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SV40感染滴度测定方法的建立及高滴度病毒的制备
目的 建立稳定的SV40感染滴度测定方法,制备高滴度SV40,用于生物制品病毒清除/灭活工艺的验证.方法 通过分析不同细胞感染SV40后出现病变的时间、病变程度及产毒量,确定SV40敏感细胞株.分析维持液、细胞培养时间、病毒吸附时间等对病毒滴定测定的影响,建立SV40滴度测定的方法.并分析病毒感染后不同时间及细胞不同部位SV40滴度的差异,制备大量的高滴度SV40.结果与Vero、Vero76及VeroE6细胞相比,CV-1细胞对SV40高度敏感,细胞病变出现时间早,病变明显,产毒量高.SV40滴度与病毒接种前细胞的培养时间、细胞接种量和维持液无明显相关,但吸附时间对病毒滴度有一定的影响.病毒的佳吸附时间为120 min.接种病毒后48 h收集细胞沉淀,所获得的SV40滴度高,平均为8.81lg CCID50/ml.结论 已建立了稳定的SV40滴度测定方法,并制备了高滴度SV40,为病毒清除/灭活工艺验证研究奠定了基础.
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呼吸道合胞病毒空斑检测方法的建立及应用
目的 建立呼吸道合胞病毒(RSV)空斑检测方法,并用于病毒滴度的定量.方法 将不同稀释度的RSV A2株病毒液分别接种于Hep-2细胞单层,加0.6%营养琼脂糖覆盖,培养6 d后用10%甲醛固定.去除覆盖层,0.05%中性红染色,按文献报道的方法进行空斑计数.建立空斑法测定RSV滴度的标准曲线,并验证空斑法的准确性及精密性,应用建立的空斑法检测RSV感染BALB/c小鼠肺组织中的RSV滴度.结果 RSV A2株感染的Hep-2细胞出现典型的空斑,直径约1～3 mm,形态呈圆形或类圆形.空斑法的低检测限为3.4×10~1PFU/ml,线性关系良好,相关系数r=0.999 996,准确性及精密性均良好.RSV感染的BALB/c小鼠肺组织标本均出现数量不等的空斑.结论 所建立的RSV空斑测定方法敏感、准确,能稳定地对病毒滴度进行定量测定,为进一步研究RSV的感染性和免疫原性奠定了基础.
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冻干参数对疫苗质量的影响
目的 分析冻干参数对疫苗质量的影响,为进一步优化疫苗的冻干工艺、保障产品质量提供参考.方法 取乙型脑炎减毒活疫苗半成品,分为4组,每组10批次,采取不同的保温温度及保温时间进行冷冻干燥,检测冻干疫苗的病毒滴度、残余水分及外观,分析不同的冻干保温温度和时间对疫苗质量的影响.结果 4组各10批冻干疫苗的病毒滴度均在5.7 lgPFU/ml以上;水分含量均低于3％的标准要求,疫苗外观均能达到本公司质量标准.以(23±1)℃冻干10h对疫苗的综合影响小,(24±1)℃冻干10h对疫苗病毒滴度的影响大,而冻干疫苗中的残余水分随冻干时间的延长而降低.结论 冻干参数对疫苗质量存在明显的影响,特别是温度和时间参数,温度低有利于疫苗活性的保护,温度高有利于水分的干燥;时间短有利于疫苗的活性,时间长有利于水分的干燥.因此,在保证外观的前提下,应综合验证冻干条件对不同疫苗的影响,采取合适的冻干时间和温度,以保障疫苗质量.
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细胞工厂培养箱与普通培养箱用于生产水痘疫苗的比较
目的 比较细胞工厂培养箱及普通培养箱用于生产水痘疫苗的差异.方法 对两种培养箱进行温度测试.比较两种培养箱内培养人胚肺成纤维MRC-5细胞的生长情况及活细胞数量,并对制备出的相应水痘疫苗原液进行无菌检查及病毒滴度测定.结果 与普通培养箱比较,细胞工厂培养箱的温度更稳定;培养MRC-5细胞的贴壁范围更大,活细胞数更高,且批内及批间的均一性更好;其制备水痘疫苗原液的病毒滴度略高,批内及批间的均一性更好,且无菌检查均合格.结论 应用细胞工厂培养箱制备水痘疫苗,可提高疫苗的批间均一性,降低人工劳动强度及污染风险,适用于大规模疫苗生产.
关键词： 细胞工厂培养箱 水痘疫苗 人胚肺成纤维MRC-5细胞 病毒滴度 -
北京株(VZV84-7)水痘病毒在麻疹-腮腺炎-风疹-水痘联合减毒活疫苗中的稳定性
目的 观察北京株(VZV84-7)水痘病毒在麻疹-腮腺炎-风疹-水痘(measles-mumps-rubella-varicella,MMRV)联合减毒活疫苗中的稳定性.方法 将4批MMRV联合减毒活疫苗成品分别置37℃保存4周、2～8及-15 ～-20℃保存24个月,采用蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU)试验检测不同时间点疫苗中水痘病毒滴度.将水痘病毒原液于-80℃反复冻融1、2、3次后,分别与麻疹、腮腺炎、风疹各单价疫苗原液按一定比例配制成MMRV联合减毒活疫苗,进行冻干,采用PFU试验分别测定冻干前、冻干后基础水痘病毒滴度及冻干后于37 ℃热稳定1周的水痘病毒滴度.结果 4批MMRV联合减毒活疫苗成品于37℃保存4周后,水痘病毒滴度下降范围为0.5～0.7 lgPFU/ml;于2～8℃保存24个月,水痘病毒滴定高达4.6 lgPFU/ml,低为4.4 lgPFU/ml;于-15 ～-20℃放置24个月,水痘病毒滴度基本保持不变,均达合格标准(不低于3.6 lgPFU/ml).水痘病毒原液经1、2、3次冻融后制备的MMRV,通过37℃热稳定1周,水痘病毒滴度分别为4.9～4.6、4.6～4.4、4.5～4.3 lgPFU/ml,均达到合格标准(不低于3.6 lgPFU/ml).结论 北京株(VZV84-7)水痘病毒在MMRV联合减毒活疫苗中稳定性良好.
关键词： 水痘病毒 麻疹-腮腺炎-风疹-水痘联合减毒活疫苗 稳定性 病毒滴度 -
首批黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品的研制
目的 制备我国首批黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品.方法 委托北京天坛生物制品股份有限公司制备1批经全面检验合格的黄热减毒活疫苗作为候选国家标准品(批号为:20111201).由3家实验室采用空斑法对黄热减毒活疫苗病毒滴度标准品进行协作标定,以黄热病疫苗国际标准品为溯源,确定本国家标准品以LgIU/ml为标示单位的病毒滴度,并分析标准品的分装精度、稳定性、均匀性.结果 制备的国家标准品分装精度为-0.68％～0.95％.3家实验室20次协作标定结果显示,标准品病毒滴度的IU赋值为5.4 LgIU/ml.37 ℃2周加速破坏试验病毒滴度下降0.5 LgPFU/ml;长期稳定性考察(-30℃),病毒滴度2年内下降0.5 LgPFU/ml,而第3、4年病毒滴度基本无下降.均匀性参考量值——pH的CV值为0.17％、卵清蛋白含量的CV值为4.4％,病毒滴度CV值为2.0％.结论 研制的黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品符合国家标准品要求,可作为国家标准品进行发放和使用.该国家标准品批准文号为(2016)国生标字0032,其批号编码为250017-20111201.
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细胞工厂在麻腮风系列疫苗生产中的应用
目的 利用细胞工厂培养麻疹、腮腺炎和风疹病毒,并制备麻腮风各单价及联合疫苗.方法 应用40层细胞工厂培养原代鸡胚细胞和2BS细胞,制备麻疹、腮腺炎和风疹病毒原液(同时以15 L转瓶培养工艺作为对照),并制备麻腮风各单价及联合疫苗,按照《中国药典》三部(2015版)方法进行病毒滴度检测.结果 细胞工厂制备的麻疹、腮腺炎和风疹病毒原液滴度分别为大于5.2、6.1和5.7 lgCCID50/mL,高于转瓶工艺,且符合《中国药典》三部(2015版)相关规定;1个40层细胞工厂制备的病毒原液量相当于1个转瓶的4至8倍,产量较高.细胞工厂制备的多批次麻腮风各单价及联合疫苗的病毒滴度均符合《中国药典》三部(2015版)相关标准,且病毒滴度热稳定性下降均不超过1个lg.结论 利用细胞工厂制备麻腮风各单价及联合疫苗的工艺稳定,重复性好,质量可控,可用于规模化生产.
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乙型脑炎减毒活疫苗(SA_(14-14-2))病毒原液及成品疫苗的稳定性观察
目的 观察乙型脑炎(乙脑)减毒活疫苗(SA_(14-14-2))病毒原液及成品疫苗的稳定性.方法 取3批乙脑减毒活疫苗病毒原液.分别于20～25、2～8、-18～-22及-38～-42℃储存,间隔一定时间取样,检测病毒滴度;将2～8,-18～-22及-38～-42℃储存的在观察末期符合规定的病毒原液制备成品疫苗,观察其于2～8℃储存的稳定性.结果 3批疫苗病毒原液在20～25℃储存16h、2～8℃储存12 d,-18～22℃冻存3个月及-38～-42℃冻存6个月,病毒滴度均符合<中国药典>三部(2005版)的要求;由2～8℃储存12 d、-18～-22℃冻存3个月、-38～-42℃冻存6个月的病毒原液所制备的成品疫苗2-8℃储存24个月.病毒滴度下降缓慢,且热稳定性良好.符合<中国药典>三部(2005版)的要求.结论 乙脑减毒活疫苗病毒原液的稳定性随温度的变化而变化,温度越低,稳定性越好;所制备的相应成品疫苗,在观察期内稳定性良好.
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狂犬病病毒滴度直接免疫荧光检测法的建立及验证
目的 建立检测狂犬病病毒(rabies virus,RV)滴度的直接免疫荧光法,并进行方法验证.方法 采用分步接种法和一步接种法两种细胞接种方式建立检测RV滴度的直接免疫荧光法.比较不同细胞接种方式检测结果的差异,并对建立的方法进行方法学验证,考察精密度和特异性指标,用统计学方法分析数据.结果 选择一步接种法作为直接免疫荧光法的细胞接种方式;2名操作人员14次检测结果的变异系数为0.04;运用该方法检测不同病毒,仅RV组出现特异性荧光灶,而非RV对照病毒组未观察到荧光灶.采用直接免疫荧光法和小鼠脑内滴定法检测RV样品的病毒滴度,两种方法结果之间呈较好的直线相关性(r=0.918),并有正向回归关系,直线回归方程:y=0.907x-1.566(t=12.80,P＜0.05).结论 直接免疫荧光法精密度良好,特异性强,操作简便,检测周期短,可用于RV滴度的定量检测.
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细胞工厂培养箱在水痘疫苗生产中的应用研究
目的 应用细胞工厂培养箱在水痘疫苗生产过程中进行细胞培养和病毒培养,以提高病毒滴度,减少批间差异.方法 采用细胞工厂培养箱对MRC-5细胞和水痘病毒Oka株进行培养,以传统孵房培养为对照,比较两种方式的细胞生长和病毒感染情况,以及原液病毒滴度和半成品得率.采用t检验对结果进行比较.结果 在同批次同量细胞复苏的情况下,细胞工厂培养箱培养的细胞和病毒与传统孵房培养相比,分布更密集、更均匀,且批间差异较小.细胞工厂培养箱培养得到的水痘病毒滴度为5.1～5.2 lg噬斑形成单位(plaque-forming unit,PFU)/ml,高于传统孵房培养病毒(4.9～5.1 lgPFU/ml)(t=-3.17,P＜0.05);前者培养制备的半成品得率也高于后者,分别为100％和76％～100％(t=-2.69,P＜0.05).结论 在水痘疫苗生产过程中应用细胞工厂培养箱,能够提高病毒滴度和批间均一性,适合水痘疫苗的大规模生产.
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口服轮状病毒活疫苗病毒滴度评价国家参考品的制备
目的 制备口服轮状病毒(rotavirus,RV)活疫苗病毒滴度评价的国家参考品.方法 选取检定合格的口服RV活疫苗原液,加入保护剂,1.0 ml/安瓿分装,冷冻干燥,制备病毒滴度参考品.用微量细胞病变法检测参考品的病毒滴度,用Karber法计算半数细胞培养感染量(50％ cell culture infective dose,CCID50).由3家实验室对参考品的病毒滴度进行协同标定,采用单因素方差分析和小显著差数法对3家实验室的标定结果进行统计学分析.另外,将参考品于-20℃放置1年、4℃放置1年、37℃放置14d、-60℃放置2年,测定病毒滴度,分析参考品的热稳定性和长期稳定性.结果 经单因素方差分析比较,3家实验室检测结果的差异无统计学意义(F=0.379,P=0.686).采用小显著差数法对3家实验室检测结果的均值进行两两比较,差异亦无统计学意义(s(x)值均为0.078 2,P值均＞0.05).参考品的平均病毒滴度为6.5 lgCCID50/ml,于不同温度放置一段时间后病毒滴度下降均未超过1.0 lgCCID50/ml.长期稳定性试验结果的变异系数为4.9％.结论 制备了可用于口服RV活疫苗病毒滴度检测的国家参考品.
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毛冬青对小鼠逆转录病毒感染模型脾大症治疗机制的研究
目的:建立小鼠FLV(friend leukemia virus)感染模型,以抗逆转录病毒药物齐多夫定(AZT)作为对照药,初步探讨中药毛冬青对该模型脾大症的治疗作用及其机制.方法:将小鼠随机分为正常对照组、毛冬青高剂量组、毛冬青中剂量组、毛冬青低剂量组、齐多夫定(AZT)组和模型对照组,每组10只,除正常对照组外均腹腔注射0.4ml×10-1FLV病毒原液攻毒,攻毒当日开始灌胃口服给药.实验小鼠于第21d时摘眼球取血处死,计算其脾指数,检测其血清CD4T、CD8T、IL-1、IL-2、IL-6、INF-γ及病毒滴度.结果:毛冬青高剂量组小鼠脾重量、脾指数以及IL-1、IL-6均显著低于模型对照组,CD4T、CD4T/CD8T以及血清细胞因子IL-2、INF-γ均显著高于模型对照组.毛冬青高剂量组小鼠与模型对照组相比其血清病毒载量亦显著降低.结论:毛冬青具有治疗FLV所致小鼠脾大症的作用,其机制可能在于其具有一定的抗逆转录病毒及调节机体免疫状态的作用.
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狂犬CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的病毒收获液制备工艺研究
采用狂犬病病毒株CTN-1V株接毒于人二倍体细胞Walvax-2株进行病毒收获液制备工艺研究.接毒时,采用不同的人二倍体细胞量、不同的接毒方式及不同的moi进行比较;接毒后,待带毒细胞长至致密单层即95％以上,采用直接换病毒维持液和带毒传一代后再换维持液的方式进行比较;同时采用不同培养基维持液、不同pH值的维持液及对不同的病毒收获时间进行比较;通过测定病毒收获液的滴度来确定狂犬病病毒株CTN-1V株接毒于人二倍体细胞Walvax-2株上的病毒收获液适制备工艺条件.接毒时,采用人二倍体细胞量≥2亿,37℃悬浮混合吸附30 min的方式及0.05 moi;接毒后采用美迪DMEM +0.3％人血白蛋白作为病毒维持液、pH为7.8～8.0的维持液及从换维持液d3开始收获病毒液,并换上新的维持液,之后再进行5d及7d病毒液的收获,通过动物法和细胞法测定收获液的病毒滴度,3次收获液的病毒滴度均大于7.0 lg LD50/mL.建立起了稳定的狂犬病病毒株CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的病毒收获液制备工艺.
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风疹减毒活疫苗的稳定性研究
目的考察风疹减毒活疫苗的稳定性和佳保存条件.方法将风疹减毒活疫苗在-60℃、-20℃、4℃和37℃存放,在不同时间采用24孔细胞板组织培养法进行风疹病毒滴度测定.结果-20℃或-60℃保存风疹减毒活疫苗比在2℃～8℃保存更稳定.结论低温有利于保持风疹病毒的高滴度.
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人 TSHR289基因重组腺病毒的制备与鉴定
目的：制备腺病毒 AdE－GFP－hTSHR289，并进行鉴定。方法：限制性内切酶 NotⅠ和 XhoⅠ双酶切分别处理pBluescript Ⅱ SK（＋）－hTSHR289和 pAdTrack－CMV，回收纯化目的片段 hTSHR289，将其插入至线性化的 pAdTrack－CMV 大片段中；限制性内切酶 PmeⅠ线性化 pAdTrack－hTSHR289与大肠埃希菌 BJ5183中 pAdEasy－1质粒同源重组，限制性内切酶 PacⅠ酶切验证；将阳性重组质粒转染至人胚肾293A 细胞，以包装获得表达 hTSHR289的腺病毒 AdE－GFP－hTSHR289；TCID50法检测重组腺病毒滴度。结果：成功地将 hTSHR289重组至腺病毒载体，获得携带 hTSHR289重组腺病毒载体，包装出携带 hTSHR289基因的腺病毒，滴度达3．5×109 pfu／mL。结论：制备得到携带 hTSHR289的重组腺病毒。
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逆转录-荧光实时定量PCR法快速测定肠道病毒71型病毒滴度
目的 建立一种肠道病毒71型(EV71)病毒滴度快速测定法.方法 以TCID50法测定的EV71病毒样品作为滴度检测参考品,建立EV71病毒滴度的逆转录-荧光实时定量PCR测定方法.通过滴度参考品和待测病毒样品的Ct值计算待测样品中的病毒滴度,并对该检测法进行特异性、重复性验证.结果 所得检测方法可以用于EV71病毒滴度的快速检测.本测定法具有较好的线性,线性范围为lgTCID50 2.61～8.61,相关系数R2为0.9881;特异性和重复性较好,与TCID50法检测之间具有较好的一致性,变异系数(CV)＜5％.结论 所建立的逆转录-荧光实时定量PCR法线性范围广,具有较好的重复性和特异性,可用于EV71样品病毒滴度的快速测定.
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应用实时荧光定量PCR测定AdEasy系统中重组腺病毒滴度
目的:确立一种高效、简便的荧光实时定量PCR方法,对AdEasy系统中的重组腺病毒滴度进行测定.方法:采用Stratagene公司的AdEasyTM载体系统在293细胞中构建重组腺病毒,经10倍梯度稀释的病毒母液用以提取基因组DNA及空斑测定.以10倍梯度稀释的pAdEasy质粒作为标准模板进行实时PCR反应扩增六邻体基因片段,并绘制标准曲线.然后以上述的重组腺病毒DNA为模板,采用同样体系进行实时PCR反应,同时用琼脂糖空斑法测定病毒母液的滴度.结果:成功构建了重组腺病毒并对其进行了空斑测定.运用标准模板进行的PCR反应显示该方法的线性范围为101～108拷贝.病毒母液的DNA拷贝浓度(vg/ml)值,约为空斑滴度(pfu/ml)值的10倍.结论:荧光实时定量PCR方法可在较大的线性范围内检测重组腺病毒滴度,较之空斑法更为准确地反映了重组腺病毒的实际数量.
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抗CD20阳性淋巴瘤单抗真核表达载体的包装及增殖
在我国,恶性淋巴瘤在儿童和青年中所占比例较高[1].大部分恶性B细胞淋巴瘤呈CD20高表达状态,利妥昔单抗是针对CD20抗原的单克隆抗体药物,能准确地识别并与之结合,并通过人体免疫清除这些肿瘤细胞[2,3],然而该药物单独治疗B细胞淋巴瘤的有效率仅达到48%[4].
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河北省2008年手足口病病毒的分离和鉴定
目的:了解引起河北省2008年5～8月手足口病(HFMD)流行的病原体.方法:将HFMD患者的脑脊液、疱疹液、粪便、咽拭子四种标本接种RD细胞进行病毒分离,用肠道病毒基因的特异性通用引物序列、肠道病毒71型(Entero-virus71,EV71)和柯萨奇A组16型(Coxsackivirus16,CA16)基因的特异性引物序列进行RT～PCR鉴定;采用微量板细胞病变法(CPE)测定半数细胞感染浓度.结果:2008年5～8月间从203份手足口病例标本(脑脊液9份,疱疹液27份,粪便91份,咽拭子76份)中分离出115株病毒,病毒分离阳性率为56.65%,分离到的病毒经RT-PCR鉴定,其中72株为EV71,42株为EV71+CA16,1株为非EV71、非CA16其他肠道病毒,各标本之间病毒分离阳性率的差异无统计学意义(P>0.05);粪便标本的病毒滴度高于疱疹液和咽拭子标本.结论:河北省2008年5～8月HFMD流行的原因主要由EV71感染所引起.
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血清试剂对脊髓灰质炎病毒滴度影响的比较研究
目的:比较4个血清组血清试剂对脊髓灰质炎病毒(sabin Ⅰ型及sabin Ⅱ型)滴度测定的影响.方法:在除血清试剂因素外的其它因素完全相同的条件下,采用微量细胞培养法测定Ⅰ型、Ⅱ型脊髓灰质炎病毒滴度,分析测定结果之间的差异是否具有显著性.结果:应用的4个血清组所测得的脊髓灰质炎病毒滴度结果之间差异具有显著性.结论:不同的血清试剂对脊灰病毒滴度的测定有影响,因此建议病毒滴度检测前要进行预试验来选择适宜的血清试剂.
