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丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶及抑制剂研究进展
丙型肝炎病毒(heptitis cvirus,HCV)丝氨酸蛋白酶(serine protease)是催化病毒前体蛋白中非结构蛋白部分裂解的关键蛋白酶.对病毒复制和宿主细胞都有重要作用,是当前抗病毒研究的一个重要靶点.本文从丝氨酸蛋白酶结构、功能和抑制剂等三方面,介绍丝氨酸蛋白酶的研究进展,这对该酶抑制研究和丙型肝炎的治疗研究会有积极意义.
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HCV NS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究进展
丙型肝炎病毒感染显著的特征是慢性化,已经成为严重的社会公共卫生问题.目前治疗方法仅限于干扰素-利巴韦林联合使用,持续疗效有限而且副作用大,因此迫切需要寻找特异有效的抗病毒药物.HCV NS3基因编码的NS3蛋白具有丝氨酸蛋白水解酶、解旋酶和磷酸核苷酶活性,在病毒RNA复制和多聚蛋白前体的加工成熟中有着重要作用.因此,NS3丝氨酸蛋白酶的抑制剂是抗病毒的理想药物.本文就HCV NS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究综述如下.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的研究进展
丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3共有631个氨基酸组成,具有丝氨酸蛋白酶和三磷酸核苷酶(NTPase)和螺旋酶(Helicase)的功能,在HCV多聚蛋白的成熟和病毒复制过程中发挥重要作用.非结构蛋白NS3具有较强的免疫原性和抗原性,是检测HCV感染的主要抗原之一.近年的研究发现NS3内部的裂解产物更具有致癌潜能.此外,NS3蛋白还参与NS5A的超磷酸化修饰过程等.
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羊瘙痒因子139A感染引起小鼠脑组织中的α1-ACT表达增加
目的 探究α1-ACT在羊瘙痒因子139A感染小鼠脑组织中的变化情况.方法 利用蛋白免疫印迹、免疫组织化学、间接免疫荧光及荧光共聚焦方法分析羊瘙痒因子139A感染小鼠脑组织中α1-ACT表达的变化和分布特点.结果 蛋白免疫印迹方法显示在羊瘙痒因子139A感染小鼠终末期脑组织中α1-ACT的含量较正常对照小鼠明显上调且随着潜伏期的延长而逐渐增加;免疫组织化学方法发现α1-ACT主要分布于羊瘙痒因子139A感染小鼠的皮层、丘脑和小脑区域;间接免疫荧光实验显示羊瘙痒因子139A感染终末期小鼠脑组织中补体成分C3含量明显增加,同时荧光共聚焦实验表明α1-ACT与补体成分C3存在明显的共定位现象.结论 羊瘙痒因子139A感染终末期小鼠脑组织中α1-ACT含量明显增加.
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发热性中性粒细胞减少白血病患儿血浆人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2水平分析
全球范围内由于恶性肿瘤而接受化疗的患者中中性粒细胞减少极其常见,不明原因的发热是这些患者感染时的唯一征象。感染以及感染所引起的并发症是白血病患儿高发病率和高病死率的一个主要原因。人甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2(mannan-associated serine protease 2, MASP-2)属于丝氨酸蛋白酶家族,MASP-2是天然免疫系统中的重要组分,通常与甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin ,MBL )结合,以复合物形式存在,只有当 MBL的胶原区暴露,或者凝集素区域结合可导致胶原区构象改变而暴露隐蔽位点,才能激活补体凝集素途径和胶原样区域调理吞噬作用清除病原体和受感染细胞[1]。研究发现,MBL 和 MASP-2与许多疾病的感染风险增加密切相关,例如血液病、风湿性关节炎、呼吸道感染等[2]。本实验应用酶联免疫吸附法(ELISA)探讨MASP-2在发热性中性粒细胞减少(neutropenic febrile ,FN )的白血病患儿血清中的表达及临床意义。
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四妙勇安汤联合西药对急性冠状动脉综合征热壅血瘀证患者PCI术后t-PA及MCP-1的影响
急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)是冠心病的危险阶段.其病理基础是在脆性斑块破裂或内皮损伤基础上造成的冠脉血栓性闭塞或冠脉严重狭窄[1].研究表明炎症反应对斑块的形成和破裂起决定性的作用[2-4].组织型纤溶酶原激活物( tissue type plasminogen activator,t-PA)是一种丝氨酸蛋白酶,能引起纤维蛋白溶解,直接或间接参与炎症反应[5].
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肿瘤相关胰蛋白酶原-2的研究进展
胰蛋白酶原-2(trypsinogen-2,T-2)是一种丝氨酸蛋白酶,由于它和肿瘤有密切关系,故又称为肿瘤相关胰蛋白酶原-2(TAT-2).TAT-2特征:(1)很多肿瘤细胞株和人体肿瘤均表达TAT-2,在临床上有辅助诊断的意义;(2)它与肿瘤的侵袭和播散机制有关,因为TAT-2可直接或间接地引起肿瘤周围基质蛋白的水解而形成肿瘤的侵袭;(3)TAT-2抑制剂(TATI)可抑制肿瘤侵袭;(4)TAT-2多产生于胰腺外的器官或组织.另外,T-2为急性胰腺炎的诊断指标,临床上应意鉴别.
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微小牛蜱凝血酶抑制剂的分离纯化与活性研究
从半饱吸血的微小牛蜱(Boophilus microplus)唾液腺中分离纯化到了一种凝血酶抑制剂,用飞行质谱测定该抑制剂的分子量为6 752 Da,不同于已知的从蜱类来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂.这是世界上首次报道的从微小牛蜱唾液腺分离出来的凝血酶抑制剂.该抑制剂对凝血酶表现强烈的抑制活性,对激活的第X因子和胰蛋白酶具有微弱的抑制活性.
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组织激肽释放酶相关肽酶的作用和治疗潜力的研究进展
组织激肽释放酶家族由15种分泌型丝氨酸蛋白酶组成,是由人类基因组中大的蛋白酶基因簇编码.在过去10年间,关于激肽释放酶的底物、内源性抑制剂以及在体内功能方面的研究已取得巨大进步.研究表明,这些蛋白酶在不同组织中具有病理生理学作用,并且目前认为激肽释放酶是研发气道、心血管、牙齿、皮肤和肿瘤疾病新型药物的潜在靶点.因此,阐述激肽释放酶生理功能和病理意义方面认识的新进展,并了解鉴定激肽释放酶抑制剂中的进步,有助于我们在特定疾病环境下更好地靶向激肽释放酶.
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特异性分布于心脏的丝氨酸蛋白酶--Corin
蛋白酶参与心血管活性肽类的活化和降解,对其生物学效应具有重要的调节意义.丝氨酸蛋白酶是一类II型跨膜嵌合蛋白酶超家族,参与体内多种重要的生理过程.Corin是新发现的第一个特异性分布于心脏并参与心血管活性肽前体原转化的丝氨酸蛋白酶,可将心钠素原和脑钠素原转化为心钠素和脑钠素,并通过调控心钠素和脑钠素的生成而间接调节血压.本文简要介绍Corin的分子特征及生理和病理生理意义.
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大劣按蚊血淋巴中丝氨酸蛋白酶的分离与鉴定
目的 分离大劣按蚊血淋巴中的丝氨酸蛋白酶并进行鉴定. 方法 采集感染约氏疟原虫后24 h的大劣按蚊血淋巴,利用SDS-PAGE进行血淋巴蛋白的分离.然后,分别用烟草天蛾丝氨酸蛋白酶PAP1、PAP2和PAP3抗体进行 Western blot,检测血淋巴中相应的丝氨酸蛋白酶. 结果 SDS-PAGE分离出31条血淋巴蛋白带,分子质量单位为10~200 ku.Western blot结果显示,44 ku蛋白能被PAP1、PAP2和PAP3抗体识别,27 ku蛋白能被PAP1和PAP3抗体识别,38 ku蛋白能被PAP2抗体识别. 结论 成功分离和鉴定出了大劣按蚊血淋巴中的丝氨酸蛋白酶.
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按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶与疟原虫卵囊黑化关系研究
目的探讨丝氨酸蛋白酶与疟原虫卵囊黑化的相互关系. 方法将斯氏按蚊分为吸糖水组、吸正常小白鼠血组、吸约氏疟原虫感染血组和吸硝喹糖水组,挤压法收集雌斯氏按蚊血淋巴,Bradford法检测血淋巴蛋白浓度,继而对血淋巴进行SDS-PAGE,电转移后检测丝氨酸蛋白酶的表达差异. 结果 4 组斯氏按蚊丝氨酸蛋白酶Western印迹均呈现两条带,分子质量分别约 160和150 ku,与吸糖水组比较,吸正常小白鼠血组丝氨酸蛋白酶表达稍高,而感染约氏疟原虫后斯氏按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶表达明显增强,感染第6 d达高峰,之后表达下调,而硝喹诱导黑化后丝氨酸蛋白酶表达水平呈逐日下调趋势. 结论斯氏按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶参与了疟原虫卵囊黑化包被反应.
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聚合酶链反应诱导丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性位点的突变及突变HCVNS3/4a蛋白的表达
目的以聚合酶链反应(PCR)突变方法诱导丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性位点ser1165的突变,获得全长非结构基因3(NS3)/4a的表达与纯化. 方法分别以NS3 N端正向引物与诱变反向引物,诱变正向引物与NS4a C端反向引物获得2个PCR产物,产物纯化后在新的PCR反应体系中加入以上2个PCR产物与NS3 N端正向引物、NS4a C端反向引物.再次PCR扩增突变模板,分别与野生型模板重组入表达载体pET26-Ub,转化大肠杆菌BL21(DE3)pCG1,诱导表达后经菌体裂解、纯清化、硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose、NTA纯化,Western blot分析表达蛋白的特异性及PCR诱导突变使HCV蛋白酶活性位点失活的作用. 结果获得诱导突变的模板,Western blot证实该突变可完全阻断对NS3丝氨酸蛋白酶与NS3螺旋酶间的切割,部分阻断了螺旋酶与NS4a间的切割.纯化后的HCV NS3/4a蛋白在SDS-PAGE胶上显示为双带. 结论 PCR突变方法简便、有效,获得丝氨酸蛋白酶失活的NS3蛋白表达,NS3蛋白与NS4a蛋白以复合物形式存在.
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丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶抗原性分析及特异性抗体制备
目的分析丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白酶的抗原性并制备特异性抗体. 方法构建表达质粒并且在大肠杆菌中可溶性表达单链型丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶;以纯化后的重组蛋白包被酶联板对86份献血员和12份健康人血清中的特异性抗体进行检测;将纯化蛋白偶联到Sepharose 4B上制备亲和纯化柱,对丙肝病毒感染者血清中的特异性抗体进行亲和纯化;以纯化蛋白免疫小鼠,制备特异性单克隆抗体,对纯化后的人多抗和鼠单抗进行鉴定. 结果以纯化的重组单链丝氨酸蛋白酶为抗原检测98份血清,结果阳性率为73.9%,商品试剂盒漏检的1份血清中也检测出特异性抗体.用重组蛋白从200ml HCV感染者血清中亲和纯化到4.57mg多克隆抗体,效价达107,特异性很好.制备的4株IgG类鼠单抗,无交叉反应,能够被人血清抗体竞争性抑制. 结论表达的HCV丝氨酸蛋白酶具有良好的抗原性,在HCV感染人群中该区域抗体的阳性率较高,制备了特异性很好的多克隆抗体和单克隆抗体.
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人组织激肽释放酶6在胃癌中的表达及其临床意义
胃癌是常见恶性肿瘤之一,由于起病隐匿,早期诊断极为困难,目前尚未发现特异性肿瘤标志.人组织激肽释放酶基因家族(Kallikreins,KLKs)是近年发现的肿瘤标志家族,KLK6基因是该家族成员之一,其编码的蛋白--人组织激肽释放酶6(human kallikrein 6,hK6)是由223个氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶,具有胰蛋白酶样活性[1].国外研究发现,hK6参与了人类多种恶性肿瘤的形成过程,且与肿瘤的侵袭、浸润和转移等生物学行为密切相关[2-3],但hK6与胃癌的关系在国内尚鲜见报道.我们采用免疫组织化学链霉菌抗生素蛋白一过氧化物酶连接法(SP)检测hK6在胃癌、胃溃疡和正常胃黏膜组织中的表达情况,并探讨hK6表达与胃癌患者临床病理参数间的关系.
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微粒子酶免疫分析法检测前列腺疾病患者血清中前列腺特异性抗原
前列腺特异性抗原(PSA)是一种分子量为34 000的糖蛋白,1979年由Wang分离,是一种由激肽释放的丝氨酸蛋白酶,由前列腺上皮细胞产生.我们用MEIA法检测了104例前列腺疾病患者与30名健康体检者以及40例其他各种癌症患者血清中的PSA.
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TEM型β内酰胺酶的特征及其研究进展
TEM型β内酰胺酶是目前世界上为流行且种类多的质粒编码丝氨酸蛋白酶,其中TEM-1是革兰阴性菌中常见的β内酰胺酶,约90%对青霉素耐药的大肠埃希菌都产生TEM-1[1].除肠杆菌科菌外,近年来TEM-10在葡萄牙的克吕沃尔菌属[2]、TEM-21在美国的绿脓假单胞菌[3]、TEM-52在韩国的宋内志贺菌[4]、TEM-52、TEM-63、TEM-131在韩国[5]和南非[6]的非伤寒沙门菌中也有报道.截止2006年1月30日,Bush和Jacoby在Lahey网站(http://www.lahy.org/studies/webt.htm)上已公布了150种TEM型β内酰胺酶,其中2000-2006年就发现了70多种.
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凝血酶致脑微血管内皮细胞凋亡作用
脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell,BMVEC)在脑疾病发生、发展中占重要地位[1].近年来,BMVEC的体外培养方法已获成功[2].凝血酶是一种血清丝氨酸蛋白酶,除参与凝血外,它还促进BMVEC收缩并增加其通透性[3],并与肺动脉内皮细胞及神经元凋亡相关[4~6].本实验用体外原代培养的大鼠BMVEC研究凝血酶的作用,并用其受体拮抗剂水蛭素探讨致病机制.
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甲状腺结节性病变中组织因子途径抑制剂-2、跨膜丝氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶-1蛋白的表达及意义
组织因子途径抑制剂-2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)可与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)及MMPs前体结合,抑制MMPs及跨膜丝氨酸蛋白酶(transmembrane protease serine 4,TMPRSS4)等对细胞外基质的破坏作用[1-2].本研究采用免疫组化(IHC)方法检测结节性甲状腺肿、甲状腺滤泡状腺瘤和甲状腺乳头状癌中TFPI-2、TMPRSS4和MMP-1的表达及意义.
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Ⅶ因子活化蛋白酶在博来霉素所致大鼠肺损伤和肺纤维化过程中的表达
急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是临床常见的一种急性、进行性缺氧性呼吸衰竭,病死率高达40%[1].幸存者往往会发生不同程度的肺纤维化.以往认为,肺纤维化仅发生在ARDS晚期.而近的研究表明,在ARDS的早期即有肺纤维化的发生,针对ARDS早期纤维增生的治疗有可能改善ARDS患者的预后[2].Ⅶ因子活化蛋白酶(FSAP)是近年来发现的一种丝氨酸蛋白酶,除了具有促凝和抗纤溶活性外,还能抑制生长因子介导的细胞增殖与迁移[3].