞活化
目的 比较系统性硬皮病患者(systemic sclerosis,SSc)与正常人外周血外泌体(exosome)中microRNA-21-5p(miR-21-5p)的表达差异,评估外周血中外泌体对人皮肤成纤维细胞功能状态的影响.方法 提取SSc患者及正常人外周血外泌体,荧光定量PCR法检测miR-21-5p表达情况;外泌体刺激人皮肤成纤维细胞,CCK-8法检测细胞增殖能力,免疫印迹检测Collagen Ⅰ,Ⅲ及平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平.结果 SSc患者外周血外泌体中miR-21-5p显著高于正常人.与正常人相比,患者外泌体可明显增强人皮肤成纤维细胞的增殖能力及上调Collagen Ⅰ,Ⅲ,α-SMA的水平,上述作用可被转染miR-21-5p抑制剂阻断.结论 SSc患者循环外泌体通过转运miR-21-5p介导人皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞分化.miR-21-5p可能是SSc潜在的生物标记物.
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SACC-83来源的外泌体调节唾液腺间质成纤维细胞表达FAP的实验研究
目的:研究腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)细胞SACC-83来源的外泌体(exosome,EXO)对人正常唾液腺间质成纤维细胞(human normal salivary gland stromal fibroblasts,hSGSFs)表达成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)的影响.方法:采用超滤管浓缩与EXO提取试剂盒相结合的方法从SACC-83的培养上清中提取EXO,通过透射电镜及Western Blot对所提取的EXO进行鉴定;将SACC-83来源的EXO用荧光染料PKH67标记后与hSGSFs共培养48 h,采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察hSGSFs对于SACC-83来源的EXO的摄取情况;利用qRT-PCR和Western Blot法检测在SACC-83来源的EXO作用下,hSGSFs中FAP的表达变化.结果:SACC-83培养上清中所提取到的微囊泡直径为30～100 nm,EXO的膜蛋白标记物CD63和TSG101的表达为阳性;携带PKH67荧光标记的EXO可被hSGSFs摄取,并可在mRNA和蛋白水平上调hSGSFs中FAP的表达.结论:SACC-83来源的EXO可被hSGSFs摄取,并可显著上调hSGSFs中FAP的表达.提示ACC可能通过EXO途径促进正常唾液腺间质成纤维细胞向癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAF)的转化.
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供体MSCs来源的外泌体转运miR-26a恢复宿主MSCs功能并缓解骨质疏松
目的:探讨移植的供体间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)通过分泌外泌体缓解雌激素缺乏导致的骨质疏松的机制.方法:建立12只小鼠雌激素缺乏骨质疏松模型,通过siRNA调控MSCs外泌体释放及直接注射外泌体,明确外泌体的分泌在MSCs治疗骨质疏松中的作用;通过体外成骨分化诱导、茜素红染色、qPCR明确供体MSCs来源的外泌体对宿主MSCs功能的影响;通过miR-26a模拟物、抑制物转染、qPCR明确外泌体发挥治疗作用的机制.结果:供体MSCs通过分泌外泌体缓解雌激素缺乏骨质疏松,并证明外泌体通过恢复骨质疏松宿主MSCs成骨分化功能缓解骨质疏松,外泌体可通过转运miR-26a恢复骨质疏松宿主MSCs的成骨分化功能.结论:供体MSCs来源的外泌体可通过转运miR-26a恢复宿主MSCs功能并缓解骨质疏松.
关键词： 间充质干细胞(MSCs) 骨质疏松 外泌体 -
牙髓干细胞来源外泌体诱导内皮细胞血管生成能力的研究
目的:探讨牙髓干细胞(DPSCs)来源外泌体对内皮细胞血管生成能力的影响.方法:收集人健康恒牙并分离培养hDPSCs,然后对hDPSCs表面分子和多向分化能力进行鉴定.收集hDPSCs来源的外泌体,并配制0(对照组)、10、20、40 μg/mL的hDPSCs外泌体后,采用MTT、EdU及Western blot检测外泌体对内皮细胞增殖活性的影响;细胞划痕、Transwell小室实验检测外泌体对内皮细胞迁移和侵袭能力的影响;内皮细胞成管实验检测外泌体对内皮细胞管腔形成能力的影响.结果:不同浓度的hDPSCs外泌体可提高内皮细胞的增殖活性,且其增殖促进作用具有浓度依赖性.细胞划痕和Transwell小室检测结果显示,不同浓度的hDPSCs外泌体可增强内皮细胞的迁移和侵袭能力,且均显著高于对照组(P<0.05).内皮细胞成管结果表明,20、40 μg/mL 的hDPSCs外泌体能显著诱导内皮细胞形成管腔,与对照组相比具有统计学差异(P<0.05).结论:hDPSCs来源的外泌体可促进内皮细胞血管生成.
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miR-126修饰的间质干细胞来源的外泌体对大鼠早期缺血性股骨头坏死的影响
目的 观察微小RNA-126(miR-126)修饰的间质干细胞来源的外泌体(MSC-126-Exos)对类固醇激素诱导的早期缺血性股骨头坏死(SANFH)的治疗作用,并探讨其潜在机制.方法 分别以80 mg/L MSC-126-Exos和MSC-Exos处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)并设PBS处理组为对照,MTT、划痕实验以及成管实验分别观察各组细胞增殖、迁移和毛细血管网的形成,Western blot检测HUVECs中血管内皮生长因子A(VEGFA)的表达.构建大鼠SANFH模型,分别注射等量MSC 126-Exos、MSC-Exos和PBS,6周后,通过对股骨头区域组织进行CD31免疫荧光染色及其Micro-CT扫描,观察股骨头血管数量及骨质情况.结果 体外实验中,MSC-126-Exos组的HUVECs的增殖、迁移和成管较MSC-Exos组显著增强,且VEGFA的表达水平也上调,差异有统计学意义(P＜0.05).在体实验中,MSC-126-Exos组大鼠股骨头坏死区CD31免疫荧光标记的血管数量较MSC-Exos组和模型组显著增多(P＜0.05),且股骨头坏死区Micro-CT扫描显示MSC-126-Exos组的小梁厚度(Tb.Th)、小梁数(Tb.N)和每组织体积骨量(BV/TV)值也显著高于MSC-Exos组和模型组,而小梁分离度(Tb.Sp)显著降低(P＜0.05).结论 MSC-126-Exos可以促进内皮细胞功能,改善股骨头区的血运从而增强骨质沉积,对大鼠SANFH具有显著的治疗效果.
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外泌体在体外对乳腺癌细胞耐药信息传递的作用
目的 探讨外泌体(exosomes,EXOs)在乳腺癌细胞间耐药信息的传递作用.方法 选用乳腺癌敏感细胞株(MCF-7)及其阿霉素耐药株(MCF-7/ADR)为模型,用超速离心法提取MCF-7/ADR外泌体(ADR/EXO);用透射电子显微镜观察鉴定细胞外泌体形态;运用倒置荧光显微镜观察ADR/EXO与MCF-7细胞的相互作用过程;运用激光共聚焦显微镜观察MCF-7与MCF-7/ADR在Transwell小室共培养60 h后细胞内阿霉素药物浓度变化;运用CCK-8法检测ADR/EXO与MCF-7细胞共培养后对阿霉素的IC50的影响;运用RT-PCR检测MCF-7与ADR/EXO共培养后MDR1基因表达水平的变化;运用Western blot法检测MCF-7与ADR/EXO共培养12 h和72 h后P-gp表达水平的变化.结果 透射电子显微镜下,外泌体呈现典型的圆形或椭圆形杯口状结构,直径为40~100 nm;用PKH67标记ADR/EXO显示,ADR/EXO是可以被MCF-7细胞摄取;与ADR/EXO共培养后敏感细胞株MCF-7对阿霉素的IC50耐药性升高2.62倍,差异有统计学意义(P<0.05);经过与MCF-7/ADR在Transwell小室中共培养60 h后的MCF-7细胞,胞内可见阿霉素聚集减少,核区分布减少,荧光强度减弱;MCF-7+ADR/EXO组MDR1的mRNA表达量明显增加,是MCF-7组的8.69倍,差异有统计学意义(P<0.05);与MCF-7组相比,共培养12 h的MCF-7+ADR/EXO组P-gp相对表达量升高4.64倍,差异有统计学意义(P<0.05);与MCF-7组相比,共培养72 h的MCF-7+ADR/EXO组P-gp相对表达量升高3.37倍,差异有统计学意义(P<0.05).结论 乳腺癌外泌体可能具有传递耐药信息的作用,耐药细胞外泌体能够使敏感细胞获得一定的耐药性,耐药细胞外泌体向敏感细胞传递P-gp,不仅可以通过蛋白形式进行传递,而且可以通过mRNA的形式进行传递.
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β-榄香烯对肺腺癌细胞增殖作用的影响
目的：探讨β‐榄香烯对肺腺癌细胞的抗肿瘤作用及其机制。方法：使用R T‐PC R和Western blot法检测β‐榄香烯对肿瘤细胞中P53 mRNA和蛋白表达的影响；同时使用差速离心法提取外泌体，利用电镜和Western blot 法进行分析。通过转染P53 siRNA构建P53下调细胞株。对BABL／c裸鼠肿瘤模型皮下注射A549细胞，探索体内环境下β‐榄香烯对肿瘤生长的影响。结果：①通过siRN A技术构建P53下调细胞株，观察到β‐榄香烯对A549细胞的作用依赖于P53的表达；②A549细胞源性的外泌体能够抑制肺癌细胞的增殖；③体内实验证实β‐榄香烯通过上调P53表达和外泌体的释放实现抑制肿瘤生长的作用。结论：β‐榄香烯通过调控P53的表达和外泌体的释放来影响肺癌细胞的增殖。
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外泌体在胶质瘤中的研究进展
外泌体是来源于细胞的直径在40～120 nm的膜性囊泡,其内含蛋白质、脂质、mRNA和miRNA,可以传递生物活性物质至靶细胞,参与细胞之间的信号转导,影响细胞的生物学行为.新研究发现由于胶质瘤外泌体在脊髓液中可检测的特点,其可以作为生物学标志物,在疾病的诊断和预后评估中发挥重要作用.本文对外泌体的构成、生物学特性以及在胶质瘤临床治疗中的新研究进展进行综述.
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外泌体分离方法研究进展
外泌体是一种由细胞分泌的密度在1.18～1.19 kg/L纳米级膜性囊泡,它在生物进程中扮演者重要的角色,如信息传递、运输载体、抗原呈递等.近年来,外泌体在研究界引起了相当大的关注.一方面科学家及医疗工作者致力于寻找新的以外泌体为基础的生物标志物进行健康监测及医疗诊断;另一方面,现阶段缺乏技术标准化方法来保证分离出高产量、高纯度的外泌体,这为实现可靠的生物标志物的发现制造了障碍.本文综述了外泌体分离方法相关研究领域的进展,特别在分离机制、适用范围及应用前景等方面.后,本文讨论了基于微流控技术的外泌体分离方法的新进展,并肯定了微流控技术在外泌体分离领域的重要性.
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外泌体在胰腺肿瘤中的研究进展
外泌体(Exosomes)是多种活细胞向胞外分泌的直径为40～100 nm的囊泡样小体,包含细胞蛋白质和核酸的脂质双层小体,不包含细胞器,参与细胞间重要信息交流和生理功能的调控.外泌体在肿瘤的发生、相关免疫反应、化疗抗药性以及转移中发挥着重要作用.近年来发现外泌体在胰腺肿瘤发生、发展、抗药性和临床诊断中具有异常的重要作用.本文将着重阐述外泌体如何促进胰腺癌进展、微环境重塑和化学耐药诱导等方面的作用和机制.
