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感染约氏疟原虫的斯氏按蚊组织化学观察
目的观察蚊媒感染疟原虫后的组织化学变化.方法应用组织化学技术观察对照组和感染约氏疟原虫的斯氏按蚊体内乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、三磷酸腺苷酶(Mg2+-ATPase)活性反应与含量以及糖原含量的变化.结果与对照组相比,感染约氏疟原虫后,蚊体内LDH活性与含量显著增加,SDH和Mg2+-ATPase活性与含量及糖原含量显著降低.结论感染约氏疟原虫可明显影响蚊媒的营养代谢和吸收.
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按蚊中肠前酚氧化酶原与约氏疟原虫卵囊黑化的关系
目的分析约氏疟原虫卵囊黑化期间按蚊中肠内前酚氧化酶原(Prophenoloxidase,PPO)的变化,探讨中肠PPO与疟原虫卵囊黑化的关系. 方法解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后3、5、7、11和15 d斯氏与大劣按蚊中肠,匀浆后经SDS-PAGE和转膜,以抗烟草天蛾PPO的抗体进行免疫印迹分析,并于感染后第5 d开始在镜下观察约氏疟原虫卵囊黑化情况,直至第15 d止. 结果斯氏与大劣按蚊中肠在约氏疟原虫感染前和感染后的不同时期经免疫印迹均可检测到1条分子质量约为67 ku的PPO阳性蛋白带,但感染后的PPO蛋白带比感染前明显增强,而且同时间点大劣按蚊中肠PPO蛋白带比斯氏按蚊明显,尤其在感染的后期大劣按蚊中肠PPO蛋白带明显比斯氏按蚊增强;在感染后7 d可见大劣按蚊中肠内发育的约氏疟原虫卵囊部分黑化,在15 d时可见疟原虫卵囊完全黑化. 结论按蚊中肠PPO含量增加,尤其是长时间内维持在较高水平与约氏疟原虫卵囊黑化密切相关.
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大劣按蚊血淋巴中丝氨酸蛋白酶的分离与鉴定
目的 分离大劣按蚊血淋巴中的丝氨酸蛋白酶并进行鉴定. 方法 采集感染约氏疟原虫后24 h的大劣按蚊血淋巴,利用SDS-PAGE进行血淋巴蛋白的分离.然后,分别用烟草天蛾丝氨酸蛋白酶PAP1、PAP2和PAP3抗体进行 Western blot,检测血淋巴中相应的丝氨酸蛋白酶. 结果 SDS-PAGE分离出31条血淋巴蛋白带,分子质量单位为10～200 ku.Western blot结果显示,44 ku蛋白能被PAP1、PAP2和PAP3抗体识别,27 ku蛋白能被PAP1和PAP3抗体识别,38 ku蛋白能被PAP2抗体识别. 结论 成功分离和鉴定出了大劣按蚊血淋巴中的丝氨酸蛋白酶.
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约氏疟原虫SAP1重组DNA疫苗的构建及鉴定
目的 构建含有约氏疟原虫SAP1(sporozoite asparagine-rich protein 1)截短基因的重组DNA疫苗,并进行鉴定. 方法 应用生物学信息软件预测分析并扩增SAP1截短基因,将该基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达载体pcDNA3.1(+)/SAP1.将重组载体转染COS-7细胞,进行体外瞬时表达并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定. 结果 成功扩增SAP1截短基因并构建含有该基因的真核表达载体pcDNA3.1 (+)/SAP1,其体外瞬时表达产物能与多克隆抗血清发生特异性结合反应. 结论 构建的重组DNA疫苗可在哺乳动物细胞中瞬时表达,表达的蛋白具有免疫反应性,其免疫保护作用有待进一步研究.
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大劣按蚊和斯氏按蚊对约氏疟原虫不同易感性的遗传多态性研究
目的比较分析对约氏疟原虫易感的斯氏按蚊和不易感的大劣按蚊的基因组DNA的多态性,探讨媒介按蚊与疟原虫遗传基因间的相互关系. 方法设计5条随机引物,应用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD )技术对斯氏按蚊、大劣按蚊成蚊(未感染蚊和感染蚊)及其幼虫的基因组DNA进行随机扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后分析. 结果 5条随机引物对2种按蚊扩增的条带数不同,其中P5对斯氏按蚊扩增的效果较好,共16～17条带型,长度为200～1 800 bp;P4对大劣按蚊扩增效果较好,出现17条带型,长度为180～1 500 bp;P1对大劣按蚊无扩增产物.用P3对2种按蚊扩增,感染前后的扩增产物电泳条带数相同,但亮度不同;成蚊与幼虫带型数量不同,斯氏按蚊成虫与幼虫有3条相同带型(400、650、850 bp),大劣按蚊成虫与幼虫有4条相同带型(350、500、750、800 bp);大劣和斯氏按蚊成蚊带型分别为10和13条,其中相同带型6条(300、350、400、550、600、800 bp). 结论斯氏按蚊和大劣按蚊之间存在基因差异.同种未感染蚊和感染蚊基因带型仅存在亮度差异,而幼虫与成虫的基因差异较大.
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NK细胞在TLR9激动剂CpG抑制肝期约氏疟原虫发育中的作用
目的 探讨NK细胞在TLR9激动剂CpG抑制肝期约氏疟原虫发育中的作用. 方法 小鼠尾静脉注射NK细胞拮抗剂Anti-Asialo-GM1 40 μg后48 h给予1 000个约氏疟原虫BY265株子孢子攻击,采用Real-time PCR检测肝脏虫荷并血检疟原虫,分析CpG在NK细胞阻断小鼠中对肝期约氏疟原虫发育的影响. 结果 NK细胞阻断后GM1+CpG组小鼠肝脏虫荷与CpG组相比显著增加(t=3.539,P＜0.01),与PBS对照组相比显著降低(t=3.658,P＜0.01)；GM1组与PBS对照组比较差异无统计学意义(t=1.768,P＞0.05).CpG组未出现原虫血症,GM1+ CpG组出现原虫血症,但出现时间和PBS对照组相比推迟且原虫血症的峰值降低,小鼠逐渐自愈.PBS组和GM1组小鼠从感染第13d开始出现死亡,第15d全部死亡. 结论 NK细胞参与对肝期疟原虫的杀伤过程,TLR9激动剂CpG依赖NK细胞杀伤肝期疟原虫.
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斯氏按蚊PPO1基因克隆及其与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究
目的克隆和分析斯氏按蚊前酚氧化酶基因与约氏疟原虫卵囊黑化关系. 方法 根据其他昆虫前酚氧化酶基因的保守氨基酸序列设计简并引物,以斯氏按蚊全蚊RNA为模板,进行RT-PCR扩增,PCR产物纯化,克隆入pUCm-T载体,测定插入片段序列,对序列进行BLAST检索和鉴定.根据序列设计相应基因的特异引物,然后分别从血淋巴细胞或中肠扩增目的基因,并进行不同食源条件下前酚氧化酶基因的半定量、原位核酸分子杂交定位及与约氏疟原虫卵囊黑化关系的分析. 结果 获得了1种斯氏按蚊血淋巴前酚氧化酶基因cDNA部分序列,即AsPPO1(600 bp),分别与冈比亚按蚊PPO1和大劣按蚊PPO2基因很相似,其编码的氨基酸序列均包含PO保守的铜结合位点CuA(HHWHWHLVYP)序列.在中肠和血淋巴内也获得相同的目的基因片段,半定量分析显示约氏疟原虫感染或诱导卵囊黑化呈现之前的表达明显增强,原位核酸分子杂交技术也进一步证实血淋巴有AsPPO1 mRNA表达. 结论 AsPPO1很可能与疟原虫感染或约氏疟原虫卵囊黑化相关.
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异株约氏疟原虫再感染BALB/c小鼠树突细胞的变化
目的 探讨不同虫种/株再感染的进程和结局以及宿主免疫应答模式. 方法 用非致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)17XNL感染BALB/c小鼠,治愈后用致死型Py17XL疟原虫再攻击,计数红细胞感染率,检测再感染后脾细胞中树突细胞亚群(DCs)及CD4+ CD69+T细胞百分率的变化. 结果 Py17XNL感染治愈组小鼠用Py17XL再攻击后几乎不出现原虫血症,观察期内全部存活,小鼠CD11c+ CD11b+ DCs及CD11c+ CD45R/B220+ DCs百分率显著低于初次感染Py17XL小鼠(P＜0.05),CD4+ CD69+T细胞百分率与Py17XL初次感染小鼠比较差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 细胞免疫参与了针对同/异种疟原虫再感染免疫保护,但作用十分有限.体液免疫应答或许是针对同/异种疟原虫再感染免疫保护的主要因素.
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疟原虫全虫疫苗长效保护性下降机制初探
目的 探讨疟疾红外期全虫疫苗免疫保护性随时间逐渐降低的机制. 方法 取C57BL/6及BALB/c小鼠,经尾静脉分别接种10 000或50 000约氏疟原虫(P.yoelii)17XNL子孢子,3h后给予氯喹控制红内期感染的发生.一部分小鼠于接种后30、90、180d用10 000同种疟原虫子孢子进行攻击检查保护性;另一部分在相同时间点取血,分离淋巴细胞,进行流式抗体染色,检测免疫保护性及其与肝脏淋巴细胞表型间的相互关系. 结果 疟原虫全虫抗原免疫后 30d两种小鼠均可产生100％的免疫保护;免疫后90d,C57BL/6保护性开始下降,180d时保护性将至40％,而BALB/ c小鼠保护性无明显变化.C57BL/6小鼠肝脏CD8+TEM细胞PD-1的表达在免疫后180d显著上升(t=7.369,P＜ 0.01),BALB/c小鼠无明显变化(t=1.368,P＞0.05).C57BL/6小鼠肝脏CD8+TEM细胞PD-1的表达免疫后随时间增加而升高,其中免疫后180d较90d时上升趋势更显著(t=6.175,P＜0.01). 结论 在C57BL/6小鼠,疟原虫红外期全虫疫苗免疫保护性随免疫时间延长逐渐降低与肝脏CD8+T细胞PD-1表达增高有关.
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约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白的二维电泳-质谱分析
目的分离和鉴定约氏疟原虫卵囊、唾液腺子孢子差异表达蛋白,找出疟原虫子孢子侵入相关蛋白.方法采用二维蛋白电泳技术分离感染和未感染约氏疟原虫的斯氏按蚊中肠和唾液腺差异表达蛋白,考马斯亮蓝染色,BIO-RAD凝胶扫描仪和PDQUest图象软件分析,差异蛋白点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其肽质指纹图谱,用Mascot在相应的查询条件下搜索NCBInr数据库.结果获得了分辨率和重复性均较好的一维和二维蛋白图谱.凝胶扫描结果发现未感染蚊中肠有135个蛋白点,感染蚊中肠有158个蛋白点,相同有107个,pI偏酸性.未感染蚊唾液腺有178个蛋白点,感染蚊唾液腺有201个蛋白点,相同有167个,pI分布较均匀.选择7个差异蛋白点进行分析,得到了6个蛋白肽质指纹图谱,查询数据库初步鉴定疟原虫来源的蛋白质有5个,另1个来源于蚊组织.疟原虫来源蛋白为一些表面蛋白、代谢和运动相关的蛋白等.结论建立了一种较好的疟原虫子孢子蛋白分离和鉴定方法,并证明约氏疟原虫唾液腺子孢子表达大量差异表达蛋白,部分可能与其识别、侵入宿主细胞有关.
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按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶与疟原虫卵囊黑化关系研究
目的探讨丝氨酸蛋白酶与疟原虫卵囊黑化的相互关系. 方法将斯氏按蚊分为吸糖水组、吸正常小白鼠血组、吸约氏疟原虫感染血组和吸硝喹糖水组,挤压法收集雌斯氏按蚊血淋巴,Bradford法检测血淋巴蛋白浓度,继而对血淋巴进行SDS-PAGE,电转移后检测丝氨酸蛋白酶的表达差异. 结果 4 组斯氏按蚊丝氨酸蛋白酶Western印迹均呈现两条带,分子质量分别约 160和150 ku,与吸糖水组比较,吸正常小白鼠血组丝氨酸蛋白酶表达稍高,而感染约氏疟原虫后斯氏按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶表达明显增强,感染第6 d达高峰,之后表达下调,而硝喹诱导黑化后丝氨酸蛋白酶表达水平呈逐日下调趋势. 结论斯氏按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶参与了疟原虫卵囊黑化包被反应.
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约氏疟原虫感染对小鼠红细胞膜蛋白组分及其与内皮细胞黏附力的影响
[目的]分析约氏疟原虫感染后小鼠红细胞膜蛋白及受染红细胞与内皮细胞黏附能力的变化,为进一步探索脑型疟的发生机制提供线索.[方法]提取约氏疟原虫感染的BALB/c小鼠红细胞膜蛋白,进行SDS-PAGE电泳,检测红细胞膜蛋白的变化.用内皮细胞株与小鼠红细胞共同培养,观察受染红细胞与内皮细胞黏附能力的改变.[结果]SDS-PAGE显示约氏疟原虫感染后的小鼠红细胞膜蛋白中含有分子质量约137 ku组分,53/54 ku固有膜蛋白减少.与未感染对照组比较,受染红细胞对内皮细胞的黏附能力增强约3倍,差异有统计学意义(P＜0.05).[结论]疟原虫感染可改变宿主红细胞膜蛋白组成,增强受染红细胞与内皮细胞的黏附力.这些变化可能与脑型疟的发生有关.
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瑞香素的抗疟作用及其高效液相色谱分析方法
目的研究中药瑞香素在体外和体内的杀疟原虫裂殖体作用、抗红细胞外期疟原虫作用及其高效液相色谱(HPLC)分析方法.方法在恶性疟原虫FCC1株常规体外培养中测试瑞香素杀裂殖体活性,并按"4 d抑制试验"在感染伯氏疟原虫ANKA株的小鼠中测定不同剂量瑞香素的体内抗疟活性.于癌症研究所(ICR)小鼠腹腔注射约氏疟原虫子孢子后0.5 h灌胃给药,连续4 d.不同剂量的瑞香素及瑞香素与伯氨喹(PQ)配伍用药的抗疟作用分别以第8天ICR小鼠阴性率及第12天或第13天ICR小鼠每千个红细胞被原虫感染数评价.再以高效液相色谱及质谱的方法分析鉴定瑞香素及其两个结构类似物:香豆素,7-羟基香豆素.结果体外试验中瑞香素在1～10μmol/L剂量范围内有明显杀裂殖体作用,而体内试验中按第5天减虫率与感染鼠在30 d内的平均生存天数评价,50或100 mg·kg-1·d-1×4 d瑞香素灌胃以及10、50或100 mg·kg-1·d-1×4 d瑞香素腹腔注射给药在伯氏疟原虫ANKA株感染鼠中的抗疟作用与10 mg·kg-1·d-1×4 d氯喹(CQ)灌胃的疗效相似.瑞香素的剂量范围为每天10～100 mg/kg,连服4 d,第8天原虫阴性小鼠数及第12天红细胞被感染程度与对照组相比差异均无显著性;瑞香素每天50 m/kg和每天PQ 5 mg/kg配伍组的第8天小鼠阴性率与PQ每天10 mg/kg组相当.运用特定的高效液相色谱方法,瑞香素与其结构类似物可达完全的基线分离,分析灵敏度为10～20 ng;经质谱分析确定各化合物的分子量正确.结论瑞香素在体外和体内均有一定的杀裂殖体活性.瑞香素单独用药,无明显抗红细胞外期疟原虫作用,但瑞香素每天50 mg/kg与PQ每天5 mg/kg配伍用药的抗疟效果与PQ每天10 mg/kg相当.高效液相色谱方法可实现对中药瑞香素的准确、精密的定量分析.
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差异显示逆转录PCR鉴定约氏疟原虫红前期发育相关基因及其特征分析
目的 寻找约氏疟原虫红前期发育相关基因,进行序列分析并推测其功能.方法分别提取约氏疟原虫感染人鼠(IL)和正常大鼠(UL)肝脏总RNA,根据疟原虫基因A+T含昔高(＞70%)的特点,设计可选择性扩增约氏疟原虫基因的G+C含量为40%的引物,采用差异显示RT-PCR(differential display RT-PCR,DD-PCR)技术进行扩增,筛选筹异片段,经TA克隆后测序并进行序列分析. 结果获得6个约氏疟原虫红前期发育相关基因 PyHs4、PyHs5、PyHs6、PyHs7、PyHs8、PyHs9;其中PyHs4与约氏疟原虫乙酰葡糖胺磷酸变位酶(phosphoacetylglucosamine mutase,AGM,ID:PY02130)基因具有91%的柑似性,PyHs5与约氏疟原虫红细胞膜蛋白3(erythrocyte membrance prontein 3.PyEMP3,ID:PY05500)基因具有100% 的同源性,PyHs6、PyHs7、PyHs8、PyHs9经Blast序列分析为疟原虫基因,但功能未知.结论应用DD-PCR技术成功扩增了约氏疟原虫红前期发育相关基因,为进一步进行重组表达、功能及疫苗研究奠定了基础.
关键词： 疟原虫 约氏 差异显示逆转录聚合酶链反应 红前期 差异基因 -
感染约氏疟原虫的中华按蚊基因差异表达分析
全世界按蚊有500余种,不同蚊种的传疟效能差异很大.阐明蚊媒传疟效能差异的调控机制,探索控制疟疾传播的新策略,是当前疟疾防治研究的新课题.本研究试图通过基因表达系列分析[1],从感染疟原虫的蚊媒体内分离特异表达的cDNA片段,并进一步论证其与感染的相关性.
