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EB病毒转化人外周血B淋巴细胞的影响因素研究
目的 探讨人类疱疹病毒(EBV)转化外周血B淋巴细胞试验的影响因素.方法 用B95-8细胞制备EBV,实时荧光定量-PCR(real time-PCR)法测定EBV滴度以确保病毒有效性,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,研究环孢霉素A(CSA)的浓度、CSA加入时间、淋巴细胞浓度3个因素对EBV转化外周血B淋巴细胞试验的影响,选择优化条件对三氯乙烯接触工人的B淋巴细胞进行转化.结果 制备的病毒滴度分别为5.45×10~6/ml和1.06×10~6/ml.不同浓度CSA(0.2、1和2μg/ml)作用以及不同加入时间(同时加入或2h后)B淋巴细胞均成功永生化;正常人B淋巴细胞转化时淋巴细胞浓度不低于2×10~6/ml时方能成功水生化,而接触三氯乙烯工人的淋巴细胞在1×10~6/ml浓度下亦转化成功.不同条件下转化成功的B淋巴细胞永生化细胞系在形态上无明显差别,显微镜下可见B淋巴细胞体积增大并聚集成团.结论 在建立B淋巴细胞永生化细胞系的过程中,CSA浓度和加入时间对转化结果未见影响,而淋巴细胞与EBV接触时的细胞浓度是影响实验成败的关键因素,接触三氯乙烯工人的B淋巴细胞在1×10~6/ml浓度下亦转化成功,推测与淋巴细胞致敏状态有关.
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唐氏综合征患者永生细胞系的建立
目的 建立唐氏综合征患者永生细胞系,为唐氏综合征的基因诊断提供标准品.方法 采集唐氏综合征患者外周血,采用EB病毒转化外周血B淋巴细胞和加环孢霉素A抑制T淋巴细胞的技术,建立永生淋巴母细胞系.用细胞遗传学方法、实时荧光定量PCR及短串联重复序列(STR)多态性分析技术检测其建系前后的遗传特性及稳定性.结果 建系成功,经过传代、冻存和复苏,建系后第10代染色体核型和DNA标志未发生改变.建系前后染色体核型均为47,XX,+21.多重荧光相对定量PCR鉴定,唐氏综合征患者外周血原代细胞和转化后第10代细胞株的△Ct值均在-2.55±3s范围内,与正常对照相比△Ct值范围无重叠.21号染色体上的STR基因座D21S11多态性分析表明,唐氏综合征患者外周血原代细胞和转化后第10代细胞株均有同样的3种基因型.结论 染色体核型和DNA分析表明,唐氏综合征患者永生细胞系建立前后遗传特点一致,且稳定,可用作基因诊断试剂盒产品质量检测、质量控制的标准品.
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神经干细胞向神经元和胶质细胞分化调控机制的研究进展
自1992年Reynolds体外成功培养出成年哺乳动物的干细胞、提出成年人体内存在神经干细胞以来,有关神经干细胞分化及调控机制的研究已成为国内外学者关注的热点.由于成年神经干细胞的使用不存在伦理道德问题,具有多分化潜能,能够携带外源性治疗基因,且可通过导入原癌基因获得永生细胞系等优点,神经干细胞移植为中枢与外周神经损伤修复及神经退行性疾病的治疗提供了一个新的途径,其应用前景十分广阔.神经干细胞的分化方向主要取决于其在神经管中的初定位以及从神经管迁移后在大脑中的终定位,但同时也受细胞外的环境因素影响.神经干细胞分化的影响因素众多,这些因素往往相互作用,构成复杂的调控系统,目前的研究主要集中在细胞自身的基因调控及其它细胞因子的调控两个方面.笔者就其分化与调控机制的研究进展作一综述.
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大鼠血管纹边缘细胞永生细胞系的建立
目的 建立大鼠血管纹边缘细胞(Marginal Cells,MC)的永生细胞系,为进一步研究MC的功能打下基础.方法 取3～5日龄大鼠的耳蜗侧壁组织进行MC的原代培养,经选择性消化、差异性贴壁等手段纯化MC后,将MC和SV40在无血清DMEM条件下共培养三天,经2%新生牛血清选择培养三天,通过形态学的变化及增殖能力的变化粗筛出MC系;通过观察MC系的形态、生长特征,细胞角蛋白18、波形蛋白的免疫细胞化学,RT-PCR检测SV40 T抗原、IsK,细胞记数法及流式细胞术分析其生长情况及染色体倍型,软琼脂培养、裸鼠致瘤实验等鉴定MC-C3系.结果 MC-C3系基本保持了原代MC的表型特征:多角形外观、细胞间连接紧密,单层时呈"铺路石样"外观,dome形成能力等形态、生长特征;细胞角蛋白18、波形蛋白表达双阳性;不同世代的MC-C3均有SV40 T抗原、IsK的表达.MC-C3为二倍体细胞.软琼脂培养和裸鼠致瘤实验阴性.该系目前已培养5月,超过20代,传代时间为4～5天,传代比例为1:2～3.液氮中保存有不同世代的细胞.结论 本实验成功的建立了大鼠边缘细胞的永生细胞系,初步鉴定表明MC-C3基本保留了原代边缘细胞的表型特征,又不具有瘤细胞的特征.为边缘细胞功能的研究,特别是电生理、分子生物学方面的研究打下了良好的基础.
关键词： 边缘细胞 永生细胞系 猿猴肉瘤病毒(SV40) IsK -
广东高本底辐射地区老年居民淋巴细胞永生化细胞系的建立
目的 建立辐射高本底地区老年居民外周血永生化细胞系,以保存高本底居民特有的基因组资源,为进一步开展天然本底辐射的遗传学和分子生物学研究提供材料.方法 在知情同意的情况下收集20例高本底地区老年男性居民的外周血样品,采用EB病毒转化技术,把外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系,冻存复苏后,进行细胞活性检测和排除细菌、支原体污染,并用遗传学方法检测其建系前后的遗传稳定性.结果 成功建立20例40株细胞株,所有建成的细胞株冻存后复苏成功率为100%.活性细胞大于90%,无细菌和支原体污染,G显带分析结果为转化后第20代细胞的染色体核型未发生改变.结论 本研究建立的高本底地区老年居民永生细胞系在遗传学特性上是稳定的,可用于进一步的天然本底辐射的遗传学和分子生物学研究.
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Goldenhar综合征家系及散发病例永生细胞系的建立
背景:利用EB病毒转化外周血B淋巴细胞建立各种疾病,特别是罕见疾病永生细胞库,已成为当今永久保存全基因组的首选方法.目的:采用EB病毒转化淋巴细胞技术,建立Goldenhar综合征家系及散发病例外周血B淋巴细胞永生细胞系.设计、时间及地点:单一样奉观察,于2008-03/10在中南大学组织学与胚胎学系实验室完成.对象:湖南怀化地区的一个Goldenhar综合征家系中目前存活的3代20人及4例Goldenhar综合征散发病例及其父母.方法:收集Goldenhar综合征家系20人及4例散发病例及其父母外周血样品进行淋巴细胞分离,以EB病毒转化淋巴细胞,并加入环孢素A抑制T淋巴细胞生长,每个血样采用两线同时培养,转化后进行细胞株的冻存和复苏,检测其建系前后的遗传稳定性.主要观察指标:光镜观察B淋巴细胞的转化情况.细胞冻存后复苏成功率及染色体G带分析情况.结果:培养1周左右,可在倒置显微镜下观察到B淋巴细胞明显母细胞化,细胞明增大,细胞周边可见明显的胞质突起,形状各异,聚集成团.约15 d后,可见白色聚集生长的细胞团,1个月左右细胞增殖形成生长密集的细胞集落.共建成Goldenhar综合征患者外周血永生细胞株8例,建株成功率100%,父母等家庭成员建系成功率为95.8%(23/24).所有建成的细胞系冻存1,3,6个月后复苏成功率为100%,经染色体G显带分析未见异常,表明建立细胞株的方法稳定.结论:实验成功建立了Goldenhar综合征患者永生细胞系.
关键词： Goldenhar综合征 永生细胞系 EB病毒 -
细胞因子对神经干细胞增殖和分化的影响
神经干细胞是指具有分化为神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力,能自我更新并能够提供大量脑组织细胞的细胞.以前的神经干细胞多来自于胎儿胚胎组织,不仅来源少,而且受到伦理道德的影响,所以其应用也受到了一定的限制.自Reynolds BA 1992从成年哺乳动物中培养出干细胞,提出成年人体内也存在干细胞以来,有关干细胞的研究已成为国内外学者研究的热点.由于成年神经干细胞来源广,不存在伦理道德问题,具有多分化潜能,能够携带外源性治疗基因,且可通过导入原癌基因获得永生细胞系等诸多优点,所以神经干细胞移植为神经退行性疾病的治疗提供了一个新的方向,其应用前景十分广阔.神经干细胞具有多分化潜能,尽管其分化方向主要取决于在神经管中的初定位以及从神经管迁移后在大脑中的终定位,但同时也受细胞外的环境因素影响.本文就近年来细胞外的环境因素对神经干细胞的增生和分化作一综述.
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肺动脉瘘伴t(1;3)易位家系永生细胞系的建立与保存
目的 建立肺动脉瘘伴t(1;3)易位家系永生细胞系,为肺动脉瘘发病及遗传机制的研究提供永久的研究材料.方法 用EB病毒(Epstein-Barr virus)转染肺动脉瘘患者外周血B淋巴细胞,在37℃ 5%CO_2培养箱内培养(培养液成分:20%FBS、RPM11640、环胞霉素A和PHA),当细胞增长到汇合状态时传代及冻存.结果 所有建立的细胞系冻存后复苏的成功率为100%,经染色体G显带分析未见异常,表明建立细胞系的方法稳定.结论 成功地对肺动脉瘘伴t(1;3)易位家系中6个个体建立了永生细胞系.其中2个为肺动脉瘘患者,4个为患者家属正常对照.
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大鼠耳蜗大上皮嵴及小上皮嵴细胞永生细胞系的建立
目的:建立大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生细胞系.方法:取P1大鼠耳蜗,分离出耳蜗上皮薄片组织,并与含SV40-LT抗原的逆转录病毒共培养,从而实现细胞的永生化.利用单克隆法纯化细胞系,并通过形态学、免疫组织化学等方法对细胞系进行鉴定.结果:大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞永生细胞系基本保持了细胞原代的表型特征:呈现上皮细胞样的多角形外观;不同世代的细胞均表达Islet1及SV40-LT抗原.该系目前已培养3个月,超过20代,传代时间为3～4 d,传代比例为1∶5.结论:本实验成功建立了大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞的永生细胞系,这为大、小上皮嵴细胞生物学特性及相关功能,特别是毛细胞再生及前体细胞移植治疗感音神经性聋方面的研究奠定了坚实的实验基础.
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中国儿童孤独症家系外周血淋巴细胞永生细胞系的建立
目的试图建立外周血淋巴细胞、永生化细胞系以保存孤独症患者家系特有的基因组资源,为进一步探讨孤独症的发生机理提供材料.方法在知情同意的情况下收集66个原发性孤独症核心家系成员的外周血样品,采用EB病毒转化技术,将外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系;并用遗传学方法检测其建系前后的遗传稳定性.结果建系成功孤独症病例60例,父母成功132例,所有建成的细胞系冻存后复苏成功率100%,染色体核型分析表明建系前后遗传是稳定的.结论本研究建立的孤独症患者永生细胞系,可为进一步研究孤独症的分子水平发病机理提供随时可取的实验材料.
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中国海南岛3个黎族主要支系永生细胞系的建立与保存
目的:建立饽黎、杞黎、本地黎3个黎族主要支系的永生细胞库.方法:采用EB病毒转化外周血B淋巴细胞并加环胞霉素A抑制T淋巴细胞建立永生细胞系.结果:成功地对侾黎、杞黎、本地黎的部分个体建立了永生细胞系.其中饽黎66株,杞黎76株,本地黎54株,共196株.结论:侾黎、杞黎、本地黎永生细胞库的建立使特有的黎族基因组得到系统地、永久地保存,并为分析其遗传学差异奠定了基础.
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体液中肿瘤细胞的端粒酶活性
人类肿瘤及肿瘤细胞系研究表明端粒酶活性对于永生性肿瘤细胞生长可能起到关键作用.在18种组织细胞培养体系中,100株永生细胞系有98株表达端粒酶活性.当人Hela细胞培养物转种于抗人端粒酶RNA寡核苷酸抗血清培养体系中,端粒逐渐丢失,当端粒缩短到某一特定长度时,就会导致细胞死亡.端粒酶在人体癌症中的表达是在卵巢癌中首次得到证实的,继而约在多种人类肿瘤的85%样本中发现,例如乳腺癌(93%)、原发性肺癌(80%)、大肠癌(77%～97%)、肝细胞癌(85%)、胃癌(85%)、脑癌(66%～94%)、血液肿瘤(67%～100%)和子宫内膜癌(95%)等.正常体细胞大多未检出端粒酶活性,仅胚胎细胞、男性生殖细胞、造血干细胞和活化淋巴细胞中有表达.因此分析和研究端粒酶活性,对于癌变的诊断、作为癌症化疗策略的抗端粒酶药物的潜在作用,都是十分令人感兴趣的[1,2].
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中国海南黎族永生B细胞系的建立与保存
继人类基因组计划之后,人类基因组多样性计划(Human Genome Diversity Project, HGDP )已成为世界科学研究的热点之一.从世界各地采集不同人群的标本并建立永生细胞系,是HGDP的重要内容[1～3].黎族是中华民族的重要成员,集居海南岛.语言属汉藏语系壮侗语族黎语支.
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猪内源性逆转录病毒基因在版纳微型猪近交系骨髓间充质干细胞永生细胞系的整合和表达研究
目的检测猪内源性逆转录病毒(PERV)在猪细胞长期传代过程中的基因整合和表达.方法通过提取已建立的版纳微型猪近交系(BMI)骨髓间充质干细胞 (MSCs) 永生细胞系的DNA及细胞总RNA,用PCR、RT-PCR方法检测PERV前病毒gag、pol和env基因的整合和表达,并对PERV的亚型进行鉴定. 结果从原代BMI-MSCs至连续传代到150、180代的BMI-MSCs细胞基因组中都检测到了PERV前病毒DNA的整合及其mRNA的表达,PERV亚型为PERV-A、B型. 结论 PERV在BMI近交过程中及猪细胞体外长期传代过程中均未消失,PERV基因已经整合入其天然宿主的基因组内并能稳定表达.
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端粒酶与宫颈癌诊治的研究进展
端粒与端粒酶的生物学研究已取得了一定进展,特别是证实端粒酶在肿瘤的发生发展上具有重要作用.根据报道统计[1～3],在恶性肿瘤组织和永生细胞系中端粒酶阳性率高达 85%～95%,而在良性肿瘤及正常组织中端粒酶阳性率低于4%,因此选择端粒酶作为治疗恶性肿瘤的靶点,可能对多种恶性肿瘤有效,其对正常组织的毒副作用可能小.宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,病死率高,而以端粒酶为靶治疗宫颈癌的实验研究国内外报道甚少.本文就近年来有关端粒酶、端粒酶抑制剂与宫颈癌的相关研究进展作一综述.
