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重组人神经生长因子腺相关病毒载体的构建及病毒滴度的测定
目的 克隆人神经生长因子-β(nerve growth factor-β,NGF-β)基因,重组于腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体,构建表达人NGF-β的重组腺相关病毒,检测滴度,为NGF-β的真核表达及临床应用提供实验基础.方法 从正常人基因组中扩增出人NGF-β全长开放读框,将其克隆于pAAV-MCS载体,双酶切和测序鉴定重组病毒载体.将该质粒与腺相关病毒包装质粒(pAAV-RC)、腺相关病毒辅助质粒(pAAV-Helper)共转染AAV-293细胞,通过包装得到重组腺相关病毒并回收病毒原液.以pAAV-LacZ和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞,重组病毒AAV-LacZ感染AAV-HT1080细胞,经对报告基因LacZ的X-Gal染色,通过蓝染的细胞计算病毒滴度.结果 PCR产物经电泳证明大小正确,重组质粒pAAV-NGF-β经双酶切和测序证实NGF-β基因正确插入载体且序列正确.通过AAV-LacZ感染AAV-HT1080细胞后X-gal染色计数,测定重组腺相关病毒的滴度为10×109 pfu·L-1～.结论 成功构建了表达人NGF-β基因的重组腺相关病毒载体,为进一步研究NGF-β基因治疗角膜病打下基础.
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心安颗粒对病毒性心肌炎小鼠心肌酶及病毒滴度的影响
目的:探讨心安颗粒对病毒性心肌炎小鼠心肌酶及病毒滴度的影响.方法:采用BALB/C小鼠腹腔注射柯萨奇病毒B3(CVB3)建立小鼠病毒性心肌炎模型.小鼠随机分为空白对照组、模型组、心安颗粒10,20,40 g(生药)·kg-1·d-1和利巴韦林0.1 g·kg-1·d-1组,注射CVB3 2 h后给药,连续用药7 d,第8天处死小鼠,取血测定血清心肌乳酸脱氢酶(LDH)及中和抗体,取心肌制成细胞悬液,测定病毒滴度.结果:心安颗粒治疗组与模型组相比,血清LDH含量明显降低,中和抗体及病毒滴度明显降低(P＜0.01).结论:心安颗粒对病毒性心肌炎小鼠具有抗病毒、缓解心肌炎症作用.
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肾上腺皮质激素对柯萨奇B3病毒感染小鼠心肌的保护作用
目的 探讨肾上腺皮质激素对柯萨奇B3病毒感染小鼠心肌损害的治疗作用.方法 将200只4周龄Balb/c小鼠随机分为正常对照组、病毒对照组和病毒感染后早期激素治疗组、中期激素治疗组及晚期激素治疗组,每组40只.在病毒感染后不同时期计算心肌病理积分,空斑形成单位法测定心肌细胞病毒滴度,化学发光法检测血清肌钙蛋白Ⅰ水平.结果 病毒感染后7～10天,柯萨奇B3病毒感染各组小鼠心肌病理积分均显著高于正常对照组,而各感染组之间无显著性差异.病毒感染后14天,中期激素治疗组小鼠心肌病理积分显著低于其他病毒感染组,30天后中期激素治疗组小鼠心肌已完全正常,而其他各组小鼠心肌仍有病变.病毒感染后早期激素治疗组心肌病毒滴度显著高于其他各组,且消失慢.病毒性心肌炎小鼠血清肌钙蛋白I水平显著升高,并与病理变化呈直线正相关.结论 肾上腺皮质激素可以明显减轻病毒性心肌炎时心肌的病理损害,对心肌细胞有保护作用,尤以病毒感染中期使用激素治疗疗效好.
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高滴度的含有目的基因IL-4RA的逆转录病毒的包装和浓缩
含有目的基因的逆转录病毒高的病毒滴度为1×104CFU/mL.选择含有高病毒滴度的PA317细胞抗性克隆进行基因组的提取和鉴定,结果显示目的基因IL-4RA成功地整合到了宿主的基因组中.结论 含有目的基因IL-4RA的逆转录病毒载体经过PA317细胞包装后获得了较高的病毒滴度,为下一步哮喘模型的基因治疗打下了基础.
关键词： 转染 包装 病毒滴度 pLNC-IL-4RA -
四黄虎胶囊抗豚鼠生殖器疱疹病毒感染的实验研究
目的:探讨中药四黄虎胶囊治疗生殖器疱疹的作用机理.方法:将四黄虎胶囊用于治疗感染生殖器疱疹病毒的豚鼠模型,与阳性药物阿营洛韦(ACV)对照,对豚鼠临床症状变化、体重、阴道分泌物病毒滴度等进行观测.结果:四黄虎各剂量组豚鼠阴道内病毒滴度与阿昔洛韦组比较差异无统计学意义(P>0.05);外阴症状评分四黄虎各剂量组均明显低于模型组,尤以四黄虎中剂量组为明显,而且低于阿昔洛韦组;四黄虎对豚鼠体重变化有一定的保护作用.结论:中药四黄虎胶囊有较好抗生殖器疱疹病毒作用.
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荧光定量RT-PCR滴度检测法在腮腺炎减毒活疫苗制造中的应用
目的：为促进荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）滴度检测法在腮腺炎减毒活疫苗制造中的实际应用提供参考。方法：建立滴度-ct值标准曲线回归方程；分别用微量细胞病变法和荧光定量RT-PCR滴度检测法对10批腮腺炎减毒活疫苗单次收获液及成品进行滴度检测，比较检测结果。结果：两种方法检测结果经配对t检验分析，P分别为0.743、0.868，差值均值分别在（－0.174，0.094）、（－0.113，0.153）之间，差异无统计学意义，可以认为等同。结论：荧光定量RT-PCR滴度检测法可用于腮腺炎减毒活疫苗制造过程中的单次收获液及成品滴度检测，有望进一步升级为《中国药典》方法。
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以逆转录病毒为载体进行肝脏基因转染的研究进展
自1992年对家族性高胆固醇血症病人进行第1例肝脏疾病基因治疗以来,对肝脏疾病基因治疗的研究已经成为目前国内外研究的热点之一.肝脏是体内多种物质的主要代谢场所,并能合成多种血浆蛋白质,且具有强大的再生能力,因而肝脏是基因治疗理想的靶器官.许多肝脏疾病,特别是由于单基因缺陷所致的代谢性疾病,为肝脏基因治疗的理想疾病,如α1-胰蛋白酶缺陷症、遗传性酪氨酸血症、Crigler-Najjar 综合征等,为肝脏疾病的基因治疗提供了广阔的应用前景.
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口服轮状病毒活疫苗病毒感染滴度测定的影响因素
[目的]对影响轮状病毒活疫苗病毒滴度测定的因素进行研究.[方法]用细胞微量病变滴定法(CCID50)结合酶联免疫吸附试验(ELISA)[1]检测口服轮状病毒活疫苗病毒感染滴度.[结果]在疫苗滴度检测中处理疫苗所用的胰酶量,胰酶37 ℃处理疫苗时间,及感染细胞培养收冻时间均对疫苗的感染滴度产生影响.病毒滴度均随着胰酶量、温度和培养时间的增加均有先增高后降低的现象(P＜0.001),用15～20 μg/ml胰酶、37 ℃处理疫苗50～60 min,4～5 d收冻为较佳试验条件.[结论]胰酶量、温度和培养时间对口服轮状病毒活疫苗病毒感染滴度的测定结果均有不同程度的影响,在检测中要选择合适的条件,使检测结果更具有真实性,实际工作中采用20 μg/ml胰酶、37 ℃处理疫苗50 min、收冻时间为5 d的组合条件进行试验.
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免核酸提取快速检测技术在流感病毒细胞株鉴定中的应用
目的 探索免核酸提取进行Real-time PCR在流感病毒细胞株中的应用.方法 选取甲型H1N1、H3N2、B-Yamagata、B-Victorial 4种亚型流感病毒细胞株各10株,先进行血凝实验(Hemagglutination test,HA),再进行核酸提取与病毒液用Real-time PCR分别进行甲、乙、4种亚型核酸检测,比较其CT值差异.结果 流感病毒HA几何平均滴度(GMT)和CT值的几何平均值无线性关系.甲、乙型核酸提取和不提取的CT值范围分别为10.5 ～ 14.7和10.5 ～ 18.2,甲型H1N1、H3N2、B-Yamagata、B-Victorial 4种亚型核酸提取和免提取的CT值范围分别为11.4～16.3和12.0 ～ 16.7;11.2～17.2和10.7～19.7;12.5～16.7和10.3 ～16.7;11.8 ～17.1和12.6 ～ 17.2,各型别间CT值几何平均值无差异.结论 免核酸提取在流感病毒分离时能快速检测病毒液CT值,缩短实验中间步骤.
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干热法对猪凝血酶的病毒灭活效果及其对凝血酶活性影响的评价
目的 探讨干热法对猪凝血酶冻干制剂的病毒灭活效果及灭活后对凝血酶活性造成的影响.方法 向猪凝血酶冻干制剂500 U、2000U中加入辛德毕斯病毒(Sindbis)、猪细小病毒(PPV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和伪狂犬病病毒(PRV)4种病毒,各病毒滴度依次为6.83、6.57、6.34、6.96 Logl0/0.1 mL,在98 ～ 100℃沸水中经30min干热病毒灭活后检测病毒灭活效果和对凝血酶活性影响.结果 经干热法病毒灭活后,猪凝血酶冻干制剂中Sindbis、PPV、EMCV和PRV的病毒滴度分别由6.83、6.57、6.34、和6.96 Logl0/0.1 mL降至1.21、1.43、0.96和1.38Logl0/0.1 mL,经干热法处理后500 U的凝血酶冻干制剂活性损失≤10％,2000U的≤4％.结论 干热法可有效降低猪凝血酶冻干制剂中指示病毒的滴度,处理后的凝血酶活性仍在国家药典规定范围,不失为1种凝血酶冻干制剂病毒灭活的安全、有效方法.
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广州地区无偿献血者HCV基因分型与病毒滴度的相关性研究
目的 探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)6a亚型与病毒滴度的关系.方法 从2009年11月～2011年8月收集广州地区无偿献血人群中抗-HCV阳性标本527份,对其进行HCV核酸检测(nucleic acid test,NAT).对核酸阳性的标本采用罗氏COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV test进行病毒滴度的定量检测,以及采用NS5B基因扩增和直接测序法进行HCV基因分型的鉴定.对于标本的病毒滴度与基因分型采用SPSS16.0软件进行关联性分析.结果 527份抗-HCV阳性标本中,299份标本成功获得病毒滴度和分型结果.HCV 1型(1a+1b)、2型(2a)、3型(3a +3b)和6型(6a)的比例分别为48.8％,8.7％,12.4％和30.1％.统计分析结果表明,不同基因型之间的病毒滴度存在显著差异(F=6.675,P＜0.01).HCV 1型和6型的平均滴度分别为6.04,6.15 log10 IU/ml,均高于2型和3型(平均滴度分别为5.66和5.49 log10 IU/ml).结论 HCV 1b和6a是广东地区无偿献血者人群中流行的主要亚型.HCV 1型(1a +1b)和6型(6a)的病毒滴度显著高于2型和3型.HCV 6a在广东地区的流行和传播可能其较高病毒滴度有关.研究HCV基因分型与病毒滴度的关系的研究有助于广东地区HCV的防控策略以及各亚型治疗方案的制定.
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麻疹疫苗工作种子批培养条件的优化
目的了解麻疹疫苗工作种子批培养的主要影响因素,确定培养条件的优化组合. 方法采用正交试验对各影响因素进行筛选,制订麻疹疫苗工作种子批制备对策,按照对策以可控制因素的优化组合制备5批麻疹疫苗工作种子批,并分别用于试生产. 结果 5批麻疹疫苗工作种子批比随机选择的5批近期凭经验制备的传统麻疹疫苗工作种子批病毒滴度明显提高 (≥0.69±0.35 LgCCID50/1.0 ml, P<0.05),用该毒种试生产的冻干成品疫苗滴度合格,并通过疫苗稳定性试验.结论经正交试验优化的麻疹疫苗工作种子批培养条件,能提高麻疹疫苗工作种子批病毒滴度和稳定性.
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运用流式细胞术快速检测汉滩病毒滴度
目的:建立用流式细胞仪快速测定汉滩病毒滴度的方法.方法:汉滩病毒76-118株感染Vero-E6细胞,以汉滩病毒核蛋白单克隆抗体(mAb) 3G1为一抗,FIX标记的羊抗小鼠抗体为二抗,用流式细胞术(FCM)检测阳性细胞率,评价感染后不同时间点,以及不同病毒接种量的阳性细胞率,并与间接免疫荧光法对比.结果:感染后36 h阳性细胞百分率为(10.06±0.42)%,低检测的病毒滴度为100 TCID50/ML.结论:相对于传统的空斑实验及间接免疫荧光滴定法,FCM是一种简单、快速、有效检测汉滩病毒滴度的方法.
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辛伐他汀对柯萨奇B3病毒感染小鼠心肌早期的保护作用
目的探讨辛伐他汀对急性柯萨奇B3病毒感染小鼠心肌早期的作用.方法将柯萨奇B3病毒感染小鼠随机分为两组:对照组(n=15)及辛伐他汀治疗组(n=15),分别给予生理盐水及辛伐他汀14 d.第6天时,各组分别随机处死6只.结果辛伐他汀治疗组其心脏质量(69±13mg)较对照组(96±16mg)减轻(P＜0.01);心肌炎症及坏死程度减轻,心肌病理积分(8.0%±7.3% vs 22.9%±10.6%)显著降低(P＜0.01);14 d生存率明显升高(P＜0.05).结论辛伐他汀治疗可减轻心肌病理损害,对早期感染柯萨奇B3病毒小鼠心肌有保护作用.
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重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2的构建及病毒滴度测定
目的:构建重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2,并测定病毒滴度.方法:从Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-2基因全编码区序列.将测序正确的片段用Bgl II和Pme I双酶切定向插入到pAdBM5-GFP腺病毒载体中.通过磷酸钙共沉淀法将线性化重组质粒和腺病毒骨架共转染HEK293A细胞,扩增纯化重组腺病毒,TCID50法测定重组腺病毒滴度.结果:成功构建出表达hIL-2基因的重组腺病毒载体(pAdBM5-GFP-hIL-2),获得了高滴度表达hIL-2基因的重组腺病毒.结论:重组腺病毒表达载体(pAdBM5-GFP-hIL-2)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肝癌的转基因治疗研究.
关键词： hIL-2 重组腺病毒载体 病毒滴度 pAdBM5-GFP -
壳聚搪碘液体外抗人单纯疱疹病毒2型的作用
目的 研究壳聚搪碘液体外对人单纯疱疹病毒2型的作用效果.方法 采用非洲绿猴肾细胞(Vero)培养单纯疙疹病毒2型(HSV-2),观察病毒半数感染量(TCID_50)和病毒感染后的细胞病变效应(CPE),并通过MTT法测定药物对HSV-2感染细胞的保护率EC_50.结果 壳聚糖碘液时HSV-2的50%抑制浓度(EC_50)为0.025 mg/mL,治疗指数(TI_50)为24;壳聚糖碘液对HSV-2的90%抑制时间在感染后的2h之前;且壳聚糖碘液和HSV-2预作用的时间越长,HSV-2的滴度越小.结论 壳聚糖碘液在体外对人单纯疱疹病毒2型活性具有抑制作用.
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重组逆转录病毒载体的包装及病毒滴度影响因素
目的:探讨产生重组逆转录病毒包装及其病毒滴度(以cfu表示)的影响因素.方法:用逆转录病毒载体pMNS-TK-M,以脂质体法转染包装细胞PA317细胞,挑选抗性集落(PA317/pMNS-TK-M)扩大培养后,进行PA317/pMNS-TK-M细胞接种密度、培养温度(37℃,32℃)、纯化方法等对其培养上清中重组病毒cfu影响的比较性研究.结果:包装细胞的密度是影响cfu的关键因素;降低培养温度需延长培养时间方可提高cfu滴度.结论:该实验结果为应用逆转录病毒载体进行的基因治疗实验研究提供重要的参考依据.
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转移人端粒酶逆转录酶基因的实验研究
目的转移人端粒酶逆转录酶基因(hTERT基因),建立其转移体系.方法用脂质体转染的方法将逆转录病毒载体PLNC-hTERT转入ψ-2细胞,用产病毒的ψ-2细胞克隆培养上清重复感染PA317细胞,建立产毒PA317/ hTERT细胞;通过感染内皮细胞检测基因转移效果.结果ψ-2细胞培养上清重复感染,使PA317细胞所产病毒滴度提高20倍,得到高滴度的PA317/hTERT包装细胞系.用该细胞系产生的病毒上清感染内皮细胞成功.结论可通过重复感染法建立高效的逆转录病毒基因转移系统.
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HCV细胞培养适应性突变研究进展
HCV感染是一个重大的公共卫生问题,自2005年日本学者首次建立HCV感染性克隆与体外细胞培养技术以来,HCV细胞培养技术的改进与应用一直是HCV研究领域的热点,并取得许多重要进展.本文将着重阐述HCV细胞培养适应性突变对于HCV病毒感染性病毒颗粒滴度的影响.
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高压静电检漏法对口服轮状病毒活疫苗包装无损密封性检查
目的 探索高压静电检漏法对口服轮状病毒活疫苗包装无损密封性检查的可行性.方法 采用高压静电检漏法对口服轮状病毒活疫苗包装密封性进行检查,并观察此方法对疫苗有效成分的影响.结果 口服轮状病毒活疫苗经18 000 V和14 000 V高压静电检测显示,导电电流值均极低;病毒滴度结果均在6.0~6.5 lgCCID50/mL之间,热稳定性试验病毒滴度下降值在0.5~1.0 lg之间,均符合质量标准,且与对照组(A组和B组)检测结果差异无统计学意义(P>0.05).结论 高压静电检漏法用于口服轮状病毒活疫苗包装无损密封性检查是可行的.
