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乙肝病毒X蛋白活化c-Src激酶诱导肝癌细胞发生上皮-间充质转化的机制
目的 探讨在乙肝病毒X蛋白(HBx)诱导肝癌细胞上皮-间充质转化(EMT)过程中癌基因c-Src的作用.方法 通过HBx基因转染诱导SMMC-7721肝癌细胞发生上皮-间充质转化,量化分析实验组和对照组细胞c-Src激酶的活化情况.抑制c-Src活性,通过实时PCR、蛋白印迹、免疫细胞化学等方法评价c-Src活化对上皮-间充质转化的影响.结果 发生上皮-间充质转化的SMMC-7721细胞中c-Src活化显著增加.给予c-Src激酶抑制剂PP2后,细胞由梭形恢复原来的上皮表型,而给予安慰剂PP3细胞形态无明显变化.蛋白印迹、免疫细胞化学检测进一步证实,抑制c-Src活化能逆转HBx基因转染诱导的上皮-间充质转化,使细胞再次发生间叶-上皮样转化,即上皮标志物(E-cadherin、α-catenin)表达显著上调,间叶标志物(N-cadherin,Vimentin,Fibronectin)表达显著减少.结论 HBx蛋白诱导SMMC-7721肝癌细胞发生上皮-间充质转化时,c-Src活化发挥了关键作用.
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CCRK在肝细胞癌组织中的表达及其与HBx的关系
目的 为了研究肝细胞癌的发病机制,探讨细胞周期相关激酶(CCRK)在肝细胞癌组织中的表达及意义,以及CCRK与乙肝病毒X蛋白(HBx)之间的关系.方法 RT-PCR法和Western印迹法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测CCRK和HBx在肝癌组织、癌旁组织和正常组织中的表达情况.结果 肝癌组织中CCRK mRNA及蛋白水平均明显高于癌旁肝组织,差异具有统计学意义(P＜0.05)；CCRK的表达与肝癌患者的性别、年龄,HBsAg,肿瘤大小均无关,而与临床分期有关；CCRK与HBx没有相关性.结论 CCRK在肝癌组织中的表达水平高于癌旁组织,对肝细胞癌的发生发展具有促进作用,但是与HBx没有相关性.
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乙肝病毒X蛋白与肝癌的关系
在全球范围内,肝细胞癌(hepatic cellular cancer,HCC)作为一类普遍的癌症,严重影响着人们的身心健康和生命.平均每年有700 000入死于肝癌,且发病率逐年增长.乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染已经被认为是HCC发生的危险性影响因素.然而,HBV诱导的肝癌发生的发病机制尚未清楚.有证据显示,HBV X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)在肝癌转化和恶性转移过程中扮演着关键角色.HBx是一个多功能的调节因子,与宿主相关因子协作,发挥其功能,能调节转录、信号转导通路、细胞周期进程、凋亡、蛋白降解途径、抑癌基因和原癌基因的表达.本文主要从分子机制方面阐述HBx诱导肝癌发生的新研究成果.
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HBx对肝细胞中β-catenin表达的影响
目的:乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)是一种反式作用因子,它通过增强各种转录和调控因子的表达影响肝细胞的增殖和凋亡.在原发性肝癌(HCC)的发生发展中发挥重要的作用.Wnt/β-catenin信号转导通路在胚胎发育和肿瘤发生中也发挥了重要的作用.本实验利用腺病毒表达系统,研究HBx与Wnt信号转导通路中主要信号分子β-catenin的相互作用及对它的影响,探讨HBV相关性肝癌的发生机制.方法:通过HEK293细胞扩增腺病毒获得高滴度的Ad-GFP和Ad-GFP-HBx,采用表达有绿色荧光蛋白的腺病毒高表达载体系统将HBx基因有效转入人正常肝细胞L02细胞系.通过Western blot证实HBx在L02细胞中有效表达.RT-PCR、Western blot检测转染Ad-GFP-HBx的L02细胞中β-catenin表达的变化.结果:HEK293扩增腺病毒获得的Ad-GFP滴度为:1.5×109 pfu/ml,Ad-GFP-HBx的滴度为:1.0×108pfu/ml.Ad-GFP-HBx腺病毒感染细胞后能使HBx在L02细胞中有效表达,且感染Ad-GFP-HBx后HBx的表达显著增加L02细胞中β-catenin mRNA的表达量(P<0.05)和β-catenin蛋白的表达量(P<0.05).结论:HBx可以上调人正常肝细胞系L02细胞中β-catenin的表达,提示HBx可能通过调控β-catenin的异常表达激活Wnt信号通路.促进原发性肝癌的发生.Wnt信号传导主要取决于β-catenin在细胞内的水平,当β-catenin水平低下,Wnt途径关闭;当β-catellin水平升高时,Wnt途径开启,而Wnt信号的激活与肿瘤的发生密切相关.可见,HBx能增强β-catenin的表达,提示HBx可能是调控β-catenin的关键因子,而β-catenin的异常表达又能激活Wnt信号通路,终导致肝癌的发生.这也间接证明了HBx在肝癌的发生发展中具有重要的作用,且该作用与Wnt信号中的关键分子β-catenin密切相关.
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HBx通过上调前列腺素E2受体2的表达增强HL-7702肝细胞的侵袭能力
目的:以HL-7702肝细胞为研究对象,探讨HBx的表达对EPs的影响以及与侵袭转移的相关性.方法:建立表达HBx的HL-7702人正常肝细胞(HL-7702/HBx),采用HBxRNAi载体构建抑制HBx的HL-7702肝细胞株(HL-7702/HBx-siRNA),检测抑制HBx前后细胞培养上清PGE2浓度的变化、细胞表达EPs mRNA和基质金属蛋白酶(MMPs)mRNA的变化,并进一步采用EP2-siRNA瞬时转染、Western-blot、明胶酶谱和Transwell小室等技术观察EP2表达的抑制对MMPs活性以及细胞侵袭和转移能力的影响.结果:与对照细胞相比,PGE2、EP2和MMP-2的mRNA相对表达值在HL-7702/HBx细胞明显增高(P<0.05),分别为(123.9±9.9)Pg·mL-1、(0.445+0.025)Pg·mL-1和(0.226±0.016)Pg·mL-1,在抑制HBx表达后则明显下调(P<0.05),分别为(78.0±5.9)Pg·mL-1、(0.336±0.007)Pg·mL-1和(0.117±0.012)Pg·mL-1;对照细胞HL-7702的EP2表达抑制前后,MMP2活性、细胞侵袭和移动能力变化不明显;而HL-7702/HBx细胞的EP2表达受抑制后,其MMP2活性和细胞侵袭能力则明显下降(P<0.05),侵袭细胞数由(64.4±3.4)个,视野下降为(55.2±2.2)个/视野,细胞的移动能力变化不大.结论:HBx可以促进EP2表达和增加MMP2活性,并通过EP2上调HL-7702肝细胞的侵袭能力.抑制EP2表达可能对HBV感染的肝癌侵袭转移治疗研究具有潜在的应用价值.
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HBx和HIF-1α在肝癌血管生成中的关系及临床意义
目的 探讨乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)与缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor,HIF-1α)在乙肝相关性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织血管生成及转移中的作用.方法 选择84例乙肝相关性肝癌组织和22例非乙肝相关性肝癌组织,免疫组化法检测HBx、HIF-1α及血管内皮细胞表面抗原(CD34)表达,光镜下记录微血管计数(microvessel density,MVD).结果 84例乙肝相关性肝癌组织中HBx阳性表达率为73.81%(62/84).62例HBx阳性表达组中的HIF-1α阳性率为69.35%(43/62),明显高于HBx阴性组40.91%(9/22)和非乙肝相关性肝癌组36.36%(8/22)(P<0.05).HBx阴性表达的乙肝相关性肝癌组和非乙肝相关性肝癌组中HIF-1α阳性表达无统计学意义(P>0.05).HBx和HIF-1α的表达呈正相关(rs=0.573,P<0.01);HBx和HIF-1α在高分化肿瘤组织中的表达高于低分化组织(P<0.05),且转移组表达高于无转移组;HBx阳性表达组平均MVD值明显高于HBx阴性组和非乙肝相关性肝癌组(P<0.01),有转移组MVD高于无转移组(P<0.01);有门脉侵犯组高于非侵犯组(P<0.05).结论 HBx和HIF-1α广泛表达于乙肝相关性肝癌组织中,二者呈正相关;HBx可能通过上调HIF-1α的表达在乙肝相关性肝癌组织血管生成及转移中起促进作用.
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基因芯片分析稳定转染HBx基因的HepG2肝癌细胞对人脐静脉血管内皮细胞基因的差异表达
目的 采用基因芯片技术筛选稳定转染HBx基因的HepG2肝癌细胞对人脐静脉血管内皮细胞的差异表达基因.方法 ①以人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)为细胞模型,通过transwell共培养技术,分别将肝癌细胞HepG2及稳定转染HBx基因肝癌细胞HepG2(HepG2-X)与HUVEC共培养.②分别提取细胞总RNA,通过基因芯片技术筛选差异表达基因.结果 有643条基因差异表达明显,其中UBR3、ATXN3等19条基因经HBx干预后表达量明显上升,FOLR1、HSPs、ZNF等624条明显下降.结论 利用基因芯片技术可以筛选HBx参与的肝癌血管生成差异表达基因,为肝癌的诊治、预防提供一定的理论依据.
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Notch1蛋白-人类HBx相关性肝癌治疗新靶点
肝细胞肝癌(HCC)发病率不断增加,但迄今尚缺乏有效的治疗方法和药物.因此,迫切需要寻找一种有效的治疗方法.慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致肝癌的重要原因之一,其中乙肝病毒X蛋白(HBx)是导致肝癌发生的直接原因.我们近发现HBx可以活化Notch1蛋白从而促进肿瘤生长,而Notch1短发夹RNA(shRNA)可以抑制Notch1表达从而抑制肿瘤的生长.本文综述了近年有关Notch1与HCC的关系,提出HCC基因治疗的新靶点.
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HBx和VEGF与乙肝相关性肝癌组织血管生成及转移的关系
目的:探讨乙肝病毒X蛋白(HBx)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)在乙肝相关性肝癌组织血管生成及转移过程中的作用.方法:选择84例乙肝相关性肝癌组织和22例非乙肝相关性肝癌组织,免疫组织化学法检测HBx、VEGF及血管内皮细胞表面抗原(CD34)表达,光镜下微血管计数(MVD).结果:84例乙肝相关性肝癌组织中HBx阳性表达率为73.81%(62/84),阴性率为26.19%(22/84);62例HBx阳性表达组中VEGF阳性率[74.19%(46/62)]明显高于22例HBx阴性组[36.36%(8/22)]和非乙肝相关性肝癌组[36.36%(8/22) (P<0.05)];HBx阴性表达的乙肝相关性肝癌组和非乙肝相关性肝癌组中VEGF阳性表达比较差异无显著性 (P>0.05);84例乙肝相关性肝癌组织中HBx和VEGF的表达水平呈正相关关系(R_s＝0.552,P<0.01);二者在高分化肿瘤组织中的表达高于低分化组织 (P<0.05),有转移组表达高于无转移组;HBx阳性表达组平均MVD值明显高于HBx阴性组和非乙肝相关性肝癌组 (P<0.01),有转移组MVD高于无转移组 (P<0.01);有门脉侵犯组高于非侵犯组 (P<0.05).结论:HBx和VEGF广泛表达于乙肝相关性肝癌组织中,二者表达水平呈正相关关系;HBx可能通过上调VEGF的表达在乙肝相关性肝癌组织血管生成及转移中起促进作用.
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乙肝病毒X蛋白在乙肝相关性肝细胞癌及癌旁组织的表达及与相关临床因素的相关性
目的 探讨乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)在乙肝相关性肝细胞癌及癌旁组织中的表达及与相关临床因素间的关系.方法 选择2015年1月至2017年5月曹县县立医院收治的乙肝相关性肝细胞癌病人200例,应用免疫组织化学法对癌组织及癌旁组织中的神经性钙粘蛋白(N-cadherin)、转录因子Twist上皮性钙粘蛋白(Twist E-cadherin)、HBx等指标进行检测,评估乙肝相关性肝细胞癌及癌旁组织中的N-cadherin、Twist E-cadherin、HBx等指标的阳性率.评估HBx蛋白的表达与相关临床因素间的关系.结果 肝细胞癌组织中N-cadherin阳性表达167例(83.5％),癌旁组织中阳性表达140例(70.0％),差异有统计学意义(P<0.05),Twist E-cadherin在肝细胞癌中阳性表达176例(88.0％),在癌旁组织中表达143例(71.5％),差异有统计学意义(P<0.05),HBx在肝细胞癌组织中阳性表达192例(96.0％),在癌旁组织中表达178例(89.0％)(P>0.05).HBx在肝细胞癌及癌旁组织中的阳性表达与肿瘤的临床分期、是否出现肝外转移、门脉癌栓、肿瘤分化程度等因素密切相关,差异有统计学意义(P<0.05).结论 乙肝相关性肝细胞癌的转移及侵袭与HBx的高表达水平密切相关,HBx可能通过上调Twist引发肝癌细胞的上皮间质转化.
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HBx和癌胚抗原相关细胞黏附分子1在乙型肝炎相关性肝癌中的作用及病理特征
目的 探讨HBx和癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)在乙型肝炎相关性肝癌中的表达及意义.方法 采用免疫组织化学方法(SP法)检测81份乙肝相关性肝癌组织中HBx及CEACAM1的表达情况,分析HBx和CEACAM1与乙肝相关性肝癌的临床病理特征.Western印迹检测人正常肝细胞系QZG、肝癌细胞HepG2及稳定转染HBx的肝癌细胞HepG2(HepG2-X)中CEACAM1的表达.结果 81份乙肝相关性肝癌组织中HBx表达阳性率为74.07％ (60/81),CEACAM1表达阳性率为71.60％ (58/81),二者与门静脉侵袭、淋巴结转移和TNM分期存在显著相关,HBx与CEACAM1的表达呈负相关(rs=-0.310,P＜0.01)；在HepG2-X中,CEACAM1蛋白表达水平与肝癌细胞HepG2及人正常肝细胞系QZG相比显著降低.结论 HBx的高表达和CEACAM1的低表达与乙肝相关性肝癌的侵袭、转移密切相关,HBx有可能通过抑制CEACAM1的表达而诱导乙肝相关性肝癌的侵袭与转移.
关键词： 乙肝病毒X蛋白 癌胚抗原相关细胞黏附分子1 肝癌 -
乙肝病毒X蛋白上调肝癌细胞缺氧诱导因子-1α的作用和机制研究
背景与目的：乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)和缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)在肝癌发生、发展过程中起重要作用。有研究显示，两者在肝癌组织中的表达呈正相关，但相关机制尚不明确。本研究拟进一步在细胞水平上探讨HBx对HIF-1α的调控作用及机制。方法：用LipofectemineTM 2000包裹HBx表达质粒转染到肝癌Huh7细胞。蛋白[质]印迹法(Western blot)检测Huh7细胞中HIF-1α和HIF-1β蛋白的表达；特异性试剂盒检测HIF-1α转录活性；实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测HIF-1α及其靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和多药耐药基因1(multi-drug resistance gene 1，MDR1)mRNA表达变化；免疫共沉淀法检测HIF-1α、HBx和希佩尔林道病肿瘤抑制蛋白(protein von Hippel-Lindau，pVHL)间的相互作用。结果：转染HBx质粒后，Huh7细胞中HIF-1α蛋白表达、转录活性及其靶基因VEGF和MDR1的mRNA表达水平明显上调(P<0.05)，然而HBx对HIF-1α mRNA表达水平没有明显影响(P>0.05)。同时，HBx显著削弱pVHL介导的泛素化水解蛋白酶降解HIF-1α的活性。免疫共沉淀法检测进一步提示，HBx可直接结合pVHL，而对HIF-1α没有结合作用。结论：HBx可能通过直接结合pVHL，抑制其与HIF-1α的相互作用，从而增强HIF-1α蛋白的稳定性及转录活性。
关键词： 肝细胞癌 缺氧诱导因子-lα 乙肝病毒X蛋白 希佩尔林道病肿瘤抑制蛋白 -
乙肝病毒X蛋白对CCL13细胞Period1基因启动子甲基化及其表达的影响
目的：探讨乙肝病毒 X 蛋白（HBx）表达与肝细胞 Period1基因低表达的关系及其机制。方法采用脂质体法将pcDNA3．1-HBx 质粒转入 CCL13细胞，采用甲基化聚合酶链式反应（PCR）、反转录 PCR （RT-PCR）、蛋白质印迹法（western blot）检测 CCL13细胞转染 HBx 质粒前后 Period1基因启动子甲基化水平、mRNA 及蛋白表达水平。结果pcDNA3．1-HBx 质粒转染 CCL13细胞后在该细胞中稳定表达，转染 HBx 质粒后，Period 1在 CCL13细胞启动子甲基化水平较转染空质粒 CCL13细胞明显增高，其 mRNA 及蛋白质的表达水平均较后者明显下降。结论HBx 蛋白可通过上调肝细胞 Period1启动子甲基化水平，促使其表达下调。
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乙肝病毒X蛋白对凋亡蛋白PDCD5表达的影响及意义
目的 研究乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对凋亡蛋白PDCD5的影响及意义.方法 建立稳定转染HBx基因的L02 (L02/HBx)细胞系,通过Real-time PCR和Western Blot检测转染HBx基因后PDCD5 mRNA和蛋白表达水平的改变.结果 转染HBx基因后PDCD5 mRNA和蛋白表达水平上调.结论 HBx可上调凋亡蛋白PDCD5的表达,进一步显示其可能对细胞凋亡具有双重调节作用.
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酵母双杂交文库筛选HBX相互作用蛋白
目的:筛选鉴定新的乙肝病毒X蛋白(hepatitis B viral X protein,HBX)相互作用蛋白.方法:以HBX为诱饵蛋白,将其与酿酒酵母转录因子GAL4 DBD(DNA binding domain)融合表达,将人肝脏cDNA文库编码的蛋白与GAL4的AD区(activation domain)融合表达.通过酵母双杂交筛选鉴定肝脏中与HBX相互作用的蛋白.筛选得到的阳性酵母转化子,经质粒提取和测序后,分析其所包含的序列编码的蛋白,通过再次验证,初步确定该蛋白是否与HBX具有相互作用.结果:筛选得到5个潜在的能与HBX相互作用的蛋白.结论:通过酵母双杂交cDNA文库筛选,得到多个潜在的HBX相互作用蛋白,进一步的验证及功能研究将对揭示HBX促进肝癌发生的机制起到重要的推动作用.
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Twist、HIF-1α及HBx在原发性肝癌表达及相关性研究
目的:研究原发性肝癌(PLC)组织中转录因子Twist,缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)以及乙肝病毒X蛋白HBX)的表达及其相关性.方法:应用免疫组织化学SABC染色方法检测33例PLC组织及PLC合并肝硬化患者的癌旁组织、17例正常肝组织中Twist,HIF-1α以及HBx的表达,分析三者相关关系.结果:PLC组织中Twist、HIF-1α以及HBx的阳性表达率分别为93.9%,72.7%和81.8%.癌旁组织中Twist的表达率为54,5%.PLC与癌旁组织中Twist的表达有统计学意义(p＜0.01).正常肝组织中未见Twist表达.PLC组织中Twist分别与HIF-1α及H8x的表达呈显著正相关(y=0.438,p=0.011;y=0.445,p=0.009)结论:PLC组织中Twist,HIF-1α以及HBx的表达的上调,对肿瘤的发生、发展起着重要作用.
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乙肝病毒X蛋白促进肝细胞癌侵袭转移相关分子的作用机制
乙肝病毒X蛋白(HBx)是乙型肝炎病毒编码的病毒蛋白,在介导肝细胞癌(HCC)转移中起重要作用.新近研究发现,HBx可通过介导肿瘤转移相关分子,如基质金属蛋白酶(MMP)、血管内皮生长因子(VEGF)及尿激酶纤溶酶原激活因子(uPA)等表达,进而活化转移相关信号传导通路,促进HCC转移.
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乙型肝炎病毒X蛋白在肝癌中的表达及其与HBVDNA的关系
目的：探讨乙型肝炎病毒（ HBV） X蛋白（如HBxAg）在肝癌中的表达及意义。方法采用免疫组化法检测41例肝癌组织和癌旁组织中HBxAg和HBcAg表达，采用定量PCR法检测23例肝癌组织HBV DNA表达。结果HBxAg在肝癌组织和癌周组织中的表达阳性率差异无统计学意义（ P＞0．05）。癌组织、癌周组织中， HBxAg和HBcAg表达阳性率比较差别均有统计学意义（ P均＜0．05）。 HBxAg阳性表达和HBV DNA表达呈正相关（ r＝0．455，P＜0．05）。结论 HBxAg与HBV DNA相互作用共同诱导肝癌的发生。
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生物钟基因 Timeless 在 HBV 相关肝癌组织中的表达及其与乙肝病毒 X 蛋白的关系
目的：探讨生物钟基因Timeless在HBV相关肝癌中的表达及其与乙肝病毒X蛋白（ HBx）的关系。方法选择60例HBV相关肝癌患者，取其癌组织及癌旁正常组织，采用免疫组化法观察Timeless的表达，分析Timeless表达与患者临床病理参数的关系。取人正常肝细胞系LO2、肝癌细胞系HepG2，分别转染pcDNA3．1-HBx质粒和pcDNA3．1质粒，采用Real-time PCR和Western blotting法检测细胞内Timeless mRNA及其蛋白表达。结果肝癌组织及癌旁正常组织Timeless阳性表达率分别为60．0％（36／60）、38．3％（23／60），二者比较P＜0．05。 Timeless阳性表达与肝癌患者血管侵犯有关（P＜0．05），与患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤组织分化程度、血清AFP水平无关（P均＞0．05）。转染pcDNA3．1-HBx质粒的HepG2细胞和LO2细胞Timeless mRNA及其蛋白相对表达量均明显高于转染pcDNA3．1质粒细胞（P均＜0．05）。结论 HBV相关肝癌组织中Timeless高表达，其表达变化与HBV相关肝癌的发生、发展有关；HBx可能是引起Timeless表达升高的原因之一。
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乙肝病毒X蛋白对E-cadherin和T-cadherin表达的调节作用
目的 体外研究乙肝病毒X蛋白(HBx)对E-钙黏蛋白(E-cadherin)和T-钙黏蛋白(T-cadherin)表达的调节作用.方法 建立稳定表达HBx基因的HepG2细胞系(HepG2-HBx),稳定转染空质粒pcDNA3.1的HepG2细胞系作为对照(HepG2-pcDNA3.1),分别用荧光实时定量(Real-time)PCR和Western-blot技术检测转染前后E-cadherin和T-cadherin在mRNA及蛋白水平表达变化.结果 以HepG2-pcDNA3.1细胞为参照,转染HBx基因后的HepG2-HBx细胞E-cadherin mRNA和蛋白水平分别为其(42.28±8.73)%和(35.28±4.33)%,而T-cadherin则分别为其(4.47±0.78)和(5.11±0.83)倍,差异有统计学意义(P<0.05).结论 HBx下调E-cadherin的表达,上调T-cadherin的表达,其机制可能为HBx促进E-cadherin向T-cadherin转换.
