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甲基强的松龙对体外培养许旺氏细胞的作用
目的:探讨甲基强的松龙(MP)对体外培养许旺氏细胞的作用.方法:取成年SD大鼠坐骨神经以植块法分离纯化许旺氏细胞,将纯化后的细胞培养2周后分为5组移入96孔板,A、B、C组为MP组(按加入药物浓度不同分组20μg/ml,2μg/ml,0.2μg/ml),D组为神经生长因子(NGF)组(药物浓度0.1μg/ml),E组为对照组.继续培养9d后倒置显微镜下观察细胞生长情况并以MTT法测定各组许旺氏细胞的存活与增殖能力.结果:倒置显微镜下观察小剂量MP组及NGF组细胞生长优于其他各组.570nm波长分光光度计测定A值,小剂量(0.2μg/ml)MP组为0.376±0.079,中剂量(2μg/ml)MP组0.286±0.116,大剂量(20μg/ml)MP组0.280±0.086,NGF组0.320±0.121,对照组0.252±0.115,小剂量MP组明显优于大剂量MP组(P＜0.05),同时优于对照组(P＜0.05),余各组间均无明显统计学差异.结论:小剂量MP能够促进体外培养许旺氏细胞增殖,从而促进周围神经损伤的修复,细胞培养用药浓度为0.2μg/ml.MP浓度过大(相当于临床冲击剂量的血峰浓度)将抑制细胞增殖.
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许旺细胞与PLGA共同移植于大鼠全横断脊髓损伤的实验研究
目的 观察许旺细胞与PLGA组织工程材料共同移植于大鼠全横断脊髓损伤处对脊髓修复的影响.方法 许旺细胞与PLGA体外共同培养后行扫描电镜观察,将其共移植于大鼠横断性脊髓损伤处,不同时间行BrdU/MBP免疫组化、天青-美蓝染色、透射电镜、运动功能评分(BBB)、运动诱发电位(MEP)、股四头肌复合肌肉动作电位(CMAP)、体感诱发电位(SEP)检测.结果 扫描电镜下许旺细胞在PLGA内生长良好.6个月后移植物内可见BrdU/MBP免疫组化双染阳性细胞,天青-美蓝染色和透射电镜观察可见新生的髓鞘及形成髓鞘的许旺细胞.BBB评分各组间无显著性差异,MEP和SEP检测移植后6个月所有大鼠波形仍未恢复,但T11-12椎间隙可记录到SEP波.结论 许旺细胞与PLGA具有良好的组织相容性,共同移植于损伤脊髓可促进轴突生长及髓鞘再生,但没有与损伤远端联系.
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雪旺细胞移植促进中脑损伤神经元修复的实验研究
目的探讨雪旺细胞移植对损伤的大鼠中脑神经元修复的影响.方法 BrdU标记的新生大鼠雪旺细胞移植至电针损伤的大鼠中脑区域,不同时间处死动物,免疫组织化学方法观察BrdU、GAP-43的表达并通过图像分析系统处理实验结果.结果雪旺细胞移植后8个月仍可见BrdU阳性细胞,其数目增加15%,并主要向大脑皮层迁移;移植后1个月损伤的中脑神经元GAP-43的表达与对照组相比差异有显著意义.结论雪旺细胞移植可促进中脑损伤神经元的修复.
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鼠坐骨神经损伤后雪旺细胞增殖规律的免疫组织化学观察
目的描述周围神经损伤后雪旺细胞的变化规律及神经吻合术变化对此规律的影响.方法采用SD雄性大鼠48只,制作坐骨神经损伤模型,左侧外膜缝合,右侧原位旷置,分别于术后24、48 h、4、7、14、21 d取缝合点远近各2 mm长坐骨神经(每时间点8只大鼠)以及6根作为阴性的正常SD大鼠坐骨神经标本,采用S100抗体免疫组化染色观察.采用德国Leica公司的Qwin软件分析单位视野内的雪旺细胞数变化.结果术后2 d开始雪旺细胞数明显增加,在1周时达到高峰.此后外膜缝合各时间点雪旺细胞数下降较慢,且免疫原性下降较慢.而右侧旷置各时间点有纤维细胞样细胞浸润.结论雪旺细胞与轴突的相互作用对于雪旺细胞的数量及功能维持意义重大.周围神经损伤后一期吻合有利于周围神经的修复.
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许旺细胞标记物GFAP与肌上皮细胞标记物α-SMA在涎腺腺样囊性癌中共表达
目的 检测许旺细胞标记物胶原原纤维酸性蛋白(GFAP)与肌上皮细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在涎腺腺样囊性癌(ACC)中的表达情况,并探讨GFAP、α-SMA与ACC嗜神经侵袭的关系.方法 用免疫组织化学、免疫荧光双标记及激光共聚焦显微镜技术检测GFAP蛋白与α-SMA蛋白在ACC组织中的表达.结果 在ACC组织中,GFAP蛋白与α-SMA蛋白均有表达,二者在同一肿瘤性肌上皮样细胞胞质中共表达.结论 ACC中肿瘤性肌上皮样细胞发生许旺细胞分化并侵袭神经可能是ACC嗜神经侵袭的组织病理学基础.
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自体许旺细胞桥移植治疗帕金森病模型猴的研究
目的研究猴自体许旺细胞(SC)从内侧前脑束区(MFB)到尾状核的桥移植对偏侧帕金森病模型猴产生的功能效应及结构效应.方法将3只偏侧帕金森病模型猴(恒河猴)自体SC悬液在立体定向下进行从MFB到尾状核的桥移植,另3只模型猴注射生理盐水作为对照.术后进行行为学评估,应用单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)检测多巴胺代谢的变化,4个月后进行细胞学检查.结果自体SC桥移植后,猴行为学表现明显好转.在SPECT检查中,猴脑内移植侧的基底节区多巴胺代谢明显增加,放射性计数从术前的61%增加到术后的79%.SC可在猴脑内存活并迁移,并使其周围的多巴胺能神经纤维明显增加,每只猴针道周围酪氨酸羟化酶(TH)阳性的星形胶质细胞数量超过5000个.移植组猴针道周围TH表达也明显增高,为对照组的243%.结论自体SC桥移植对帕金森病猴有明确的治疗作用.
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雪旺细胞源性神经细胞黏附分子L1对脊髓轴突再生作用的研究
目的研究神经细胞黏附分子L1抗体封闭后的雪旺细胞对脊髓损伤后轴突再生的影响.方法将纯度高于98%的新生SD大鼠坐骨神经源性雪旺细胞、经神经细胞黏附分子L1抗体封闭后的雪旺细胞及生理盐水分别移植于成年SD大鼠T10节段左侧胸髓半横切损伤处(各组大鼠均为24只),8周后采用辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪、NF免疫组化染色及Western blot蛋白定量等方法,观察损伤脊髓的神经轴突再生情况.结果L1抗体封闭组与应用未封闭雪旺细胞组相比,HRp阳性神经元数目明显减少,再生神经轴突量减少,Western bl0t显示前者NF量仅为后者的2/3左右.结论雪旺细胞源性神经细胞黏附分子L1对损伤脊髓的轴突再生具有促进作用.
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与雪旺细胞联合培养的成肌细胞生物学特性研究
目的 探讨体外联合培养条件下雪旺细胞对成肌细胞生物学特性的影响,为神经化人工肌肉的构建提供理论依据.方法碘酒、酒精消毒后,剥离并获取新生SD乳鼠的臂丛、坐骨神经及小腿三头肌,手术显微镜下彻底剥除其外膜、血管和脂肪,充分剪碎神经和肌肉组织,胰酶、胶原酶混合消化分离,DMEM培养基联合培养雪旺细胞与成肌细胞.倒置相差显微镜观察联合培养状态下两种细胞的形态及生长情况;3HTdR同位素标记掺入及液闪计数,每分钟射线绝对衰变数(DPM)判断雪旺细胞分
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激活态雪旺细胞生长相关蛋白43 mRNA表达的研究
目的分析激活态雪旺细胞较正常雪旺细胞生长相关蛋白43(growth association protein 43,GAP43)的基因表达变化.方法选取10只SD大鼠,将大鼠右上肢正中神经在腋部切断,预变性,1周后取1 cm长正中神经采用双酶消化法获取雪旺细胞并进行激活得到激活态雪旺细胞;取左上肢正常正中神经经双酶消化法获取正常态雪旺细胞作为对照.自雪旺细胞提取mRNA,应用rt-PCR的方法扩增GAP43基因,取PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳,用低浓度的绿色荧光核酸胶染剂染色,测量荧光强度,计算目标基因和内标基因(GAPDH)PCR产物的荧光强度比值,以配对t检验比较实验组和对照组结果.结果激活态雪旺细胞GAP43 PCR产物荧光强度比值较正常雪旺细胞明显增高,差异有统计学意义(P=0.003).表明激活态雪旺细胞较对照组正常雪旺细胞GAP43 mRNA表达明显增多.结论激活态雪旺细胞GAP43的基因表达较正常雪旺细胞增强,这可能是其促进神经再生的重要机制.
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乳鼠预损伤周围神经雪旺细胞的培养及增殖能力研究
目的:从乳鼠预损伤的坐骨神经中分离培养雪旺细胞.方法:预损伤SD乳鼠坐骨神经,3 d后取损伤的坐骨神经,手术显微镜下分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养后对细胞进行计数、MTT活性检测,并用S-100蛋白标记观察.结果:该方法所培养的雪旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛.结论:此实验为神经组织工程研究中雪旺细胞的来源提供了一个有效的方法.
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大鼠坐骨神经再生过程中许旺氏细胞的自噬作用
背景 :Wallerian变性时髓鞘溃变碎片的清除对于神经的再生至关重要 ,但溃变碎片的清除机制一直没有彻底阐明 ,关于参与清除的细胞成分类型仍有很大争议. 目的 :探讨大鼠坐骨神经再生过程中许旺氏细胞的自噬作用. 设计 :完全随机自身对照研究. 地点和对象 :本实验由第一军医大学解剖教研室、汕头大学医学院中心实验室和西南大学达拉斯医学中心精神病学部共同完成 ,研究对象为成年 Wistar大鼠 30只 ,雌雄各半 ,体质量 180- 250 g. 干预 :横切大鼠坐骨神经制作 Wallerian变性模型 ,分别于造模后 0,0.5,1,1.5,2,3,4,5,7,10,15 d取远断端组织行电镜观察. 主要观察指标 :电镜观察轴突和髓鞘的超微结构 ,Gomori染色后检查酸性磷酸酶活性. 结果 :轴突在第 0.5天时从髓鞘脱离,溃变呈空泡状.第 2天开始髓鞘皱褶、断裂形成碎片,许旺氏细胞内见大的膜结合髓鞘碎片和许多散在小碎片,并与溶酶体融合形成自噬泡,呈酸性磷酸酶 (AcPase)阳性.第 4天时内膜区偶见幼稚细胞 ,1周后见大量幼稚细胞.第 7天后许旺氏细胞内自噬泡数量开始减少.实验全程偶见巨噬细胞 ,内有吞噬泡. 结论 :大鼠坐骨神经再生过程中溃变髓鞘主要经许旺氏细胞自噬清除,许旺氏细胞脱分化为许旺氏细胞祖细胞后大量增殖分化参与神经再生过程.
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陈旧性神经损伤后雪旺细胞的变化实验研究
目的观察大鼠坐骨神经损伤后雪旺细胞的变化.方法切断成年SD大鼠右侧坐骨神经,形成10mm缺损.于术后1～12个月不同时间段取材.标本用p75受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)、S-100免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察,另部分标本进行超微结构观察.结果神经损伤后1个月,损伤远端神经中p75NTR和S-100的表达多,在损伤后6个月时p75NTR降至正常水平,S-100则在损伤后9个月时消失.电镜下,雪旺细胞出现在神经内膜管内,神经内膜管下及内膜管周围有大量胶原原纤维增生.结论大鼠坐骨神经损伤后,雪旺细胞中p75NTR的表达增加,但随损伤时间的延长呈进行性下降,伤后6个月时消失.
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巨噬细胞对体外培养的雪旺细胞及背根神经节感觉神经元作用的实验研究
目的通过巨噬细胞、雪旺细胞及感觉神经元的联合培养,了解雪旺细胞的活性及感觉神经元的存活.方法 (1) 取乳鼠坐骨神经进行雪旺细胞的分散培养,24 h后在腹腔中取巨噬细胞并用分隔培养皿进行联合培养.(2) 联合培养后24 h、48 h、72 h,采用RT-PCR法,半定量分析雪旺细胞NGFmRNA含量的变化.(3) 将巨噬细胞和雪旺细胞的联合培养基加入至乳鼠背根神经节感觉神经感觉神经元体外培养中,培养48 h后观察神经元的生长情况,用MTT法测定神经元的活性.结果单纯雪旺细胞培养中存在NGFmRNA但表达量较低,加入巨噬细胞后NGFmRNA表达量显著升高.联合培养条件培养基可明显促进体外培养的体外培养中感觉神经感觉神经元的存活.结论巨噬细胞可改变雪旺细胞的活性,联合培养条件培养基对感觉神经感觉神经元有明显的营养作用.
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FK506促进乳鼠雪旺细胞增殖的实验研究
目的观察FK506对体外培养的乳鼠雪旺细胞增殖的影响.方法将纯化的雪旺细胞分两组,一组设为对照,另一种加含终浓度为0.5ng/ml FK506的DMEM/F12培养液培养,用MTT法检测不同时间点的OD值并绘制生长曲线,另在培养第48、72小时后用3H-胸腺嘧啶核甙测定法检测其DPM值.结果经含0.5ng/mlFK506培养液培养的雪旺细胞,其对数生长期提前出现,并且在峰值上高于对照组;接种后48h和72h,3H-胸腺嘧啶核甙检测DPM值实验组也高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 FK506有促进雪旺细胞分裂增殖的作用,可能是其促进周围神经再生的重要机制之一.
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几丁糖胶原复合膜及激活态雪旺细胞修复周围神经缺损的实验研究
目的研究几丁糖胶原复合膜、激活态雪旺细胞(activated Schwann cell,ASC)促进周围神经再生的作用.方法将激活态雪旺细胞培养于几丁糖胶原复合膜后,将膜缝制成导管修复大鼠坐骨神经10mm的缺损(D组);并以自体神经移植(A组)、几丁糖胶原复合膜管(B组)及几丁糖胶原复合膜加脑源性神经营养因子[(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)C组]为对照.术后4、8、12周观察肢体运动,复合肌肉动作电位(CMAP)的波幅、潜伏期和运动神经传导速度(MNCV).术后12周取材,样本染色观察神经轴突再生情况.结果几丁糖胶原复合膜加激活态雪旺细胞修复10mm神经缺损的效果优于几丁糖胶原复合膜加BDNF,与自体神经相似.结论几丁糖胶原复合膜加激活态雪旺细胞能有效地促进周围神经再生.
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ATP激活雪旺细胞内游离Ca2+浓度机制的实验研究
目的探讨细胞外ATP引起的细胞内游离Ca2+浓度升高的机制.方法根据细胞内游离Ca2+的来源,分别在加入细胞外ATP的雪旺细胞的培养基中加入P2Y受体阻滞剂苏拉明和Ca2+通道阻滞剂异博定作为实验组;同时,以仅加入细胞外ATP的雪旺细胞的培养基作为对照组.实验组和对照组均使用Fura-2染色剂进行染色.结果使用P2Y受体阻滞剂苏拉明的雪旺细胞的光反射强度减弱;而使用Ca2+通道阻滞剂异博定的雪旺细胞的光反射强度基本不变.结论细胞外ATP可能是通过P2Y受体介导激活磷脂酶C引起细胞内IP3增加,使Ca2+自储库中释放,导致细胞内游离Ca2+浓度升高.
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胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的雪旺细胞对大鼠坐骨神经缺损的修复作用
目的研究胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derives neur otrophic factor,GDNF)基因对周围神经断伤后促进轴突再生及神经元的保护作用.方法应用体 外获取的GDNF修饰的雪旺细胞结合细胞外基质凝胶及生物可降解聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物 管(polyCDL-lactide-co-glycolide,PLGA)构建的神经移植复合体,修复大鼠坐骨神经 的缺损.20只成年Wistar大鼠按桥接物的不同随机分为4组,每组5只.A组:细胞外基质凝 胶-PLGA管桥接组;B组:雪旺细胞-细胞外基质凝胶-PLGA管桥接组;C组:GDNF基因修饰 的雪旺细胞-细胞外基质凝胶-PLGA管桥接组;D组:自体神经桥接组.术后12周检测运动 神经传导速度,并进行再生神经的组织形态学观察以及计量学分析.结果术后12周,坐骨神经的 运动神经传导速度,轴突数、髓鞘的厚度、神经纤维的直径、神经组织面积的百分比和脊髓 前角运动神经元存活率等,C组均优于A、B组(P＜0.01),而与D组相比无明显差异(P ＞0.05).结论雪旺细胞的转基因处理可能弥补单纯细胞移植神经营养因子含量的不足,而达到与自体神经移植相似的效果.
关键词： 坐骨神经 许旺氏细胞 基因 神经再生 胶质细胞源性神经营养因子 -
脑源性神经营养因子在激活态雪旺细胞中表达的初步实验研究
目的分析激活态雪旺细胞的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)表达及其对神经再生的作用.方法选用20只SD大鼠,将大鼠右侧正中神经及尺神经在腋部切断进行激活(实验组),左侧的正常神经为(对照组).采用双酶消化法获取雪旺细胞并进行激活后提取mRNA,应用RT-PCR的方法比较BDNFmRNA的变化.结果激活态雪旺细胞BDNFmRNA表达比对照组明显增多.结论激活态雪旺细胞分泌神经营养因子BDNF增多,具有促进神经再生的作用.
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激活态雪旺细胞在细胞培养下的生长规律
目的了解激活态雪旺细胞在细胞培养下的生长规律.方法应用改良的雪旺细胞培养法体外培养激活态雪旺细胞,通过激活态雪旺细胞在各生长点(3 d,5 d,7 d,9 d,11 d,13 d)的计数,绘制激活态雪旺细胞的生长曲线.作Lowry 蛋白测定,H3-胸腺嘧啶核甙测定,了解激活态雪旺细胞在细胞培养下的生长情况.结果每个时间段检测激活态雪旺细胞的生长繁殖能力,Lowry蛋白含量,H3-胸腺嘧啶核甙的含量,均数倍于正常态的雪旺细胞;两者差异均有非常显著性意义(t =22.3、67.1、72.4,P < 0.001). 结论激活态雪旺细胞在细胞培养下具有旺盛的生长繁殖能力.
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修饰后的聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物支架与人胚雪旺细胞联合培养的实验研究
目的探索人体组织工程神经构建的方法.方法应用鼠尾胶和层粘蛋白包埋纤维状的聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物支架与人胚雪旺细胞培养2周.观察细胞在支架上的吸附迁移和生长情况.结果人雪旺细胞能在共聚物纤维上迁移包裹,雪旺细胞均匀分布于以鼠尾胶和层粘蛋白共同包埋后的纤维之间及吸附在纤维表面,且基质分泌旺盛.结论人胚雪旺细胞在修饰后的polyglytin 纤维上得到大量扩增,形成的三维立体结构具有人工神经的基本特性.
