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人脐带间充质干细胞对小鼠衰老进程中骨髓细胞集落生成的影响
目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)对小鼠衰老进程中骨髓造血干祖细胞增殖能力的影响.方法:由足月新生儿脐带分离间充质细胞(MSC)作供体,6月龄Balb/c小鼠为受体,将小鼠随机分为实验组和对照组,实验组输注MSC(5×10~5/只),每月1次,共4次;对照组输注生理盐水.干预开始后第3个月和第6个月分别比较两组的单侧股骨骨髓有核细胞计数(BMNC)、造血祖细胞集落培养(CFU-GM、CFU-E、CFU-MK)和外源性脾集落形成单位计数(CFU-S).结果:干预后第3个月时,实验组BMNC、CFU-GM和CFU-MK高于对照组,而CFU-E和CFU-S无明显差别;干预后第6个月时,实验组的上述指标均明显高于对照组,且随着衰老出现下降的速度明显慢于对照组,差异有显著性(P<0.05).结论:定期输注hUC-MSC可以相对增加宿主自身造血干祖细胞的生物学活性,从而延缓小鼠造血组织的自然衰老进程.
关键词： 间质干细胞 脐带 衰老 造血干细胞 集落生成单位(CFU) -
间质干细胞来源、鉴定、可塑性和应用前景(综述)
间质干细胞(MSCs)存在于骨髓、肌肉、骨、软骨等部位,可分化为中胚层的细胞,如成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞等,亦可分化为内胚层、外胚层的细胞,如神经细胞、肝脏细胞、肾脏细胞等,同时由于来源广、易于分离扩增和基因转染,在临床、科研上有很大的潜在应用价值.
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骨髓间质干细胞对大鼠移植物抗宿主效应和脾脏结构的影响
[目的]探讨骨髓间质干细胞(MSC)对同种大鼠骨髓移植后移植物抗宿主反应(CVHD)的影响.尤其是MSC对脾脏结构重建的作用.[方法]建立Fischer344(RT-1AI)大鼠至Wistar(RT-1Au)大鼠的同种异体骨髓移植模型,观察移植后大鼠的基本生活情况,病理学分析靶器官皮肤、肝脏、肠道和脾脏的组织学改变.尤其注意MSC对同种骨髓移植后脾脏结构重建的影响.[结果]①在移植后30 d的观察期内.共移植组显示较高的生存率.②组织学分析显示:在共移植组,靶器官皮肤、肝脏、肠道的损伤相对较轻.③脾脏组织学分析显示:在骨髓与MSC共移植组,受体脾脏结构接近正常;在单纯骨髓移植组,受体脾脏白髓萎缩.动脉周围淋巴鞘只有少量T细胞,无典型脾小结形成.[结论]MSC与骨髓共移植对GVHD有抑制作用,并显著促进脾脏结构重建.
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人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能
[目的]观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能.[方法]从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养.将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测.向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂,检测其多向分化能力.[结果]脐血间质干细胞原代培养时间为7周.流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性,但是它们不表达造血干细胞表面标志物.加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达.采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导,用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达.在加入成脂诱导剂后,会导致细胞形态学改变,且油红O染色为阳性.[结论]通过体外传代培养的方法可以从人脐血单个核贴壁细胞中得到纯化的间质干细胞,脐血有望成为间质干细胞的替代来源.
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人卵黄囊间质干细胞多向分化潜能的实验研究
[目的]分离纯化及体外观察人卵黄囊间质干细胞(hYS-MSC)的多向分化潜能.[方法]卵黄囊单细胞悬液经贴壁培养、传代纯化得到hYS-MSC,并从细胞表型及生物学特性等方面对其进行鉴定;采用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C作成骨诱导剂、β-巯基乙醇或复方丹参注射液作为神经诱导剂、地塞米松、消炎痛、胰岛素作为成脂诱导剂诱导hYS-MSC向成骨细胞、神经细胞及脂肪细胞定向分化.组织化学方法作成骨检测;免疫组化方法检测NSE、NF及GFAP在经神经诱导hYS-MSC中的表达;油红O染色检测中性脂肪.[结果]hYS-MSC易于纯化,在培养过程中保持正常核型,具有较大增殖能力.hYS-MSC CD29、CD44、CD166及CD105表达阳性,CD34、CD45和CD86为阴性;AKP弱阳性.hYS-MSC经成骨诱导AKP强阳性,诱导两周后形成钙盐沉积形成的矿化区.hYS-MSC经神经诱导可见NSE、NF或GFAP阳性细胞,符合神经元及胶质细胞的生物学特征.hYS-MSC经成脂诱导转化为大小不等的园形或椭圆形细胞,胞浆内可见脂滴形成,胞核被挤于细胞的一侧,经油O染色脂滴染橘红色,符合脂肪细胞的生物学特征.[结论]hYS-MSC与成体MSC表型一致,具有较大增殖及多向分化潜能,在体外可以诱导分化为成骨细胞、神经元、胶质细胞及脂肪细胞.
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人中期胚胎、新生儿脐血及成人骨髓间质干细胞基本生物学特性的比较
[目的] 比较人中期胚胎脐血、新生儿脐血以及成人骨髓 3种来源的间质干细胞( MSC)生物学特性,为临床治疗选择细胞来源提供实验依据.[方法] 采用 L- DMEM培养液分离培养 3种来源 MSC,流式细胞仪进行细胞表型、细胞周期、细胞凋亡分析,成骨、成脂诱导液分别诱导细胞分化,携带绿色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒转染 MSC,荧光显微镜和流式细胞仪检测 3种细胞表达外源基因特性.[结果] 3种来源标本中均可分离培养出 MSC,但新生儿脐血中阳性获得率低,为 29.17% (7/24); 3者细胞形态、表面抗原表达、体外分化特性相似,但 2种脐血 MSC原代培养时间长达 30 d左右,处于 G0/G1期细胞百分比大于成人骨髓; 3者均能转染表达外源基因,但胚胎脐血 MSC中表达率高,达( 56.32± 3.28)%.[结论] 胚胎、新生儿脐血以及成人骨髓中均可分离培养出 MSC;中期胚胎脐血 MSC适用于胎儿自体宫内基因转移 /治疗( IUGT)靶细胞;成人骨髓 MSC在组织工程、细胞治疗、基因治疗等领域具有广阔的临床应用前景;而新生儿脐血 MSC的临床应用有待进一步研究.
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成人骨髓间质干细胞基本生物学特性
[目的]研究成人骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性.[方法]采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液分离成人MSC,体外扩增,比较不同培养基和血清含量对MSC生长的影响,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达.[结果]成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得(5～6)×105个细胞,15代可获得(3～4)×1012个细胞,随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降.L-DMEM培养基有利于细胞的培养扩增.细胞流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD59、CD105、CD166表达阳性,CD11a、CD14、CD33、CD34、CD45、CD38、CD80、CD86、CD117表达为阴性.[结论] MSC有很强的自我更新能力,在组织工程中具有广阔的应用前景.
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胃肠道间质瘤的组织起源研究进展
1983年MAZUR等[1]首次提出了胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors,GIST)的概念,但对于这组既无平滑肌分化又无神经分化特征的肿瘤的组织起源是争议不断的.1998年HIROTA等[2]发现它与胃肠道肌间神经丛周围胃肠道卡哈尔细胞(intestitial cells of Cajal,ICC)存在相似之处,于是产生了GIST起源于ICC的学说.但亦有学者认为GIST应起源于更原始的具有多潜能分化的中胚叶的间质干细胞[3].以下就GIST的细胞分布、超微结构、分子生物学及免疫组化等方面对其组织起源研究进展作详细的论述.
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结直肠癌中肿瘤干细胞和肿瘤血管新生的研究进展
结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，目前临床治疗方案是以手术切除为主，但效果不甚理想。其癌变为人正常细胞经过一系列细胞及表观遗传改变，逐步转变为恶性增殖细胞的多阶段进程［1］。新研究发现，结直肠癌具有2个显著的病理特点：肿瘤干细胞的无限增殖及血管新生，而两者的形成都与肿瘤微环境有关［2］。肿瘤微环境由血管周围的肿瘤相关成纤维细胞（ cancer associated fibroblasts ， CAF ）、巨噬细胞、淋巴细胞、周细胞、炎症细胞、正常上皮细胞及间质干细胞（ mesenchymal stem cell ， MSCs ）等形成， CATALANO等［3］研究发现，肿瘤微环境的刺激可导致癌症细胞中干细胞样细胞的诱导表达；QUANTE等［4］认为肿瘤微环境对血管的生成起到了至关重要的促进作用。因此，了解肿瘤微环境中的肿瘤干细胞及血管新生，是研究结直肠癌的发生过程和开展针对性治疗的基础。国内关于结直肠癌与肿瘤微环境、肿瘤干细胞、肿瘤微环境的综述文章，都是针对三者中的一种来阐述，目前，还没有系统的把结直肠癌与三者之间的关系表述出来的文章。本综述总结了目前关于肿瘤干细胞和肿瘤血管新生在结直肠癌中的相关研究进展，为未来制订个性化治疗方法，提高患者存活率，改善生存环境及降低化疗药物带来的不良反应提供参考。
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建立治疗类生物制品间质干细胞培养液质量控制体系的初步研究
目的 以间质干细胞为研究载体,初步研究治疗类生物制品间质干细胞培养液质量控制体系.方法 15例健康骨髓供者的间质干细胞系,对MSCs增殖能力,细胞均一性进行检测,并对培养液中的HIV、HCV、HBV、TP的感染性进行检测,持续监测培养液的pH值以及细菌内毒素的含量.结果 体外扩增5代细胞数约1×107,扩增8代约为1×109,扩增10代细胞数约2×1010,扩增15代可获得的细胞数为(3 ～4)×1012.培养液中的HIV、HCV、HBV、TP中,MSC3的TP检测阳性.第一天培养液pH 7.0±1.43,第三天培养液pH6.2±1.55.P10代移植前细胞进行内毒素检测,内毒素(0.32±:0.15) EU.结论 治疗类生物制品中培养液在质量控制体系中举足轻重,要在满足临床需要的前提下,对培养液进行关键控制,确保临床应用安全有效.
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人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的研究
目的：探讨人脐带间充质干细胞在无血清培养条件下体外分化为胰岛素分泌细胞的效果。方法：分离培养人脐带间充质干细胞，在无血清培养液中添加尼克酰胺、活化素A、肠促胰岛素类似物－4、肝脏生长因子、胃泌素对其进行诱导分化，对分化后的细胞进行鉴定，检测胰岛素分泌情况。结果：分离的细胞具有典型的间充质干细胞特征，形态为成纤维状，高表达间充质干细胞标志物CD59、CD44及CD29，不表达造血干细胞标记物 CD34。经过诱导分化后，免疫细胞化学结果显示分化组细胞高表达胰岛素促进因子（PDX）-1、C肽、胰高血糖素，RT-PCR结果显示分化组高表达PDX-1与胰岛素，激素测定结果显示分化后的细胞能够分泌胰岛素，分化后的细胞具有良好的增殖活性。结论：人脐带间充质干细胞在无血清培养条件下能够分化为胰岛素分泌细胞，是细胞治疗糖尿病的良好移植来源。
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骨髓间充质干细胞对外周血CD8＋T淋巴细胞增殖的体外实验研究
目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）对外周血 CD8＋ T 淋巴细胞增殖的抑制作用及其机制。方法：分离获取 MSCs，并多方面对 MSCs 进行鉴定；检测 MSCs 对植物血凝素（PHA）刺激外周血单个核细胞（PBMCs）增殖的抑制作用；应用流式细胞仪技术检测 MSCs 对 PHA 诱导 CD8＋ T 细胞增殖的抑制作用；应用Transwell 方法探索 MSCs 抑制 PHA 刺激 CD8＋ T 细胞增殖作用的机制。结果：体外成功分离培养获得 MSCs；当 MSCs ∶ PBMCs≥1∶5时，MSCs 可抑制 PHA 引起的 CD8＋ T 细胞的增殖，且该作用呈浓度依赖性。Transwell 培养组（MSCs ∶ PBMCs ＝1∶1），MSCs 对 PHA 诱导的 CD8＋ T 细胞仍表现出明显的增殖抑制作用，与非 Transwell组作用相似。结论：MSCs 可通过抑制 CD8＋ T 细胞增殖而影响机体免疫反应。
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人脐带间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的能力比较
目的:比较人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)与骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)分化为胰岛素分泌细胞的能力.方法:分离获得UC-MSCs与BM-MSCs,用10 mmol/L尼克酰胺,2 nmol/L活化素A,10 nmol/L唾液素4,100 pmol/L肝细胞生长因子,10 nmol/L胃泌素对两组细胞进行诱导分化,从基因表达、蛋白表达及激素分泌水平上比较其分化能力.结果:与BM-MSCs分化组相比,UC-MSCs分化组胰岛素分泌能力、胰十二指肠同源盒1、C-肽及胰高血糖素表达水平及分化后细胞活力更强.结论:UC-MSCs比BM-MSCs具有更强的胰岛素分泌细胞分化能力,结合其来源稳定及免疫原性低,可以作为干细胞治疗糖尿病的理想细胞来源.
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骨髓干细胞向心肌细胞分化的基因芯片分析
目的:观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)在特殊微环境下向心肌细胞分化的过程中基因表达的差异变化.方法:用密度梯度离心法培养BMSCs,原代培养乳鼠心室肌细胞,与BMSCs一起用半透膜共培养.共培养后2周提取细胞总RNA,进行22K Human Genome Array芯片检测.用RT-PCR检测心肌分化相关的基因的时序表达.结果:基因芯片检测BMSCs诱导前后差异基因的表达水平,发现诱导2周后表达明显升高(ratio>5)的基因有572个,表达下调(ratio<0.2)的基因有336个.基因的时序性表达发现HOP,Nkx2.5和GATA4基因在诱导前几乎没有检测到阳性表达,诱导后0.5周表达增强,1～2周表达达到高峰,维持一定水平后到4～8周表达呈下降趋势.心肌特异性基因β-MHC和ANF在0.5周开始出现,表达随时间逐渐增加,2周达到高峰.结论:分化诱导相关基因如IGF、FGF等的表达与心肌发育分化相关,GATA4和Nkx2.5等转录因子在微环境诱导心肌分化过程中起重要作用.然而心肌的分化实际上极为复杂,转录因子间相互作用的机制尚需进一步探讨.
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脐血中性粒细胞上清液对脐带间充质干细胞增殖及白细胞介素-6分泌的影响
目的:探讨脐血中性粒细胞上清液对脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)增殖、白细胞介素-6(IL-6)分泌的影响.方法:分离脐血中性粒细胞,UC-MSCs在不同浓度的中性粒细胞上清液中培养为实验组,UC-MSCs和中性粒细胞的比例分别为1∶1、1∶10、1∶50、1∶100,UC-MSCs单独培养为对照组(1∶0).在分别培养18 h和40 h后,用MTT法检测各组增殖,评价不同组间的增殖情况,用ELISA方法检测不同组间培养上清IL-6水平.结果:1∶50和1∶100组UC-MSCs生长受到抑制(P＜0.05),18 h和40 h差异无显著性(P＞0.05).1∶50实验组中,IL-6的分泌水平低于1∶0和1∶1实验组(P＜0.05).结论:高浓度的脐血中性粒细胞上清液抑制UC-MSCs的增殖.高浓度的脐血中性粒细胞的上清液抑制人UC-MSCs分泌IL-6.
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淫羊藿苷对骨髓间质干细胞增殖及分泌血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子的影响
目的:研究淫羊藿苷对骨髓间质干细胞(MSCs)增殖及分泌血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)的影响.方法:不同浓度梯度的淫羊藿苷诱导MSCs,采用MTr法检测MSCs在490 nm处光吸收值,并用EIISA测定VEGF和bFGF的含量.结果:10-7和10-8mol/L两个诱导组在诱导48和72 h时与空白对照组比较,能明显促进MSCs增殖和分泌VEGF和bFGF(P<0.01).结论:10-7和10-8 mol/L的淫羊藿苷作用48和72 h能促进MSCs增殖和分泌VEGF和bFGF
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成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究
目的:研究体外培养的成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从骨髓血中提取hMSCs,在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养,以流式细胞仪检测hMSCs的表面抗原表达.传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养,相差显微镜观察并绘制生长曲线.免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素.NAP法碱性磷酸酶染色、vonKossa法钙结节染色.结果:hMSCs增殖活跃,CD105、CD44表达阳性,CD14、CD34和CD45阴性.诱导培养后碱性磷酸酶、钙结节、Ⅰ型胶原和骨钙素染色阳性.结论:hMSCs取材方便,易诱导分化为成骨细胞,是研究骨组织工程的理想种子细胞.
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人骨髓间充质干细胞对异体T淋巴细胞增殖的影响及机制研究
目的:探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的免疫调节作用及可能机制.方法:从人骨髓中分离培养 MSCs,并通过其形态的均一性及流式细胞术检测其表面标志以鉴定其纯度.用尼龙柱法分离异体血 T淋巴细胞,用植物血凝素(PHA)刺激,再将其分别与 MSCs及不同浓度 MSCs培养上清(100 μ L和 200 μ L)共同孵育,以单独培养的异体淋巴细胞为对照组,MTT法分别测定 T细胞的增殖并计算增殖转化抑制率.结果:MSCs及 MSCs培养上清均可使 PHA刺激引起的异体 T细胞的增殖转化受抑,MSCs组抑制率为 54.9%,MSCs培养上清组(100 μ L和 200 μ L)抑制率分别为 21.6%和 37.6%(P<0.01或 P<0.05).结论:MSCs通过细胞接触和分泌某些因子对同种异体免疫反应有负调节作用.
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人骨髓及脐血间充质干细胞体外大量扩增及建库的质量控制
目的:研究人骨髓和脐血间充质干细胞(MSC)的体外培养特性及建立细胞库的可行性.方法:Ficoll离心剂法分离人骨髓及脐血来源单个核细胞,进行体外培养并大量扩增,观察细胞生长特性,流式细胞术检测MSC表面分子标志物表达情况.结果:骨髓样本比脐血标本的MSC更易于体外短期培养扩增,骨髓样本(5×106)体外培养2周约获得MSC 3×107～1.2×108,成功率达100%,而脐血样本的MSC较难培养,成功率低(12.9%),细胞数扩增有限.对冻存复苏前后的细胞进行流式细胞术检测提示MSC表面标志物CD29、CD44、CD59、CD90、CD105、CD166等均阳性表达,造血细胞标志物CD34、CD14和CD45为阴性表达,提示MSC对本室的冻存复苏程序耐受能力较好,可获得复苏后扩增培养.结论:本研究表明对成人骨髓MSC建库的条件较成熟,获得成功培养的MSC分子表型在冻存复苏前后无明显改变.而脐血来源的MSC培养条件有待改善方能提高MSC培养成功率.
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脐血间充质干细胞体外定向诱导心肌样细胞超微结构特征研究
目的:研究脐血间充质干细胞(umbilical cord blood stem cells)经5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导在体外定向分化为心肌样细胞超微结构特征,为心肌样细胞鉴定提供依据.方法:取脐静脉血50 mL、分离并培养间充质干细胞,用5-aza定向诱导向心肌样细胞分化.相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征.结果:5-aza诱导后,部分细胞体积增大,呈"棒状"或"珠状"结构,有肌管样结构形成,透射电镜下有肌丝、心房颗粒及线粒体等心肌样细胞超微结构形成.结论:经5-aza诱导脐血间充质干细胞具有心肌样细胞超微结构特征.
