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支持细胞在哺乳动物耳蜗发育及功能中的作用
耳蜗的感觉上皮细胞有毛细胞和支持细胞两种类型.许多研究旨在探讨听力损失的基本机制,重点针对毛细胞和螺旋神经元,较少关注支持细胞.目前对支持细胞作用的了解已从单纯的结构支持扩展到耳蜗毛细胞分化发育、耳蜗离子稳态、毛细胞感音功能的调节以及突触发生发育、毛细胞损伤修复的多个方面.本文对支持细胞在哺乳动物耳蜗发育及功能中的关键作用做一综述.
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内毛细胞带状突触的形态及功能研究进展
耳蜗作为哺乳动物的听觉器官,能够编码不同频率和强度的声音,这一过程由两种机械力感受细胞参与,即内毛细胞和外毛细胞.具有电运动性的外毛细胞,使耳蜗对声音的频率具有高度敏感性和选择性,对声音有放大作用;而内毛细胞才是真正将声音的频率和强度信息传递给中枢神经系统的感受细胞.耳蜗内毛细胞将声波的振动模拟为电信号,形成电势差,刺激神经递质释放到相应的螺旋神经元,再由螺旋神经元投射到中枢神经系统.
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顺铂致聋后大鼠耳蜗螺旋神经元NeuroD的表达
目的 检测神经分化因子NeuroD在大鼠耳蜗螺旋神经元顺铂损伤后的表达变化.方法 通过免疫组织化学及Real-Time PCR技术,观察耳蜗螺旋神经元损伤1d、3d、5d后NeuroD的表达变化.正常成年SD大鼠32只随机分为对照组(生理盐水5 ml/kg,1次/d,腹腔注射,连续5d),用药1d组(顺铂5 mg/kg,腹腔注射),用药3d组(顺铂5 mg/kg,1次/d,腹腔注射,连续3d),用药5d组(顺铂5mg/kg,1次/d,腹腔注射,连续5d),每组8只,建立顺铂耳毒性模型.采用Real-Time PCR、免疫组织化学染色检测不同时间螺旋神经元NeuroD的mRNA及蛋白表达变化.结果 成功建立顺铂耳毒性大鼠模型,随着用药时间的延长,神经分化因子NeuroD在耳蜗螺旋神经元中呈动态变化.NeuroD的mRNA和蛋白表达在用药1d及3d组分别为2.17±0.39、1.15.±0.20及7.02+0.69、2.42+0.40,与对照组及用药5d组比较具有统计学意义(P值＜0.01).结论 NeuroD在用药1d后开始增加,3d后达到高峰,5d后下降;在用药早期有一过性表达增强,后期表达下降同时听力损失明显.表明NeuroD可能参与顺铂损伤螺旋神经元后的修复过程.
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HO-1在顺铂诱导豚鼠螺旋神经元损伤中的作用
目的：检测血红素加氧酶-1在豚鼠耳蜗螺旋神经节顺铂损伤后的表达变化。方法通过免疫组织化学及Western Blot技术，观察耳蜗螺旋神经元损伤后HO-1在不同组间的表达变化。将32只健康豚鼠随机分为4组，每组8只。A组对照组：按体重以0.9%生理盐水12ml/kg腹腔注射，早晚各一次，持续3天。B组顺铂组：按体重12mg/kg顺铂腹腔注射（IP），早晚各一次，持续3天。C组阿魏酸（FA）+顺铂组：先150mg/kgFA腹腔注射预处理1h，再以12mg/kg顺铂IP，早晚各一次，持续三天。D组FA+锌原卟啉Ⅸ（ZnppⅨ）+顺铂组：同时给予150mg/kgFA+ZnppⅨ15umol/kg IP预处理1h，再以12mg/kg顺铂IP，早晚各一次，持续三天。采用免疫组织化学及Wstern Blot技术检测不同组间螺旋神经元HO-1蛋白表达变化。结果在不同的分组中，HO-1在耳蜗螺旋神经节中表达量不同。空白组中，螺旋神经节组织存在微弱的HO-1表达，其蛋白表达量为0.48±0.07；A组蛋白表达量为0.81±0.07，B组蛋白表达量为0.9±0.05,C组蛋白表达量为0.61±0.07。4个组两两间差异均有统计学意义（p<0.0001）。结论 HO-1在C组中表达量多，B组次之，D组少，表明HO-1可能参与顺铂损伤螺旋神经元后的修复过程。
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T型钙离子通道阻滞剂对成年C57BL/6J小鼠螺旋神经元的保护
目的 探讨T型钙离子通道受体在C57BL/6J小鼠螺旋神经元上的分布和表达,探讨T型钙离子通道阻滞剂对成年C57BL/6J小鼠螺旋神经元的保护.方法 单纯随机选取30只健康6～8周C57BL/6J小鼠,使用原位杂交和RT-PCR来分析三种T型钙离子通道受体α1G,α1H,o1I在螺旋神经元上的分布和表达.另选取30只健康24 ～ 26周C57BL/6J小鼠按照不同的给药方法分为生理盐水组、唑尼沙胺组、贝尼地平组,每组10只,使用免疫组化检测使用药物后螺旋神经元上钙离子调节蛋白(钙调蛋白和钙结合蛋白)的表达变化.结果 三种受体在螺旋神经元上均有分布,但是各个受体的表达量不同,表达量从多到少依次为α1H(24.21 ±0.10)、α1I(14.88±0.04)、α1G(10.42±0.02).唑尼沙胺治疗组螺旋神经元上钙调蛋白(0.336±0.041)的表达比生理盐水治疗组(0.504-0.020)的明显减少(P＜0.05).唑尼沙胺治疗组(0.482±0.045)和贝尼地平治疗组(0.511±0.032)螺旋神经元上钙结合蛋白的表达比生理盐水组(0.611±0.035)的明显减少(P＜0.05).结论 成年C57BL/6J小鼠在连续使用4周T型钙离子通道阻滞剂后螺旋神经元钙离子调节蛋白表达减少,表明钙超载得到缓解.我们推断T型钙离子通道阻滞剂可能对24 ～ 26周C57BL/6J小鼠的螺旋神经元起一定的保护作用.
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caspase-3激活在庆大霉素所致耳蜗螺旋神经元延迟性死亡过程中的作用
目的 观察毛细胞丢失后耳蜗神经元延迟性死亡模式以及caspase-3的活动.方法 采用3 mol的庆大霉素作用离体培养的耳蜗24 h,损毁全部毛细胞,分别在毛细胞丢失后1、3、5、7和14 d收获样本.采用Neurofilament 200KDa标记耳蜗神经元,TRITC-labeled phalloidin标记毛细胞,免疫荧光染色观察神经元和毛细胞的存活数量,采用Western Blot的方法检测caspase-3特异降解产物α-spectrin,间接确定caspase-3活动.结果 3 mol庆大霉素作用于培养的耳蜗24 h,耳蜗毛细胞几乎全部消失.螺旋神经元和神经纤维的数目随培养时间的延长而减少,神经元存活从第1天的87%降至第14天的5%.神经元变小且形状不规则,在神经纤维上出现实质小体.检测caspse-3激活的特异降解带-120 KDa的灰度值,发现在毛细胞丢失后24 h,caspase-3活性明显高于毛细胞丢失的初时(P＜0.01).结论 毛细胞丢失引起螺旋神经元死亡具有时间依赖效应,神经元出现凋亡的形态学特征,并且有caspase-3的活动.
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耳蜗ribbon突触的损伤与感音神经性聋的相关研究进展
感音神经性聋的发病机制未明确.近多项动物实验研究表明,在老年性聋、噪声性聋及氨基糖苷类药物性耳损伤中,内毛细胞与Ⅰ型传入神经纤维形成的突触损伤早于内毛细胞和螺旋神经元的死亡,引起隐蔽的听力损失,并与螺旋神经元不可逆性的丢失相关,同时也受橄榄耳蜗传出神经系统的调节保护.本文就内毛细胞与Ⅰ型传入神经纤维形成的ribbon突触损伤与感音神经性聋的相关研究进展作一综述.
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用于神经突导向研究的螺旋神经元培养体系初步观察
目的 探寻适用于螺旋神经元神经突导向研究的螺旋神经元培养体系.方法 取新生SD大鼠的螺旋神经节,分别进行分离培养和组织块培养,比较神经突的生长模式.组织块培养时,采用不同底物(包括多聚赖氨酸、层粘连蛋白和I型胶原蛋白等)铺片,观察对螺旋神经元组织块贴壁和神经突生长的影响.用微管相关蛋白2(MAP2)抗体和微管聚合蛋白1(Tau-1)抗体鉴别神经突的极性.结果 组织块培养体系中,部分神经突长出细胞毯,在无干扰的环境中生长.以多聚赖氨酸加层粘连蛋白为底物铺片时,组织块贴壁率高,神经突数量多、生长较快,有利于获取更多适于神经突导向研究的神经突.培养体系中的神经突可被Tau-1抗体标记,而不能被MAP2抗体标记.结论 在多聚赖氨酸加层粘连蛋白包被的可移动玻片上,进行螺旋神经元组织块培养获取自由神经突的方法 适合螺旋神经元神经突的导向研究.
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快速老化小鼠的听功能和耳蜗螺旋神经元的增龄性变化
目的 探讨快速老化小鼠听觉功能和耳蜗螺旋神经元的增龄性变化.方法 选取1、3、5、7、9月龄的快速老化小鼠亚系1(Senescence accelerated mouse/prone 1,SAMP 1)作为实验组,而同龄抗快速老化小鼠亚系1(Senescenceaccelerated mouse/resistance 1,SAMR 1)作为SAMP 1的正常对照组.分别观察其8 kHz短纯音听觉脑干反应阈值、耳蜗螺旋神经节细胞透射电镜形态学、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记[terminal deoxynucle-otidyl transferase(TdT)dUTP nick end labeling]TUNEL免疫组化染色等方面的增龄性变化.结果 ①听功能检测.第7、9个月龄SAMP 1小鼠跟同龄SAMR 1小鼠比较听觉脑干反应阈值差异有统计学意义;②耳蜗螺旋神经节细胞形态学检测.第7、9个月龄SAMP 1小鼠可见螺旋神经元凋亡,而同龄SAMR 1小鼠罕见螺旋神经元凋亡;③耳蜗中轴位切片TUNEL染色.第7个月龄SAMR 1小鼠SGN细胞核基本上不着色[TUNEL染色阳性率为(2.27±2.43)%],第7个月龄SAMP 1小鼠部分SGN胞核着色[染色阳性率为(11.36±4.96)%],两者的染色阳性率差异有统计学意义.结论 SAMP 1小鼠随月龄增长耳蜗螺旋神经元凋亡、听功能减退,7月龄SAMP 1小鼠即出现明显的听功能老化特征,可作为老年聋动物模型用于耳聋的相关研究.
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EGCG对阿米卡星诱导大鼠螺旋神经元诱导型一氧化氮合酶表达的影响
目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG]对阿米卡星(amikacin,Amk)诱导的大鼠耳蜗螺旋神经元(spiral ganglion neuron;SGN) 诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)表达的影响.方法 将30只SD大鼠分为生理盐水对照组、Amk(450 mg/kg·d×14 d)损伤组和Amk加EGCG(50 mg/kg·d×14 d)保护组.各组动物均经深度麻醉后,半身灌注固定处死,取右侧耳蜗标本固定、脱钙、石蜡轴位包埋、轴位切片,近中轴位切片行iNOS免疫组化染色,光学显微镜下检测耳蜗SGN表达情况,并通过切片图像分析进行半定量处理比较.结果 对照组SGN胞浆及细胞核基本上不着色(SGN iNOS染色平均灰度值为111.04±3.15),损伤组SGN部分神经元胞浆内有棕黄色或黄色颗粒或斑片(SGN iNOS染色平均灰度值为90.32±5.26),保护组胞浆及细胞核无明显着色(SGN iNOS染色平均灰度值为109.35±4.89),图像分析结果显示,损伤组与对照组、损伤组与保护组之间的SGN iNOS染色平均灰度值差异有统计学意义.结论 iNOS参与Amk耳中毒时耳蜗螺旋神经元的氧化损伤,EGCG可以减弱Amk耳中毒时耳蜗螺旋神经元iNOS的表达,从而减轻Amk耳毒性.
关键词： 表没食子儿茶素没食子酸酯 阿米卡星 螺旋神经元 诱导型一氧化氮合酶 -
T型钙离子通道受体在不同年龄C57BL/6J小鼠内耳中的表达
目的:探讨3种T型钙离子通道受体(α1G、α1H、α1Ⅰ)在不同年龄段C57BL/6J小鼠螺旋神经元及耳蜗中的表达变化.方法:随机选取30只健康C57BL/6J小鼠(6～8周10只,24～26周10只,42～44周10只),首先使用ABR检测其听力,随后使用RT-PCR来分析3种T型钙离子通道受体(α1G、α1H、α1Ⅰ)在耳蜗及螺旋神经元上的定量表达.结果:3种受体在6～8周小鼠的耳蜗和螺旋神经元上均有分布,但表达量不一致,在螺旋神经元上表达量多的是α1H,在耳蜗上表达量多的是α1I.随着年龄增加尤其是到了42～44周龄时,3种受体的表达呈现出明显的减少.结论:3种T型钙离子通道受体在C57BL/6J小鼠耳蜗与螺旋神经元上均有表达,随着年龄的增加受体的表达减少.
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特异性损伤内耳螺旋神经元小鼠模型的建立
目的：建立小鼠内耳螺旋神经元损伤的耳聋模型，为研究干细胞移植治疗感音神经性聋奠定基础。方法成年雌性SPF级CBA／J小鼠60只，随机分为实验组和生理盐水组，每组30只，实验组动物经圆窗渗透给予10μl哇巴因（ouabain），生理盐水组同法给予等量生理盐水。每组于给药前及给药后7、14及30天分别检测小鼠听性脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE），并用免疫组织荧光技术和基底膜铺片技术分别观察耳蜗螺旋神经元（spiral ganglion neurons ，SGNs）细胞及内耳毛细胞（hair cells ，HCs）的变化。结果①与生理盐水组比较，实验组给药后各时间点 ABR反应阈均明显升高，波Ⅰ潜伏期延长，振幅明显降低，差异有统计学意义（ P＜0．05）。②实验组及生理盐水组小鼠DPOAE均可正常引出。③与生理盐水组相比，实验组耳蜗各回螺旋神经元的数量及密度显著降低，差异有统计学意义（P＜0．05）。④实验组在给药后不同时间点，耳蜗各回内、外毛细胞均排列整齐、形态完整、未见明显损伤或丢失。结论哇巴因经圆窗渗透给药可特异性损伤CBA／J小鼠内耳螺旋神经元及其功能，而不损伤内、外毛细胞，是一种理想的研究干细胞移植治疗感音神经性聋的动物模型。
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谷氨酸损伤体外培养大鼠螺旋神经元中凋亡诱导因子的表达与分布
目的：观察不同浓度谷氨酸（Glu）损伤螺旋神经元中凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）的表达与分布变化，探讨利用谷氨酸损伤体外培养螺旋神经元是否与 AIF 凋亡途径相关。方法取40只出生后0～3天 SD 仔鼠螺旋神经元行体外培养，所得培养细胞平均分为正常组和10 mM、20 mM、40 mM Glu 组，正常组仅给予正常 SGNs 培养液培养，其余三组分别加入相应浓度谷氨酸和 SGNs 培养液，培养48 h 后，应用光学显微镜、免疫荧光染色及实时荧光定量 PCR 方法观察四组中 SGN 细胞形态、SGN 中 AIF 的分布及 AIF、钙蛋白酶（cal-pain）、半胱氨酸天冬氨酸3（caspase 3）的表达变化；用 TUNEL 法观察细胞凋亡。结果20 mM 和40 mM Glu 组SGNs 细胞形态改变和细胞凋亡明显，并伴有 AIF 核转位；不同浓度 Glu 组 AIF 和 calpain 基因表达明显高于正常组（P＜0．05），但 caspase 3表达无明显升高（P＞0．05）。结论谷氨酸损伤体外培养的螺旋神经元过程中，AIF 凋亡途径参与了细胞凋亡，calpain 的高表达也促进了兴奋性神经递质对 SGNs 的损伤，但 caspase3途径无明显作用。
关键词： 螺旋神经元 谷氨酸 凋亡诱导因子 钙蛋白酶 半胱氨酸天冬氨酸 3 -
EGCG对阿米卡星诱导的大鼠螺旋神经元凋亡的保护作用
目的 研究硫酸阿米卡星(Amikacin sulfate)诱导SD大鼠螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)损伤的机制及表没食子儿茶素表没食子酸酯(-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG]对硫酸阿米卡星耳毒性的保护作用.方法 60只SD大鼠(雌雄各半)随机均分为三组,对照组(NS组)每日皮下注射生理盐水4.5ml/kg,中毒组(A组)每日皮下注射Arnikacin 450 mg/kg,保护组(AE组)每日皮下注射Amikacin 450 mg/kg,同时腹腔注射EGCG 50 mg/kg,以上三组均连续用药14天.每组用药前和用药后第7、14、21、35天随机抽取4只行ABR检测和组织学观察,比较三组间ABR的波潜伏期(peak latency,PL)和波间期(interpeak latency,IPL)、HE染色切片中的螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)计数、TUNEL染色切片后的SGNs凋亡阳性细胞数.结果 ①用药前三组间ABR的PL和IPL无显著性差异,中毒组使用阿米卡星后第14和21天ABR的波潜伏期和波间期较保护组及对照组明显延长(P＜0.05);②使用阿米卡星后,SGNs细胞数随时间的延长逐渐减少,保护组和中毒组有显著差异(P＜0.05);而TUNEL检测片中,中毒组和保护组SGNs的凋亡阳性细胞数均随时间的延长而增多,中毒组明显多于EGCG保护组(P＜0.05).结论 ①阿米卡星能诱导大鼠耳蜗螺旋神经元的凋亡;②EGCG能减低阿米卡星诱导的大鼠耳蜗螺旋神经元的凋亡,对听功能、耳蜗螺旋神经元有很好的保护作用.
关键词： 凋亡 硫酸阿米卡星 表没食子儿茶素表没食子酸酯 螺旋神经元 听性脑干反应 -
脑源性神经营养因子基因修饰骨髓基质细胞对体外培养小鼠螺旋神经元的影响
目的探讨人脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因工程细胞的建立及其对体外培养的小鼠螺旋神经元生长活性的影响.方法参照分子克隆技术成功构建BDNF真核表达载体--pcD-NA3.1(-)-BDNF,体外证实BDNF基因转染猿猴病毒40肝脏转化细胞(COS7)后正常表达,将骨髓基质细胞分离培养,体外转染骨髓基质细胞建立BDNF基因工程细胞,观察该基因工程细胞对体外培养小鼠螺旋神经元的生长活性的影响.结果成功构建BDNF基因真核表达载体,并且建立了BDNF基因工程细胞;在体外BDNF基因工程细胞能促进螺旋神经元的生长,并保护螺旋神经元免受氧化损伤.结论建立的BDNF基因修饰的骨髓基质细胞,对体外螺旋神经元生长、生存起着重要的保护作用,为进一步研究基因修饰的骨髓基质细胞内耳移植奠定了重要的基础.
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神经营养因子对耳蜗螺旋神经元的作用
感音神经性听力损失主要源自耳蜗毛细胞和/或螺旋神经元的损伤和退化,耳蜗螺旋神经元(spiral ganglion neuron,SGN)是传导听觉信息的一级神经元,噪声、感染、耳毒性药物和衰老等诸多因素直接或者间接使螺旋神经元受损,可导致感音神经性听力损失,而哺乳动物螺旋神经元的再生能力非常低,因此保护螺旋神经元或者修复受损的螺旋神经元对恢复听力有关键性的作用.
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噪声性损害对听觉中枢影响的研究进展
噪声性聋(noise incduceol hearing loss,NIHL)是一种常见的后天获得性感音神经性聋,主要是由于长期接触过度声刺激所引起的缓慢进行性听力损失.由于噪声所致的听觉损害主要的病变部位在耳蜗,传统上大多数的研究都把重点放在耳蜗,特别是毛细胞、螺旋神经元和血管纹等部位的生物化学、形态学和生理学改变[1].近年来随着相关研究的逐渐深入,有越来越多的证据提示噪声性听觉损害可以通过某些特殊的途径引起中枢听觉通路的结构和功能的改变.本文拟就噪声性损害对听觉中枢影响的相关研究进展作一综述.
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应用LsAB技术显示五羟色胺受体亚型1A在小鼠螺旋神经元上的分布
目的 显示五羟色胺(serotonin,5-HT)受体亚型1A在螺旋神经元上的分布.方法 采用出生后3～6天的乳小鼠耳蜗进行冰冻切片,应用酶标链亲和素-生物素(labeled streptavidin-biolin technique,LsAB)技术显示五羟色胺受体亚型1A在螺旋神经元上的分布.结果 实验组的乳鼠耳蜗螺旋神经元的细胞膜显示阳性信号,阴性对照组的乳鼠耳蜗螺旋神经元的细胞膜上未发现阳性信号.结论 五羟色胺受体亚型1A存在于耳蜗螺旋神经元的细胞膜上,推测当毛细胞释放兴奋性神经递质引起螺旋神经元兴奋时,五羟色胺作为神经递质对螺旋神经元的听觉传导活动起着重要的调节作用.
关键词： 酶标链亲和素-生物素技术 五羟色胺受体亚型1A 耳蜗 螺旋神经元 -
新生小鼠耳蜗基底膜体外培养的实验研究
目的 建立可靠的新生小鼠离体耳蜗基底膜的培养方法,为内耳的研究提供新的条件和模型.方法 在显微镜下完整分离出新生1～5d小鼠的耳蜗基底膜组织,采用组织贴壁法在无血清培养基中进行培养,免疫荧光法检测新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织中毛细胞及螺旋神经元的生长状态.结果 新生小鼠耳蜗基底膜离体培养24 h后,显微镜下观察可见基底膜贴壁生长良好,外周有新生上皮细胞和成纤维细胞长出;高倍显微镜下可见耳蜗内外毛细胞和支持细胞等结构;免疫荧光法检测可见毛细胞和螺旋神经元生长良好,并能保持较长一段时间.结论 组织贴壁法无血清培养新生小鼠离体耳蜗基底膜是一种理想的耳科实验造模方法.
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蛋白酶TMPRSS3在小鼠耳蜗中的表达分析
目的:观察跨膜丝氨酸蛋白酶3（transmembrane protease,serine 3,TMPRSS3）在小鼠耳蜗组织中的表达与分布,分析不同年龄阶段耳蜗TMPRSS3 mRNA表达情况,初步探讨内耳蛋白酶TMPRSS3的作用.方法:采用免疫组织化学结合免疫荧光双标技术观察C57/BL小鼠耳蜗组织TMPRSS3蛋白表达分布,解剖耳蜗、耳蜗螺旋神经元、Corti器、血管纹组织,采用实时荧光定量PCR检测上述组织细胞中TMPRSS3的表达情况,依次取不同年龄组小鼠耳蜗标本,实时荧光定量PCR检测各年龄组耳蜗TMPRSS3 mRNA表达的变化.结果:蛋白酶TMPRSS3主要表达分布在耳蜗螺旋神经元中,耳蜗Corti器、血管纹组织细胞中也有TMPRSS3阳性表达；各年龄阶段小鼠耳蜗均存在TMPRSS3 mRNA表达,但其整体表达水平相对较低.结论:耳蜗多处部位存在蛋白酶TMPRSS3的表达,但其表达主要分布在耳蜗螺旋神经元中,提示TMPRSS3的作用可能主要体现在维护听觉螺旋神经元的生理功能方面.
关键词： 跨膜丝氨酸蛋白酶3 Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶 耳蜗 螺旋神经元
