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非小细胞肺癌分子标志物EML4-ALK的研究进展
近几年来,中国肺癌的发病率和病死率均呈显著升高趋势.据世界卫生组织(WHO)统计,2008年,我国肺癌总病死率是28.7/10万,约45万余人,占全部癌症死亡人数的23.1％.西方国家,肺癌也是癌症死亡的主要原因;其中,非小细胞肺癌(NSCLC)约占75％～ 80％,5年总生存率约为10％～15％[1].目前已经发现一些分子靶向药物能明显改善治疗效果.表皮生长因子受体( EGFR)基因突变是原发性肺腺癌的发生原因之一,靶向针对EGFR的酪氨酸激酶抑制剂能在某种程度上有效控制肺腺癌疾病的发展[2].分子靶向治疗发展中关键的步骤就是要明确肺癌的关键致癌基因.Soda等[3]发现另外一种有增殖活性的酪氨酸激酶融合基因棘皮动物微管相关蛋白类似因子4( EML4)-间变性淋巴瘤激酶(ALK)与NSCLC有关.EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC患者通常没有EGFR突变及K-ras突变,多发生于不吸烟或轻度吸烟的年轻肺腺癌患者,预后较好,特别是用ALK抑制剂治疗可获约80％以上的疗效[4],对培美曲塞加顺铂化疗亦有明显效果[5].这些均提示EML4-ALK融合蛋白是肺腺癌特异性较高的分子标志物.
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K-ras第12密码子突变对K-ras蛋白自身活性及下游信号通路的影响
目的 探讨K-ras第12密码子突变对K-ras蛋白自身活性及其下游信号通路的影响.方法 选用本室已构建好的稳定高表达WT、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S和G12V型K-ras蛋白的cos7同源细胞株作为研究对象,通过GST-Raf-1 Ras结合域特异性结合Ras-GTP空间构象,免疫沉淀细胞内具有活性的K-ras蛋白,利用Western blot技术检测沉淀下来的Ras-GTP水平并进行比较分析;通过Western blot法检测K-ras下游信号通路中MER、ERK、ATK蛋白分子的磷酸化水平.结果 饥饿处理后表达野生型K-ras蛋白的cos7同源细胞株内RAS-GTP水平较低,而表达G12A、G12C、G12D、G12R、G12S和G12V型K-ras蛋白的cos7同源细胞株内RAS-GTP水平活性为WT型K-ras蛋白3.5～40倍不等;表达K-ras突变蛋白的cos7同源细胞株内MEK、ERK和AKT的磷酸化水平比表达野生型K-ras蛋白的cos7同源细胞高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 K-ras第12密码子突变导致K-ras蛋白自身永久活化,且不需要外源性生长因子的刺激;突变K-ras可以持续激活K-ras蛋白下游效应因子,使K-ras信号通路持久活化.
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新型小分子药物特异性抑制吉非替尼原发耐药肺癌的体内实验研究
目的:研究针对K-ras突变小分子药物NSC-741909对吉非替尼原发耐药肿瘤模型的治疗作用,并对其机制进行研究.方法:选取H322(吉非替尼敏感,K-ras野生)及A549(吉非替尼耐药,K-ras突变)人源非小细胞肺癌细胞株,分别建立裸鼠皮下移植瘤模型,给予NSC-741909腹腔注射.绘制肿瘤生长曲线;进行凋亡检测;定量RT-PCR及Western Blot方法观察K-ras、JNK、p-JNK、MKP1的改变.结果:NSC-741909能明显抑制吉非替尼耐药肺癌裸鼠皮下移植瘤的生长,并导致肿瘤细胞出现凋亡,K-ras突变表达受抑,MKP1表达明显下降,p-JNK表达增加,而总JNK蛋白表达无改变;但对吉非替尼敏感肿瘤模型无显著抑制.结论:针对K-ras突变的小分子NSC-741909可特异性抑制吉非替尼原发耐药裸鼠移植瘤生长,抑制p-JNK去磷酸化导致JNK持续激活而诱发细胞出现凋亡是其机制之一.
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结肠癌K-ras突变与对西妥昔单抗耐药的实验研究
目的:研究结肠癌K-ras基因突变导致对西妥昔单抗耐药的可能机制.方法:通过基因测序及免疫细胞化学染色,筛选表皮生长因子受体(EGFR)表达阳性,同时K-ras基因呈突变型及野生型的结肠癌细胞各1株,应用细胞增殖实验(CCK8方法)、流式细胞技术(Annexin V标记),检测西妥昔单抗(C225)在体外对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响.同时用K-ras呈野生型和突变型的结肠癌细胞株,分别建立裸鼠皮下移植瘤模型,分成HT29-C225、HT29-NS、SW620-C225及SW620-NS组,给予西妥昔单抗(每3天注射1次,每次0.5 mL,共4周).治疗后,绘制肿瘤生长曲线,用TDT介导的缺口末端标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡,用定量PCR、免疫组织化学染色(IHC)及蛋白印迹(Western-blot)等技术检测移植瘤标本中EGFR信号转导通路中AKT及其磷酸化蛋白的表达.结果:体外增殖及凋亡实验显示,西妥昔单抗对不同K-ras基因型的结肠癌细胞均未能显示细胞毒作用.而体内研究发现.西妥昔单抗能明显抑制K-ras野生型结肠癌裸鼠皮下移植瘤的生长,但对K-ras突变型者抑制作用较差.对K-ras突变型结肠癌裸鼠皮下移植瘤的定量PCR检测结果显示,西妥昔单抗治疗组裸鼠的AKT基因表达率高于对照组.IHC及Western-blot显示,西妥昔单抗治疗组与对照组间AKT蛋白的表达率无明显差异,但西妥昔单抗治疗组裸鼠的p-AKT表达率高于对照组.结论:K-ras突变状态与西妥昔单抗的疗效相关,K-ras突变型者EGFR信号通路中的衔接蛋白AKT呈自主激活状态,该基因突变可能是导致对西妥昔单抗耐药的机制之一.
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MEK抑制剂CQN系列化合物对A549细胞体外抗肿瘤作用
目的 观察丝裂原激活蛋白激酶的激酶(MEK)抑制剂CQN系列化合物对A549细胞体外抗肿瘤作用.方法 采用非小细胞肺癌A549细胞(K-ras突变)体外抗肿瘤增殖抑制实验对9个CQN系列MEK抑制剂进行筛选,得到具有显著抗肿瘤活性的化合物.通过流式细胞术检测化合物对细胞周期和凋亡的影响;并通过ELISA法检测化合物对肿瘤发生关键蛋白ERK1/2磷酸化的抑制作用;通过细胞划痕实验检测化合物对细胞迁移能力的影响.结果 细胞增殖实验筛选出高活性化合物CQN-4和CQN-5,两者的体外抗A549细胞增殖抑制活性与对照药曲美替尼(trametinib)相当.CQN-4和CQN-5可将A549细胞阻滞于G1期,与对照相比可使细胞凋亡率明显增加(P＜0.01),且呈浓度依赖性.与对照相比,CQN-4和CQN-5对A549细胞ERK1/2磷酸化均有抑制作用(P＜0.01),且具有浓度依赖性.细胞划痕愈合实验显示CQN-4和CQN-5对A549细胞迁移有显著的抑制作用,且具有浓度依赖性.结论 MEK抑制剂化合物CQN-4和CQN-5对A549细胞具有显著的体外抗肿瘤活性.
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大肠癌单克隆抗体治疗新进展
表皮生长因子受体(EGFR)和血管内皮生长因子(VEGF)的过表达均与大肠癌肿瘤细胞牛长有密切联系,如果阻断了EGFR或VEGF的活性,就可以阻断肿瘤细胞生长的重要过程,使得肿瘤细胞功能大大受损,从而起到了抗肿瘤的作用.作为EGFR和VEGF单克隆抗体,西妥昔单抗、贝伐单抗联合化疔治疗晚期恶性肿瘤,特别是大肠癌已经得到广泛应用,明显延长了患者的生存期,并成为晚期大肠癌治疗的一项重要飞跃.本文就2008年度有关抗EGFR单抗及贝伐单抗在大肠癌治疗中的新研究进展做一综述.
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非小细胞肺癌的新靶点EML4-ALK融合基因研究进展
近年来,在肺癌的分子靶向治疗领域,研究热点一直集中在EGFR、K-ras和VEGF等靶点上,涌现出许多针对这些靶点的药物,而且取得较好的治疗效果,然而,影响肺癌的发病的生物学机制尚未完全明了.2007年日本学者Soda[1]等首次发现EML4-ALK(棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶)融合基因,近期又发现与EGFR突变和K-ras突变的不共存现象以及含有该基因患者的鲜明临床特征,提示该靶点可能是非小细胞肺癌异性较高的又一分子标记物.本文就EML4-ALK基因的生物学特征、检测方法及在肺癌治疗中的地位和意义进行综述.
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舒尼替尼与吉西他滨联合及序贯应用对K-RAS突变A549细胞的影响
目的 研究舒尼替尼与吉西他滨单药、联合及序贯应用对人肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的作用及其机制.方法 实验分为对照组、舒尼替尼组、吉西他滨组、舒尼替尼序贯吉西他滨组、吉西他滨序贯舒尼替尼组和联合组.A549细胞经舒尼替尼与吉西他滨单药、联合及序贯作用后,MTT法检测细胞增殖;Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡形态;流式细胞术检测细胞凋亡及周期分布;Western blotting检测磷酸化细胞外调节蛋白激酶(P-ERK1/2)及磷酸化蛋白激酶B (P-AKT)的表达.结果 A549细胞对舒尼替尼耐药,对吉西他滨敏感.与吉西他滨组相比,吉西他滨序贯舒尼替尼组A549细胞增殖抑制率及凋亡率明显增高(P＜0.05).舒尼替尼与吉西他滨分别阻滞A549细胞于G1期及S期.与对照组相比,舒尼替尼序贯吉西他滨组G1期细胞增多(P＜0.05),S期细胞减少(P＜0.05).与舒尼替尼组相比,吉西他滨序贯舒尼替尼组A549细胞P-ERK1/2与P-AKT的表达降低(P＜0.05).结论 吉西他滨序贯舒尼替尼作用于A549细胞具有协同作用,其机制与酪氨酸激酶受体信号通路的表达有关.
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非小细胞肺癌K-ras突变小分子对吉非替尼耐药细胞的作用
目的 观察针对K-ras突变小分子NSC-741909是否可特异性杀伤吉非替尼原发耐药细胞,并探讨其机制.方法 选取吉非替尼耐药细胞;观察NSC-741909作用后细胞增殖与凋亡的变化;共聚焦显微镜观察细胞骨架改变;Western blot检测K-ras、JNK、P-JNK的改变.结果 NSC-741909可使耐药细胞在作用24 h后,在1 μmol/L和2 μmol/L时,FITC-A+/PE-A+细胞增加至(6.9±0.6)%和(21.1±3.2)%(P＜0.01);作用30 min后,K-ras表达在2 h下降达70%;p-JNK表达增加,并持续至少15 h,而总JNK蛋白表达无改变;细胞骨架蛋白F-actin呈稀疏、不规则、发散状排列.结论 针对K-ras突变的小分子NSC-741909可特异性杀伤吉非替尼原发耐药细胞,这是通过持续激活JNK途径从而导致细胞凋亡实现的.
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肺癌中凋亡信号途径及其与EGFR通路的关系
肺癌是目前发病率和病死率高的恶性肿瘤,其中约 80%为非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC).目前,肺癌可以简单分为:EGFR突变型、K-RAS突变型、ALK融合型及其他型[1].对于前3种肺癌亚型目前均有相应的靶向药物治疗.第四型约占肺癌的25%,而对于这一占主要比重的肺癌亚型我们是否可以通过直接上调凋亡途径中的凋亡因子如CASP3、8、9等来促进肺癌乃至其他肿瘤细胞的凋亡从而达到抗肿瘤的作用,具有重要的科学研究和应用意义.本文就肺癌中凋亡途径与EGFR通路的关系作一简单综述.
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奥沙利铂或伊立替康联合氟尿嘧啶类药物一线治疗k-ras突变型晚期结直肠癌的疗效分析
目的 分析奥沙利铂或伊立替康联合氟尿嘧啶类药物一线化学治疗(化疗)k-ras突变型晚期结直肠癌的疗效和安全性.方法 收集2008年1月-2014年2月收治、经病理确诊的74例k-ras基因突变型晚期结直肠癌患者,分别使用奥沙利铂(50例)85 mg/m2第1天或伊立替康(24例)180mg/m2第1天,联合氟尿嘧啶(5-Fu)400 mg/m2静脉推注第1天+5-Fu 2 400 mg/m2持续静脉滴注46h+亚叶酸钙400 mg/m2第1天,14d为1个周期或口服卡培他滨1.0 g/m2,2次/d,第1～ 14天,21 d为1个疗程.结果 74例患者可评价疗效,奥沙利铂组和伊立替康组的有效率分别为20.0％和12.5％,疾病控制率分别为80.0％和83.3％,中位无进展生存时间分别为8.0个月[95％CI(6.0,10.0个月)和6.7个月[95％CI (6.2,7.2)个月],两组间差异均无统计学意义(P＞0.05).两组患者不良反应易耐受,主要为骨髓抑制和胃肠道反应.结论 k-ras基因突变型晚期结直肠癌患者,在一线化疗方面奥沙利铂方案较伊立替康方案能获得更高的有效率,同时在晚期结直肠癌的治疗中,检测k-ras基因的状态不仅在抗EGFR靶向治疗中有着重要的意义,对于一线化疗方案的选择也有着指导价值.
