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滋补脾阴方药含药血清对内质网应激致神经元凋亡的影响
目的 运用中药血清药理学方法研究滋补脾阴方药含药血清对内质网应激致神经元凋亡作用及其机制.方法 实验中体内实验于辽宁省SPF动物重点实验室完成,体外实验于辽宁省脑疾病研究重点实验室完成.SPF级健康雄性SD大鼠(220～250 g)12只,随机分为对照组和滋补脾阴方药(ZBPYR)组,每组6只,制备空白及ZBPYR含药血清.以N-糖链抑制剂农霉素(tunicamycin,Tm,5压计μml)刺激小鼠神经瘤母细胞(Neuro2a)建立内质网应激模型,各浓度滋补脾阴方药含药血清(5%,10%,15%)为干预组,空白血清组为对照组,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法观察Neuro2a细胞牛存率;流式细胞技术观察Neuro2a细胞凋亡;蛋白质免疫印迹(Western blotting)法观察葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、凋亡促进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的蛋白表达.统计结果行SNK-q检验.结果 各浓度ZBPYR含药血清预处理组(生存率:5%0.5295±0.0373,10%0.5843±0.0428,15%0.6274±0.0324;凋亡率:5%47.8733±2.8166,10%46.3366±1.2748,15%39.8833±1.0524)与Tm组(牛存率:0.1673±0.0213;凋亡率:62.7050±1.4056)相比,细胞牛存率明显升高(P<0.05);细胞凋亡率显著降低(P<0.05);各浓度ZBPYR含药血清预处理组GRP 78(5%2.1228±0.2251,10%1.3293±0.9443.15%;15%0.0931±0.1168)及CHOP(5%1.1776±0.2927,10%0.7290±0.1708,15%0.6577±0.1883)蛋白表达与Tm组(GRP 78 2.9149±0.5355;CHOP 1.6611±0.2913)相比,表达水平明显下调(P<0.05).结论 ZBPYR能提高Tm刺激后的Neuro2a细胞生存率,抑制细胞凋亡,具有神经保护作用,其机制可能是减轻内质网应激及抑制内质网应激凋亡通路.
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噪声应激对大鼠心肌葡萄糖调节蛋白78和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白表达的影响与高血压及心肌重构的关系
目的 研究内质网应激相关因子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)在噪声应激环境高血压大鼠模型心肌中的表达,并探讨GRP78和CHOP变化与高血压及其心肌重构的关系.方法 将成年雄性Sprague-Dawly(SD)大鼠40只随机分为两组:噪声组(采用噪声环境建立高血压模型)和对照组(不予任何刺激正常喂养),每组20只.按应激时间不同,噪声组和对照组又分为2、4、6、8周4个亚组,每组5只大鼠.颈动脉插管测定各组大鼠的平均动脉压(MAP).超声检测室间隔厚度(IVST)、左心室后壁厚度(LVPWT)、射血分数及E/A.称取体质量及左心室质量,计算左心室质量指数(LVMI).LVMI=左心室质量/体质量.免疫组化法检测大鼠心肌GRP78及CHOP蛋白表达,Western-blot法检测大鼠心肌GRP78及CHOP蛋白含量,TUNNEL法检测心肌细胞凋亡情况.结果 ①随应激时间延长,噪声组大鼠MAP逐渐升高,均明显高于对照组(P＜0.01)；②噪声各亚组的IVST、LVPWT及LVMI随时间的延长逐渐增大,其中4、6及8周亚组的IVST较相应对照组分别增大29％、33％及38％,LVPWT分别增大29％、29％及33％,LVMI分别增高23％、30％和26％(P＜0.05)；噪声组的E/A及射血分数分别从2周及6周起逐渐下降；③随着应激时间的延长,噪声组大鼠心肌GRP78蛋白含量逐渐增高,4周达高值,此后逐渐下降；CHOP蛋白表达水平逐渐增高,与相应对照组相比较,差异有统计学意义(P＜0.01).噪声组的心肌细胞凋亡率增加.结论噪声应激可以引起心肌细胞内质网应激,导致GRP78和CHOP二者呈不对称性表达,促使心肌细胞凋亡逐渐增加,引起心肌细胞的损害,参与大鼠高血压及心肌重构的过程.
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SP600125抑制JNK信号通路对高血压全脑缺血模型大鼠海马区CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白表达的影响
目的 观察抑制JNK信号通路对高血压全脑缺血模型大鼠海马区CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达的影响.方法 100只雄性自发性高血压大鼠(SHR)分为高血压假手术(SHR+SO)组、高血压全脑缺血再灌注组(SHR+I/R)和高血压全脑缺血再灌注+JNK特异性抑制剂SP600125干预组(SP600125干预组).另取63只雄性WKY大鼠随机分为血压正常假手术(SO)组和血压正常全脑缺血再灌注(I/R)组；改良的Pulsineli 4血管阻断(4-VO)法制作全脑缺血再灌注模型.分别在术后6、24、48 h取脑组织,应用HE染色观察海马区神经细胞形态变化；免疫组织化学法和免疫印迹法检测海马区CHOP和磷酸化JNK的表达.结果 与SHR+SO组比较,SHR+ I/R组各时间点存活神经元密度降低[24 h存活神经元密度(10.68±2.18)比(25.20±4.36)/μm2];CHOP阳性细胞数量及表达增高,24 h达高峰；磷酸化JNK阳性细胞数量及表达增高,48 h达高峰(均P＜0.05)；与I/R组比较,SHR+I/R组各时间点海马区神经元细胞存活密度降低[24 h:(10.68±2.18)比(17.81±4.36)/μm2];6、24 h CHOP阳性细胞数量及表达增高,48 h减少；各时间点磷酸化JNK阳性细胞数量及表达增高；与SHR+I/R组比较,SP600125干预组中各时间点存活神经元密度增加、CHOP和磷酸化JNK阳性细胞数量及表达减少.结论 高血压可增加脑缺血再灌注后磷酸化JNK、CHOP表达增加,抑制JNK信号通路可下调高血压全脑缺血大鼠海马区CHOP表达.
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AT1受体自身抗体对糖尿病肾病大鼠肾脏内质网应激通路相关分子葡萄糖调节蛋白78和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白表达的影响
目的 探讨AT1受体自身抗体(AT1-AA)对DN大鼠肾脏内质网应激(ERS)通路相关分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达的影响. 方法 制备DN大鼠模型,ELISA检测血清AT1-AA,根据ELISA结果随机选择AT1-AA阳性和阴性DN大鼠纳入DN组(n=12),同时设立正常对照组(NC,n=6).电镜观察肾脏超微结构变化;TUNEL法检测肾脏细胞凋亡;RT-PCR测定大鼠肾组织GRP78和CHOP mRNA水平;Western blot分析肾组织中GRP78和CHOP蛋白的表达量. 结果 DN组肾脏细胞凋亡率较NC组升高,其中,AT1-AA阳性大鼠凋亡率高于AT1-AA阴性大鼠[(20.05±1.71)％vs(13.24±4.93)％](P＜0.01).与NC组相比,DN组肾组织GRP78、CHOP蛋白和mRNA水平均上调;进一步比较发现,AT1-AA阳性DN大鼠GRP78,CHOP蛋白及mRNA水平升高较AT1-AA阴性DN大鼠更明显. 结论 AT1-AA可能通过诱导DN大鼠肾脏ERS反应,并经ERS相关的CHOP凋亡信号通路而促进肾脏细胞凋亡,加重肾脏损害.
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二至丸对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的防护作用及机制
目的 研究二至丸对四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝损伤的预防作用及潜在机制.方法 雄性昆明种小鼠每天1次ig给予二至丸1.4,2.8和5.6 g·kg-1,连续14 d,末次给药8 h后,模型组和二至丸组小鼠ip给予10％CCl4溶液10 mL·kg-1,24 h后处死小鼠,计算肝和脾指数.采用生化法测定血清谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性及丙二醛(MDA)的含量;HE染色观察肝组织病理改变;TUNEL法观察肝细胞凋亡;免疫组化法和Western蛋白质印迹法检测内质网应激(ERS)标志性蛋白CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和葡糖调节蛋白78(GRP78)表达.结果 与正常对照组相比,模型组小鼠血清中GPT和GOT活性及MDA含量显著升高(P<0.01),SOD和GPX活性显著下降(P<0.01);肝组织出现明显的炎症细胞浸润和坏死,肝指数明显增加(P<0.01),脾指数显著减小(P<0.01);CHOP和GRP78表达水平显著上调(P<0.01).与模型组相比,二至丸各剂量组血清GPT和GOT的活性及MDA含量显著降低(P<0.05,P<0.01),SOD和GPX活性显著升高(P<0.05,P<0.01);HE染色结果显示,二至丸各剂量组均不同程度地减轻肝组织脂肪空泡和炎症细胞浸润;二至丸2.8和5.6 g·kg-1组小鼠肝指数显著减小,脾指数显著增加(P<0.05);TUNEL检测结果显示,二至丸各剂量组肝细胞凋亡率明显下降(P<0.05,P<0.01),并呈剂量依赖性(r=0.99,P<0.01);免疫组化及Western蛋白质印迹结果显示,二至丸1.4,2.8和5.6 g·kg-1组CHOP表达显著下降(P<0.01),并呈剂量依赖性(r=0.89,P<0.05),2.8和5.6 g·kg-1组GRP78表达显著下降(P<0.01).结论 二至丸对CCl4致小鼠急性肝损伤具有预防保护作用,其机制可能与抗氧化应激,抑制ERS,从而抑制肝细胞凋亡有关.
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CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白与钙联蛋白在内侧颞叶癫痫模型小鼠海马中的表达
目的 观察CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及钙联蛋白(CNX)在内侧颞叶癫痫小鼠海马区域中表达的时间和空间分布.方法 采用海人酸(KA)诱导内侧颞叶癫痫小鼠模型,免疫印迹和免疫荧光技术检测CHOP和CNX在急性期(12、24 h)小鼠海马CA3区的表达量及分布差异,并与注射PBS的正常小鼠进行对照.结果 免疫印迹检测结果显示,KA注射后12h小鼠海马中的CHOP (F=1.136,P=0.4069)和CNX表达量(F=2.378,P=0.2087)与对照组差异没有统计学意义,KA注射后24h注射侧海马中的CHOP (F=8.510,P=0.0362)和CNX表达量(F=6.968,P=0.0497)明显高于对照组.免疫荧光结果显示,KA注射后12 h CHOP的表达主要集中于CA3区,注射后24h在CA1和CA3区表达水平均升高;KA注射后24 h CHOP蛋白(F =24.480,P=0.0057)和CNX蛋白(F=7.149,P=0.0478)的表达量显著高于对照组.结论 伴随着癫痫发作的产生,CHOP蛋白表达量上升,提示神经元内质网应激水平不断增加,可能需要更多CNX作为分子伴侣帮助更多未折叠蛋白完成折叠过程.
关键词： 内侧颞叶癫痫 内质网应激 CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白 钙联蛋白 -
电针对帕金森病模型大鼠黑质内Bip、CHOP蛋白表达的影响
目的 观察电针对鱼藤酮诱导的帕金森病(PD)模型大鼠黑质内质网应激相关蛋白表达的影响.方法 将120只健康雄性SD大鼠随机分正常组、假手术组、模型组、电针预治疗组、电针治疗7 d组、电针治疗14 d组、电针治疗21 d组、电针治疗28 d组,每组15只,采用颈背部皮下注射鱼藤酮法制备PD模型,假手术组只注射不含鱼藤酮的等量葵花油乳化液.正常组、假手术组、模型组不做任何治疗;电针治疗组在造模完成后选取风府、太冲穴给予电针治疗;电针预治疗组电针治疗7 d后再造模.运用免疫组化法检测大鼠黑质内TH、α-syn的阳性表达,并用Western blot法检测大鼠中脑黑质区内Bip、CHOP蛋白表达的变化.结果 模型组大鼠表现出明显的PD症候群特征,电针干预后大鼠行为学评分明显降低(P<0.01);与正常组和假手术组相比,模型组大鼠黑质区α-syn的阳性表达与Bip、CHOP蛋白的表达均显著提高,大鼠黑质区TH的阳性表达均显著降低(P<0.01);与模型组相比,电针治疗各组大鼠黑质区α-syn的阳性表达以及Bip、CHOP蛋白的表达均显著降低(P<0.01),大鼠黑质区TH的阳性表达显著提高(P<0.01).结论 电针防治PD的机制可能与电针能明显抑制内质网应激相关蛋白的表达,保护多巴胺能神经元有关.
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鞘内注射丹参酮ⅡA对坐骨神经慢性压迫性痛大鼠脊髓背角CHOP的影响
目的:研究丹参酮ⅡA对坐骨神经慢性压迫性痛大鼠脊髓背角CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和caspase-3表达的影响,探讨丹参酮ⅡA的镇痛机制.方法:SD雄性大鼠随机分为假手术组和模型组.模型组又分为生理盐水组和处理组,分别在手术当日及术后每日鞘内注射生理盐水0.1 ml和丹参酮ⅡA 20 mg/kg,连续注射14 d.检测各组大鼠在手术前及术后14d的机械痛阈和热痛阈;术后第14天,免疫荧光组织化学检测大鼠脊髓背角内CHOP和caspase-3的表达.结果:与假手术组比较,生理盐水组大鼠的机械痛阈和热痛阈降低,CHOP和caspase-3的表达增多;与生理盐水组比较,处理组的机械痛阈和热痛阈升高,脊髓背角内CHOP和caspase-3的表达下降,差异均有统计学意义.结论:鞘内注射丹参酮ⅡA对坐骨神经慢性压迫性痛模型大鼠的镇痛作用可能与降低脊髓背角内CHOP的表达有关.
关键词： 丹参酮ⅡA 鞘内注射 脊髓背角 CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白 -
妊娠期糖尿病胎盘滋养细胞内质网应激特征性分子GRP78和内质网凋亡因子CHOP的表达
目的:探讨胎盘滋养细胞内质网超微结构变化及内质网应激特征性分子——内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)和内质网凋亡因子——CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)mRNA表达与妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)的关系.方法:2014年1月-2015年12月于南通大学第二附属医院产检至分娩的35例妊娠期糖尿病孕妇为GDM组,同期产检的30例正常孕妇为对照组,透视电镜观察两组孕妇的胎盘滋养细胞内质网超微结构,并采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术检测胎盘滋养细胞中GRP78和CHOP mRNA的表达.结果:(1)GDM组滋养细胞内质网脱颗粒,明显扩张,甚至部分融合;对照组胎盘滋养细胞内含有丰富的内质网,形态规整,无肿胀及扩张.(2)GDM组胎盘滋养细胞中GRP78 mRNA的相对表达水平为4.70±1.35,显著高于对照组(2.54±0.85)(P＜0.01).(3)GDM组胎盘滋养细胞中CHOP mRNA的相对表达水平为5.71±1.37,显著高于对照组(3.13±1.80)(P＜0.01).结论:GDM孕妇的胎盘滋养细胞内质网有明显的扩张及肿胀性改变;胎盘组织中GRP78及CHOP的mRNA表达水平比正常孕妇明显升高.提示内质网相关的CHOP凋亡途径与GDM密切相关.
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妊娠期糖尿病产妇胎盘组织内质网应激状态及其对胎盘组织形态学的影响
目的：观察妊娠期糖尿病（ GDM）产妇胎盘组织内质网应激（ ERS）发生情况并探讨其对胎盘组织形态学的影响。方法 GDM产妇（GDM组）和健康产妇（对照组）各30例，分娩时收集胎盘组织，Western blot 法检测胎盘组织中的磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶（ p-PERK ）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（ CHOP ）。 HE染色对胎盘组织行病理学观察。结果 GDM组p-PERK、CHOP相对表达量均高于对照组（ P均＜0．05）。病理检查显示， GDM组胎盘组织出现绒毛成熟不良、干绒毛小动脉管壁增厚及管腔狭窄、合体细胞结节增多、绒毛间质内毛细血管过度充盈、细胞滋养叶细胞及血管合体膜形成增加的例数高于对照组（P均＜0．05）。 GDM组胎盘组织中p-PERK、CHOP表达与胎盘组织异常形态学改变呈正相关关系（r分别为0．359、0．366，P均＜0．05）。结论 GDM产妇胎盘组织呈ERS状态，其与产妇胎盘组织异常形态学改变有关。
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阿奇霉素对新生大鼠高氧肺损伤的防治作用及其机制
目的 观察阿奇霉素对新生大鼠高氧肺损伤的防治作用,并探讨其机制.方法 选用2d龄新生Wistar大鼠90只,随机分为对照组、模型组、实验组,每组30只.模型组和实验组大鼠暴露在高氧模型箱内制作高氧肺损伤模型,实验组大鼠同时腹腔注射阿奇霉素200 mg/(kg·d),连用14 d.各组分别于建模3、7、14 d各处死10只大鼠,测定肺组织湿/干重比(W/D),收集支气管肺泡灌洗液(BALF)测定白细胞总数,观察肺组织病理变化,采用Western blotting法检测肺组织中的Bcl-2蛋白、Bax蛋白、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和葡萄糖调节蛋白78 (GRP78).结果 模型组建模3、7、14 d时肺组织W/D高于对照组和实验组(P均＜0.05).模型组建模3、7、14 d时BALF中白细胞总数高于对照组和实验组(P均＜0.05).对照组建模3、7、14 d时肺泡结构无明显改变,无间质水肿,见少许炎症细胞;模型组随建模时间延长,肺组织损伤加重;实验组建模后不同时间肺水肿程度、炎症细胞量、肺泡体积等均较模型组明显减轻.模型组建模3、7、14 d时肺组织中Bax蛋白相对表达量高于对照组和实验组,Bcl-2蛋白相对表达量低于对照组和实验组,Bcl-2/Bax低于对照组和实验组,CHOP、GRP78相对表达量高于对照组和实验组(P均＜0.05).结论 阿奇霉素可防治新生大鼠高氧肺损伤,这种作用可能与减少肺组织细胞凋亡及下调CHOP、GRP78表达有关.
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PPARα激活保护小鼠急性肝衰竭对CHOP的调节作用研究
目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)激活对小鼠急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)肝损伤保护过程中对内质网应激凋亡蛋白标志物CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)信号分子的影响.方法 以C57BL/6小鼠为研究对象,腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GalN)联合脂多糖(LPS)建立小鼠ALF模型.PPARα激活剂Wy-14643及siRNA分别对ALF小鼠模型进行干预,检测小鼠肝脏病理改变、血清转氨酶ALT、AST评价肝脏功能,免疫印迹、实时荧光定量PCR及免疫荧光方法检测CHOP的基因及蛋白表达水平.结果 D-GalN/LPS诱导ALF小鼠中,肝损伤程度及转氨酶水平随着时间延长逐渐加重,PPARα水平下降,CHOP水平上升.Wy-14643干预降低肝组织CHOP的表达水平,PPARαsiRNA干预增加肝组织CHOP的表达水平.结论 ALF肝损伤过程中,PPARα可通过调节CHOP参与内质网应激诱导的肝细胞凋亡,PPARα-CHOP信号通路可能是ALF致病分子机制之一.
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内质网应激相关因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白及Caspase-12在癫(癎)性脑损伤大鼠中的表达及促红细胞生成素对其影响
目的 在建立氯化锂-毛果芸香碱癫(痫)持续状态模型的基础上,观察内质网应激相关因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和Caspase-12的表达变化,探讨促红细胞生成素(EPO)产生脑保护作用的可能机制.方法 21 ～30 d SD大鼠96只随机分为对照组(n=32)、氯化锂-毛果芸香碱癫(癎)组(n=32)及EPO干预组(n=32),每组按6h、24 h、48 h、72 h时间点又分为4个亚组,每亚组8只.观察各组大鼠的行为学变化,用免疫组织化学法检测各时间点各组大鼠CHOP及Caspase-12的表达水平.结果 氯化锂-毛果芸香碱癫(痫)组大鼠海马区CHOP的表达水平明显增加,6h开始增加,24h达到高峰,后逐渐下降,至72 h仍高于对照组,与对照组同一时间点比较差异均有统计学意义(Pa＜0.05)；氯化锂-毛果芸香碱癫(痫)组大鼠海马区Caspase-12的表达水平在6h开始增加,48 h达到高峰,72 h开始下降,但仍高于对照组,与对照组同一时间点比较差异均有统计学意义(Pa＜0.05).EPO干预组海马区CHOP及Caspase-12的表达较同一时间点氯化锂-毛果芸香碱癫(癎)组均下降,差异有统计学意义(Pa＜0.05).结论 CHOP和Capase - 12在癫(癎)发作后表达明显增加,提示内质网应激机制在癫(癎)性脑损伤的发生发展中具有重要作用；EPO可能通过内质网应激机制产生脑保护作用.
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PERK/eIF2a/CHOP信号通路在新生大鼠坏死性小肠结肠炎机制中的作用
目的 建立坏死性小肠结肠炎(NEC)新生大鼠模型,研究肠道组织蛋白激酶受体样内质网激酶/真核翻译起始因子2a/CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(PERK/eIF2a/CHOP)信号通路中PERK、磷酸化PERK(p-PERK)、eIF2a、磷酸化eIF2a(p-eIF2a)、CHOP的动态表达,探讨NEC的发病机制,以期为NEC防治提供理论依据.方法 采用随机数字表法将150只1日龄SD大鼠分为3组.NEC组:配方奶喂养+缺氧+冷刺激+脂多糖灌胃建立NEC模型;Salubrinal(SAL)组:建模同时予SAL(1 mg/kg)腹腔注射;对照组:腹腔注射等量9 g/L盐水.造模0、12、24、48、72 h时,采用随机数字表法每组取10只大鼠处死,取肠道组织,观察肠道形态,行病理学检查,经Western blot检测PERK、p-PERK、eIF2a、p-eIF2a、CHOP蛋白动态表达,采用real-time PCR检测CHOP基因动态表达.结果 对照组无NEC发生,NEC组NEC发生率为90％(9/10只),SAL组NEC发生率为40％(4/10只).NEC组、SAL组p-PERK、p-eIF2a蛋白表达随建模时间延长上调;与对照组相比,NEC组、SAL组p-PERK、p-eIF2a蛋白表达上调(p-PERK:1.528±0.264、1.402±0.233比0.303±0.036;p-eIF2a:0.969±0.076、1.173±0.066比0.209 ±0.045;P ＜0.05);与NEC组相比,SAL组p-eIF2a蛋白表达增高(P＜0.05).NEC组、SAL组CHOP蛋白、mRNA表达均随建模时间延长上调,与对照组相比,NEC组、SAL组CHOP蛋白、mRNA表达上调(CHOP蛋白:1.456±0.223、0.929±0.064比0.165±0.026;CHOP mRNA:0.343±0.035、0.198±0.044比0.017 ±0.010;P ＜0.05);SAL组CHOP蛋白、mRNA表达较NEC组降低(P＜0.05).结论 PERK/eIF2a/CHOP信号通路参与新生大鼠NEC的发生、发展,而SAL可能通过抑制内质网应激信号通路中p-eIF2a去磷酸化、抑制CHOP基因及蛋白的表达而发挥作用.
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内质网应激相关的蛋白激酶R样内质网激酶-转录活化因子4-CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白通路参与支气管肺发育不良大鼠肺细胞凋亡
目的 探讨内质网应激(ERS)相关的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-转录活化因子4(ATF4)-CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)通路在支气管肺发育不良(BPD)大鼠肺细胞凋亡中的作用.方法 将48只新生早产SD大鼠按随机数字表法分为BPD组和对照组.BPD组持续暴露于体积分数为850 mL/L的高体积分数氧(高氧)中,对照组置于空气中.在7 d、14 d和21 d取肺组织,采用DNA断裂的原位末端标记法(TUNEL)检测肺细胞凋亡,实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78) 、PERK 、ATF4和CHOP mRNA表达,Western blot技术检测GRP78、磷酸化PERK (pho-PERK) 、ATF4和CHOP蛋白表达.结果 随高氧暴露时间延长,BPD组大鼠肺细胞凋亡指数(AI)逐渐增加,与同时间点对照组比较差异均有统计学意义(7 d:15.50±0.58比1.25 ±0.50,14 d:27.75±1.71比3.25 ±0.96,21 d:50.50±3.70比4.00±1.15;t =57.00、20.58、25.16,P均＜0.01);GRP78 、PERK 、ATF4和CHOP mRNA表达较同时间点对照组明显上升[GRP78:7 d(33.88 ±3.73)比(11.65±1.00),14 d(54.50 ±2.18)比(12.84±1.41),21d(95.34 ±7.61)比(12.43 ±0.59);PERK:7 d(5.23 ±0.92)比(1.45 ±0.46),14 d(7.60±1.56)比(2.18±0.97),21 d(16.55 ±0.50)比(2.90±1.18);ATF4:7 d(23.04 ±2.45)比(12.56±2.81),14d (28.66 ±2.66)比(15.18 ±2.92),21 d(36.63 ±2.99)比(15.14 ±2.09);CHOP:7 d(2.21 ±0.19)比(0.81 ±0.02),14 d(4.19±0.17)比(0.90±0.08),21 d(6.08 ±0.38)比(0.88±0.10);P均＜0.05;GRP78 、pho-PERK 、ATF4和CHOP蛋白表达较对照组亦明显增高[GRP78:7 d(1.33±0.03)比(0.85±0.04),14 d(1.31 ±0.02)比(0.92 ±0.01),21 d(1.82 ±0.28)比(0.87 ±0.01);pho-PERK:7 d(0.68 ±0.02)比(0.54 ±0.01),14 d(1.04±0.01)比(0.65±0.01),21 d(1.29 ±0.02)比(0.73±0.01);ATF4:7 d(1.26±0.01)比(0.83±0.01),14 d(1.39±0.02)比(0.87 ±0.02),21 d(1.67 ±0.02)比(0.94 ±0.02);CHOP:7 d(1.37 ±0.01)比(0.47 ±0.06),14 d(1.50 ±0.04)比(0.74±0.05),21 d(1.61 ±0.03)比(0.55±0.02);P均＜0.05]. BPD组大鼠肺组织CHOP蛋白表达与AI、PERK及ATF4均呈显著正相关(r=0.87 、0.92 、0.93,P均＜0.05).结论 CHOP介导的细胞凋亡参与BPD发生发展,其机制可能与ERS相关的PERK-ATF4-CHOP通路激活有关.
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姜黄素对大鼠体外循环所致急性肺损伤中细胞凋亡及CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白的影响
目的 观察姜黄素(Cur)对大鼠体外循环(CPB)所致急性肺损伤(ALI)中细胞凋亡及CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的影响.方法 Sprague-Dawley (SD)大鼠60只,按照随机数字表法分为6组(n=10):假手术组(Sham组)、CPB组、Cur剂量分别为50、100、150及200 mg/kg组(Cur-50、Cur-100、Cur-150、Cur-200组).实验结束后留取大鼠左肺,测定肺湿干/重比(W/D)和总肺水含量(TLW),光镜下观察肺组织形态学改变和进行肺组织损伤定量评估(IQA),电镜观察肺组织超微结构改变,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Westem blot法分别检测CHOPmRNA及蛋白表达,原位末端细胞凋亡检测法(TUNEL法)检测肺组织细胞凋亡指数(AI).结果 与Sham组比较,CPB组中CHOP mRNA(0.96±0.18比0.43±0.08)及蛋白(2.79±0.74比1.02±0.27)表达均升高(P＜0.05),W/D(4.99±0.72比2.32 ±0.49)、TLW(3.99±0.72比1.32±0.49)、IQA(40.22±5.39比4.71±1.68)和AI(35.19±5.94比2.89±0.99)均增加(P＜0.05),肺组织形态学结构及超微结构均呈明显损伤性变化;与CPB组比较,Cur-100组、Cur-150组和Cur-200组CHOP mRNA(0.87±0.18、0.69 ±0.13、0.56±0.12比0.96±0.18)及蛋白(2.88±0.79、1.96±0.58、1.34±0.49比2.79±0.74)表达均降低(P＜0.05),W/D (4.13±0.89、3.43±0.97、2.65±0.85比4.99 ±0.72)、TLW (3.13 ±0.89、2.43±O.97、1.65±0.85比3.99 ±0.72)、IQA (31.47±3.48、20.52±2.69、14.99±3.56比40.22±5.39)和AI(31.49±2.91、24.78±3.41、14.47 ±2.69比35.19±5.94)亦均下降(P＜0.05),肺组织形态学结构及超微结构异常改变均有不同程度的减轻.结论 浓度为200 mg/kg的Cur对CPB损伤发生的大鼠肺脏具有较好的保护作用,其机制可能与其抑制CHOP诱导的细胞凋亡有关.
关键词： 姜黄素 CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白 脱噬作用 急性肺损伤 体外循环 -
CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白介导的内质网应激在丝裂霉素C诱导人成纤维细胞凋亡中的作用
目的 观察CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)同源蛋白(CHOP)在丝裂霉素C(MMC)诱导人硬膜外瘢痕成纤维细胞凋亡中的作用.方法 体外培养的人硬膜外瘢痕成纤维细胞用不同浓度的MMC(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/L)处理5 min,培养不同时间(0、12、24、48、60、72 h)后用噻唑蓝(MTT)比色法检测MMC对细胞活力的影响,原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测MMC(0.4 g/L)对细胞凋亡的影响.Western blot分析CHOP、B淋巴细胞/白血病-2(bcl-2)相关X蛋白(bax)、bcl-2蛋白表达变化.使用RNA干扰技术敲除CHOP,观察CHOP敲除后MMC对细胞活力、细胞凋亡和相关蛋白的影响.结果 MMC抑制成纤维细胞的细胞活力,且呈明显的时间和计量依赖性,半数有效剂量(ED50)为0.4 g/L.0.4g/L MMC处理组细胞凋亡率[(40.0±5.2)％]明显增加,与对照组[(3.5±1.8)％]比较差异有统计学意义(p＜0.05).Western blot显示随着作用时间延长CHOP表达逐渐升高,bcl-2的表达逐渐减少.与对照组比较,CHOP敲除后MMC对细胞活力抑制率明显降低,细胞凋亡率也明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05);bcl-2表达水平有所升高.结论 CHOP介导的内质网应激凋亡通路参与MMC诱导的人成纤维细胞凋亡,CHOP在MMC诱导的成纤维细胞凋亡中起重要作用.
关键词： 成纤维细胞 丝裂霉素C 脱噬作用 CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白 -
靶向小干扰RNA对小鼠肺缺血/再灌注损伤时细胞凋亡及CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白的作用
目的 观察靶向小干扰RNA (siRNA)对小鼠肺缺血/再灌注损伤(PIRI)时细胞凋亡及CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的影响.方法 荧光标记法观察靶向siRNA在小鼠体内的分布并评估转染效率.C57BL/6J小鼠50只,随机分为5组(n=10):假手术组(Sham组)、缺血/再灌注组(I/R组)、I/R+载体组(VR+ Vehicle组)、I/R+阴性对照组(I/R+ Control-siRNA组)和I/R+ CHOP-siRNA组(I/R+ CHOP-siRNA组).取左肺,检测肺湿/干重比(W/D)、总肺水含量(TLW)和肺泡损伤定量评估(IQA),光镜和电镜观察肺组织结构改变,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测CHOP、葡萄糖调节蛋白78 (GRP78) mRNA和蛋白表达水平,原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测细胞凋亡指数(AI).结果 靶向siRNA通过滴鼻法可有效分布于肺脏中.与Sham组比较,I/R组中CHOP、GRP78 mRNA和蛋白表达水平(0.80±0.03、0.80±0.02;0.80±0.04、0.84±0.02)均升高(P ＜0.05),W/D(5.24±0.49)、TLW(4.24 ±0.49)、IQA[(42.80 ±4.21)％]和AI[(34.50±1.51)％]均明显增加(P＜0.01)；肺组织形态结构发生明显损伤；与I/R+ Vehicle组和I/R+ Control-siRNA组比较,I/R+ CHOP-siRNA组中GRP78 mRNA和蛋白表达水平(0.84±0.04、0.85±0.04)无明显变化(P＞0.05),而CHOP mRNA和蛋白表达水平(0.40±0.03、0.44±0.04)均降低(P＜0.05),W/D(2.54±0.24)、TLW(1.54±0.24)、IQA[(16.71±2.33)％]和AI[(11.50±1.58)％]亦均降低(P＜0.01)；肺组织形态结构损伤减轻.结论 靶向siRNA对I/R损伤肺具有良好的保护作用,其机制可能与其对抗过度的未折叠蛋白反应(UPR)中CHOP介导的细胞凋亡有关.
关键词： CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白 肺缺血 再灌注损伤 小干扰RNA 脱噬作用 -
多聚鸟苷酸干预大鼠矽肺纤维化的内质网应激作用机制
目的 探讨肌醇需求激酶1(IRE1)介导的内质网应激(ERS)细胞凋亡途径在多聚鸟苷酸(PolyG)干预大鼠矽肺纤维化中的作用及机制.方法 将无特定病原体级成年雄性SD大鼠随机分为对照组(24只)、矽肺模型组(24只)、PolyG预防组(16只)和PolyG治疗组(16只),采用一次性吸人式气管滴注法,对照组大鼠予灭菌0.9％氯化钠溶液1 mL,其余3组大鼠均予质量浓度为50.0 g/L的矽尘混悬液1 mL以构建矽肺纤维化大鼠模型.PolyG预防组大鼠于造模当天,PolyG治疗组大鼠于造模第28天,均一次性经尾静脉注射剂量为2.5 mg/kg体质量的PolyG,于PolyG给药后第28和56天各处死大鼠8只.观察各组大鼠肺组织病理改变情况,以免疫印迹法测定葡萄糖调节蛋白-78(GRP78)、IRE1、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Casepase)-3、Casepase-12、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白相对表达水平.结果 病理组织学检查结果显示:对照组大鼠肺组织结构正常;矽肺模型组大鼠肺组织肺泡结构破坏严重,出现纤维细胞性结节及大量胶原沉积;PolyG预防组和PolyG治疗组大鼠矽结节及胶原沉积均较矽肺模型组减少.矽肺模型组大鼠肺组织中GRP78、IRE1、CHOP、Caspase-3、Caspase-12、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白相对表达水平均高于对照组(P＜0.05).除PolyG预防组IRE1和CHOP外,PolyG预防组和治疗组大鼠上述7个蛋白指标的表达水平均低于矽肺模型组(P＜0.05),但仍高于对照组(P＜0.05).造模后第56天,PolyG预防组GRP78、IRE1、Caspase-3、Caspase-12、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白相对表达水平均低于PolyG治疗组(P＜0.05).结论 IRE1介导的ERS未折叠蛋白反应可能参与了PolyG干预大鼠矽肺纤维化的过程;PolyG可有效预防和治疗矽肺纤维化,以预防性给药效果更佳.
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吸烟COPD模型大鼠肺组织内质网相关凋亡蛋白CHOP的表达
目的:研究吸烟所致慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺组织CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)表达的情况.方法:40只成年雄性Wistar大鼠随机分为对照组、吸烟2个月组、吸烟4个月组及戒烟组.采用单纯被动吸烟法复制大鼠COPD模型,测各组大鼠0.3秒用力呼气容积与用力肺活量比(FEV0.3/FVC)和高峰值流速(PEF);采用TUNEL法检测肺结构细胞凋亡情况;采用原位杂交和RT-PCR检测肺组织CHOP的mRNA表达水平;免疫组化和Western blot检测其蛋白质水平;同时采用Western blot检测蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、p-PERK、真核生物起始因子(eIF)2α和p-eIF2α的蛋白水平.结果:大鼠吸烟2个月后,肺功能较对照组明显下降(P<0.05),肺结构细胞凋亡明显增加,凋亡细胞主要是肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和支气管上皮细胞,肺结构出现破坏;吸烟4个月后,FEV0.3/FVC显著下降(P<0.05),肺结构凋亡细胞进一步增加,肺结构破坏明显;戒烟组肺功能较4个月组稍好转,肺结构破坏仍明显.与对照组相比,p-PERK、p-eIF2α和CHOP表达在吸烟2个月大鼠中升高(P<0.05),在吸烟4个月大鼠中进一步升高(P<0.05);戒烟组大鼠CHOP较吸烟4个月大鼠稍下降但差异无统计学意义;PERK和eIF2α在各组大鼠中表达的差异无统计学显著性.肺结构细胞凋亡与CHOP表达呈正相关;结论:吸烟可通过PERK/eIF2α/CHOP信号通路促进CHOP表达,从而促进COPD的发生与发展.
