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SV40对猴树突状细胞发育分化的影响
为探讨猴空泡病毒40对猴树突状细胞发育分化的影响,分别以灭活的SV40和感染性SV40作为刺激抗原致敏外周血来源的猴树突状细胞,培养第5 d加入刺激抗原,在培养第7 d和第9 d分别收集处理的猴树突状细胞并测定细胞表面分子CD1a、HLA-DR、CD86、CD83的表达情况.结果显示,与灭活的SV40抗原相比,经感染性SV40刺激的猴DC中前述四种表面分子的表达显著偏低(P
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一株高度变异的中国SV40分离株的全基因组序列分析
对SV40中国云南分离株YNQD38进行了全基因组核苷酸序列测定.覆盖了整个基因组的9个重叠的基因片段被扩增和测序,与其它SV40株进行了序列比对并基于全基因序列建立了遗传进化树.结果显示:基因组全长5125bp,基因组构成与其它SV40毒株相似,均有6个开放读码框架和1个调控区.YNQD38与已被证实高度保守的其它SV40比,全基因组核苷酸同源性仅为91.0%.在SV40的保守区VP1、VP2、VP3、小t抗原(t-ag)和部分大T抗原(不包括大T抗原C末端)区,YNQD38与其它SV40之间核苷酸同源性分别为90.7%～91.1%、 91.7%～92.0%、90.2%～90.8%、92.8%～93.3%、88.5%～89.7%.在SV40的可变区大T抗原C末端(T-ag-C)编码区,YNQD38同源性更低,仅为65.7%～74.3%.YNQD38发生在保守区的核苷酸变异多为无义突变,而发生在变异区的核苷酸变异多为有义突变.YNQD38的调控区缺少一个完整的72bp增强子,这种特别的调控区的结构以前未见报道.基于整个基因组构建的进化树显示该株病毒形成了一个独特的组.以上结果表明YNQD38是目前报道的SV40中变异大的一株,而且也是第一株被完整测序的SV40中国株.这个报道不仅为SV40中国株的基础研究提供了一个完整清楚的分子生物学资料, 还对这样一株高度变异的SV40能否成为人类致病因子进行了初步探讨.
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猿猴病毒40T抗原转化的人脐静脉内皮细胞系PUMC-HUVEC-T1的建立
目的 建立猿猴病毒40(SV40)T抗原转化的人脐静脉内皮细胞(HVUEC)模型,为内皮研究提供可利用资源.方法 分离人脐静脉内皮细胞,原代培养.感染含有SV40大T、小T抗原的慢病毒,连续传代培养.对感染后的HUVEC,RT-PCR检测大T的表达,免疫细胞化学检测vWF、CD31、CD34的表达及结合凝集素能力,透射电镜观察内皮细胞的超微结构,Matrigel检测管状成型,进行染色体核型分析,皮下接种BABL/c-nu裸鼠检测致瘤性,PCR法进行种属鉴定及支原体检测,短串联重复序列(STR)检测鉴定细胞身份.结果 转化后的人脐静脉内皮细胞命名为PUMC-HUVEC-T1,扁平多角状,汇合时典型铺路石排列,体外传代40代以上(1:3～4)；细胞中有SV40LT mRNA的表达；vWF、CD31、CD34表达均阳性,可结合荆豆凝集素-1(UEA-1)；电镜可见WP小体；不同代数细胞核型正常稳定,裸鼠体内接种不成瘤.PUMC-HUVEC-T1种属鉴定为人源性,STR结果与原代HUVEC一致,无支原体的污染,国家实验细胞资源共享平台收藏.结论 建立了易获得、背景清楚、质量可靠的SV40 T抗原转化的HUVEC细胞系PUMC-HUVEC-T1.
关键词： 人脐静脉内皮 SV40 反转录-聚合酶链反应 免疫组织化学 透射电镜 -
胶质瘤组织中SV40Tag Rb和IRS-1蛋白的表达及其与胶质瘤发生发展的关系
目的 探讨SV40Tag、Rb和IRS-1在胶质瘤发生发展过程中的关系和作用.方法 构建布有人脑胶质瘤和脑膜瘤临床标本为主体、配有实验性胶质瘤、正常人或鼠脑等相关组织等118个阵列的组织芯片,采用免疫组织化学和免疫荧光共聚焦技术检测SV40Tag、Rb和IRS-1的表达及SV40Tag与Rb、SV40Tag与IRS-1的联合表达.结果 SV40Tag、Rb和IRS-1在胶质瘤和脑膜瘤中均有表达,82例胶质瘤的阳性表达率分别为65.9%、64.6%和48.8%.正常人脑组织仅有Rb和IRS-1表达,而未见SV40Tag表达.SV40Tag和IRS-1的阳性表达率与病理分级呈正相关(P<0.05),Rb蛋白的阳性表达率与病理分级呈负相关(P<0.05).在82例胶质瘤中,SV40Tag与Rb、SV40Tag与IRS-1联合表达阳性率分别为51.2%和40.2%.结论 外源性SV40Tag随SV40病毒侵入机体,与Rb抑癌基因形成复合物使其抑癌功能丧失,同时诱导信号通路中重要成员IRS-1活化,从而促进细胞恶性变化,可能是脑胶质瘤发生发展的重要原因之一.
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猴空泡病毒(SV40)PCR检测方法的建立与初步应用
目的建立检测实验猴及生物制品中猴空泡病毒(SV40)的PCR方法2方法根据SV40-776株设计合成三对引物对现有毒株进行PCR扩增并克隆测序.用这三对引物对56份猴肾、肺、脾及10批脊髓灰质炎疫苗进行检测.结果三对引物均扩增出目的片段;56份猴脏器和10批疫苗SV40检测均为阴性.结论56只恒河猴和10批疫苗中未检测到SV40,所设计的三对引物检测结果准确,均可用于检测.
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脊髓灰质炎减毒活疫苗中SV40和泡沫病毒的检测
目的检测脊髓灰质炎减毒活疫苗中的SV40和猴泡沫病毒(Simian Foamy Virus,SFV).方法用PCR方法检测我所1997年至2003年生产用的毒种10批、半成品140批及成品糖丸疫苗128批.结果脊髓灰质炎减毒活疫苗毒种、半成品和成品糖丸疫苗中均未检测到SV40和SFV DNA.结论我所生产的脊髓灰质炎减毒活疫苗是安全的.
关键词： 脊髓灰质炎减毒活疫苗 SV40 SFV PCR -
SV40感染滴度测定方法的建立及高滴度病毒的制备
目的 建立稳定的SV40感染滴度测定方法,制备高滴度SV40,用于生物制品病毒清除/灭活工艺的验证.方法 通过分析不同细胞感染SV40后出现病变的时间、病变程度及产毒量,确定SV40敏感细胞株.分析维持液、细胞培养时间、病毒吸附时间等对病毒滴定测定的影响,建立SV40滴度测定的方法.并分析病毒感染后不同时间及细胞不同部位SV40滴度的差异,制备大量的高滴度SV40.结果与Vero、Vero76及VeroE6细胞相比,CV-1细胞对SV40高度敏感,细胞病变出现时间早,病变明显,产毒量高.SV40滴度与病毒接种前细胞的培养时间、细胞接种量和维持液无明显相关,但吸附时间对病毒滴度有一定的影响.病毒的佳吸附时间为120 min.接种病毒后48 h收集细胞沉淀,所获得的SV40滴度高,平均为8.81lg CCID50/ml.结论 已建立了稳定的SV40滴度测定方法,并制备了高滴度SV40,为病毒清除/灭活工艺验证研究奠定了基础.
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人脑胶质组织中SV40大T抗原表达及p53形成特异性复合物
目的探讨SV40早期区域基因编码产物大T抗原(Tag)表达及与抑癌蛋白p53的相互作用在人脑胶质瘤发生发展中的意义.方法采用免疫组织化学方法检测89例人脑胶质瘤组织和11例正常人脑组织中Tag的表达,并对Tag表达阳性瘤组织进行免疫共沉淀和Western blot检测Tag-p53复合物的存在.结果 89例人脑胶质瘤组织Tag表达阳性33例(阳性率37.1%),Tag表达水平与胶质瘤病理分级呈显著正相关(pearson列联系数=0.72,P＜0.01);33例Tag表达阳性瘤组织中均发现Tag与p53形成特异性复合物.11例正常人脑组织Tag表达全部阴性.结论 SV40感染与人脑胶质瘤病因学密切相关,Tag可能是SV40在胶质瘤发生发展中起作用的重要因素;Tag与p53可形成特异性复合物,Tag-p53特异性复合物的形成导致p53失活,可能是人脑胶质癌发生发展的一个重要机理.
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SV40在人成牙本质细胞永生化中作用的初步研究
目的:明确SV40永生化人成牙本质细胞过程中是否上调端粒酶活性.方法:将SV40基因转染至原代人成牙本质细胞样细胞,G418筛选后连续传代,检测细胞内端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)的表达以及端粒酶活性.结果:SV40稳定整和入细胞并表达蛋白,该转染细胞在mRNA和蛋白质水平上均不表达TERT,端粒酶活性仍为阴性.结论:在人成牙本质细胞样细胞内,外源性SV40基因不能激活端粒酶,提示其永生化机理不依赖TERT途径.
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肝细胞永生化逆转录病毒载体pLTSN的构建
目的构建含猿猴病毒40大T抗原基因(SV40T)的逆转录病毒永生化载体pLTSN,为肝细胞永生化奠定基础.方法以质粒pUC19-SV40T为模板,高保真PCR扩增SV40T,双粘端连接法将其克隆到pLXSN的EcoRⅠ和BamHⅠ位点之间,通过菌落PCR和酶切法筛选、鉴定阳性克隆并经测序验证.结果用菌落PCR和酶切法随机筛选的10个菌落中9个为阳性,阳性克隆经质粒DNA测序分析确证.结论成功构建了逆转录病毒永生化载体pLTSN.
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人脑肿瘤中SV40大T抗原与pRb形成特异性复合物
目的:探讨SV40早期基因编码产物大T抗原(Tag)表达及与抑癌蛋白pRb的相互作用在人脑肿瘤发生发展中的意义.方法:采用免疫共沉淀及Western印迹法检测43例人脑肿瘤组织及5例正常人脑组织中Tag的表达,并对15例Tag阳性瘤组织检测Tag-pRb复合物的存在.结果:Tag在5例室管膜瘤及2例脉络丛乳头状瘤中全部表达,垂体腺瘤(5/6)、星形胶质细胞瘤(7/10)、脑膜瘤(4/6)、多形性胶质母细胞瘤(2/5)及髓母细胞瘤(1/5)均有Tag的表达;3例少枝胶质细胞瘤、1例松果体瘤及5例正常人脑组织无Tag表达.15例Tag阳性瘤组织中均发现Tag与pRb形成特异性复合物.结论:在人脑肿瘤组织中Tag广泛表达,Tag可与pRb形成特异性复合物,Tag-pRb特异性复合物的形成导致pRb失活,可能是人脑肿瘤发生发展的一个重要机理.
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ptsA58H质粒转染人胚腱细胞的增殖特性及端粒酶活性分析
目的分析体外长期传代ptsA58H质粒转染人胚腱细胞的增殖能力及端粒酶活性。方法选用连续传代培养的第40代、第70代、第75代转化人胚腱细胞，免疫组化染色观察细胞分泌胶原类型，比较细胞生长曲线，并行染色体核型分析，流式细胞术检测细胞增殖周期，提取细胞总RNA，RT-PCR二步法检测细胞人端粒酶逆转录酶mRNA表达。结果转化人胚腱细胞传代至70代以后，细胞形态发生改变，出现复制衰老现象。细胞仍具有正常分泌Ⅰ型胶原的能力，转化人胚腱细胞染色体呈异倍性(2n=94)。转化人胚腱细胞无人端粒酶逆转录酶mRNA特异扩增带，无端粒酶活性表达。结论单纯SV40转染不能使人胚腱细胞永生化，同时也说明转化人胚腱细胞无恶性转化倾向。
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SV40与细胞永生化
目的探讨SV40如何介导细胞永生化,与细胞永生化现象相关的因素及它们的作用.方法复习近十年有关细胞永生化与复制衰老现象研究的文章,对SV40介导的细胞永生化及其相关因素进行综述.结果细胞永生化涉及病毒DNA的整合,端粒酶的活化,生长抑制因子的失活等多方面的因素,它们的作用机制密切相关.结论细胞永生化的研究有助于更广义地理解细胞生物学现象,并可作为标准细胞在细胞工程及组织工程的研究中发挥作用.
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永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性
目的:构建永生化肝细胞系并对其生物学特性及某些功能进行研究. 方法:利用SV40T基因和真核表达载体pcDNA3.1经脂质体转染至体外分离培养的人胚胎肝细胞,使其永生化,进一步鉴定其形态学特征和生物学功能. 结果:经G418 700～300 mg/L筛选,40 d后获得一株阳性克隆. 形态学观察发现,该细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征. 永生化胚胎肝细胞克隆形成率为31.2%,染色体核型分析表明细胞核型无明显异常,软琼脂集落形成试验表明细胞在软琼脂中不能生长,免疫组化证明SV40T基因已整合入细胞,而且该细胞具有合成白蛋白的功能. 结论:新建胚胎肝细胞系具有与原代肝细胞类似的形态特征及生物学功能,可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料.
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SV40大T抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的影响
目的: 研究SV40大T抗原(LT)基因对人正常皮肤成纤维细胞体外转化作用, 以及转化后细胞生物学特性的改变. 方法: 采用脂质体介导的方法,利用含有LT cDNA的质粒psv3-neo转染人正常皮肤成纤维细胞. G418筛选后,挑选阳性克隆扩大培养,观察基因及蛋白在细胞内的表达,以及对细胞增殖等生物学特性的改变情况. 结果: 分离获得转化细胞克隆,原位杂交显示LT mRNA在转染细胞胞质中表达. 免疫组化结果显示,细胞质中有SV40大T抗原表达. 细胞计数、BrdU、流式细胞仪检测表明,经过一段时间的旺盛生长,在转染后第16代,细胞即进入危机期,以一种比衰老细胞更快的速度死亡. 结论: LT 可以促进正常皮肤成纤维细胞增殖,但这种能力是有限的,在转染后期甚至会促进细胞死亡. 所以要使人的正常皮肤成纤维细胞永生化,单纯利用LT的转染是不够的,还需要结合其它的转化方式.
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SV40大T抗原在人脑肿瘤中的表达
目的 探讨SV40早期区域基因编码产物大T抗原（Tag）的表达及与抑癌 蛋白p53，pRb 的相互作用在人脑肿瘤发生发展中的意义. 方法 采用免疫共沉淀结合银 染色及Western印迹 法检测65例人脑肿瘤及8例正常人脑组织中 Tag的表达，并对18例和15例Tag阳性瘤组织分别 检测Tag-p53和Tag-pRb复合物的形成. 结果 SV40 Tag在人脑肿瘤中广 泛表达, 阳性率为66% (43/65)，而8例正常人脑组织均无Tag表达，二者差异显著（P< 0.05）；分别检测18例 和15例Tag阳性瘤组织，均发现Tag可与p53，pRb形成特异性复合物. 结论 SV40 Tag的表达 与人脑肿瘤的发生有一定关系；SV40 Tag与p53，pRb形成特异性复合物并导致其失活，可能 是SV40致人脑肿瘤发生的一个重要机制.
