嘧啶核苷磷酸化酶在恶性肿瘤中的表达及意义

目的观察嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)在胃癌和乳腺癌组织中的表达,并探讨其与肿瘤病理类型、转移及预后的关系.方法应用免疫组化方法观察胃癌组织40例、乳腺癌组织44例及正常组织12例(6例胃黏膜组织、6例乳腺组织)中PyNPase的表达.结果 PyNPase在胃癌及乳腺癌组织中表达的阳性率为100%,明显高于正常胃黏膜及乳腺组织中的表达(33.3%和16.7%)(P＜0.01);在不同病理类型肿瘤中PyNPase的表达差异不显著(P＞0.05);在发生淋巴结转移的胃癌及乳腺癌组织中,PyNPase的强阳性表达率分别为50%和57.9%,而在未发生转移的癌组织中强阳性表达率分别为13.6%和8%,二者差异显著(P＜0.05);在术后生存＜5年的病例中,PyNPase的强阳性表达率为54.5%,生存＞5年的病例为7.8%,两者差异极显著(P＜0.01).结论 PyNPase在肿瘤组织中表达明显增高,与肿瘤的转移及预后密切相关.

胸腺嘧啶核苷磷酸化酶在肿瘤研究中的意义

胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP或dThdPase)具有促血管增生的活性并在肿瘤进展中起重要作用,在恶性肿瘤中的活性明显高于癌旁的正常组织.血小板源性内皮细胞生长因子(platelet derived-endothelial cell growth factor,PD-ECGF)与TP为同一物质.近年来,关于PD-ECGF/TP的研究日益增多,并发现PD-ECGF/TP与一些肿瘤的临床病理特征、预后及微血管密度(density of microvessel,MVD)有关[1～6].关于TP的抑制剂、TP在化疗中作用的研究也日益增多,所以TP有可能成为一种新的肿瘤标记物,研究TP在肿瘤中的表达对指导今后的化疗,评价及改善患者的预后有重要作用.1 生物特性TP由两个相同的亚单位组成,其分子量均为5 500.TP催化胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷及其类似物的可逆的磷酸化反应,形成相应的碱基及2-脱氧核糖-1-磷酸(2-deoxyribose-1-phosphate).实际上,胸腺嘧啶的降解产物在体外具有促内皮细胞生长和化学趋化性,在体内具有促血管增生作用[6,7].TP在细胞浆或细胞核中表达,仅在细胞核中表达的很少见.其在正常组织、细胞中也表达如:肝脏、肺、淋巴结、外周淋巴细胞中也可以检测到TP活性,但TP在恶性肿瘤中的活性高于癌旁非肿瘤组织中的活性[1,8].

乳腺癌组织中嘧啶核苷磷酸化酶和微血管密度的研究

　　嘧啶核苷磷酸化酶［1］(Pyrimidine nucleoside phosphorylase,简称为PyNPase)，是分解嘧啶系列酶的总称，它参与核酸系统的合成。癌细胞增殖旺盛，核酸的合成能很高，通常在肿瘤组织内呈现较高水平的PyNPase活性。5-脱氧氟尿苷(5’-Deoxy-5-fluorouridin,5'-DFUR,商品名氟铁龙)是由Cook等［2］于1979年在寻找一种更有效的嘧啶类抗代谢药的过程中合成的一种5-氟尿嘧啶的前体药。5-DFUR在PyNPase的作用下，转化为具有抗肿瘤活性的5-FU，才对肿瘤细胞产生较强的细胞毒作用。肿瘤生长依赖于血管增生(angiogenesis)。Haraguchi等［3］研究发现PyNPase具有血管生成活性：Toi等［4］报道PyNPase的表达与乳腺癌组织中的微血管密度(Microvessel Density,MVD)显著相关。

利用嘧啶核苷磷酸化酶基因工程菌酶法合成5-氟尿苷的转化率影响因素的研究

研究酶法合成5-氟尿苷(5-FUR)的反应条件.利用嘧啶核苷磷酸化酶(Pyrimidine-nudeoside phosphorylase,PyPNase)基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a+合成5-氟尿苷(5-FUR),考察不同反应条件对转化率的影响;尝试不同反应体系对转化率的影响.结果:(1)佳转化条件:菌体:0.5 WCG/L;UR:10 mmol/L;5-FU:45mmol/L;PBS:40 mmol/L;T:50℃;pH 7.4;t:60 min,转化率可达91.27%;(2)以Na2SO4溶液为溶剂,比以PBS溶液为溶剂的转化率略有提高.微生物酶法合成5-氟尿苷(5-FUR)的转化率较高,可考虑用于工业生产.

产气肠杆菌EAM-Z1荚膜的去除对胞内pyNPase活力和菌体生长量的影响

研究产气肠杆菌(EAM-Z1)荚膜去除或变薄对于胞内嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)活力的菌体生长量和影响.在培养基中增加碳源以去除荚膜或使荚膜变薄,研究其对菌体生长的影响,并通过转化合成5-氟尿苷的方法研究其对PyNPase活力的影响.结果:在培养基中增加4%的D-甘露糖,1%的甲醇,2%的甘油或2%的丙酮都能使产气肠杆菌的荚膜变薄;其中增加2%丙酮时,菌体量增加43.92%,在工业生产中有重要意义,转化率为57.5%,提高2.8%,PyNPase比活力提高4.8%,转化合成5-氟尿苷的佳反应时间为45min,缩短了1/4.

来源于产气肠杆菌的嘧啶核苷磷酸化酶基因在大肠杆菌BL21中的表达

实现产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)嘧啶核苷磷酸化酶(Pyrimidine-nucleoside phosphorylase,PyPNase)基因在大肠杆菌中的高效表达.用来源于产气肠杆菌的核苷磷酸化酶N末端序列与NCBI中公布的已知序列进行比对,设计一对引物,以该菌株基因组DNA为模板扩增出PyPNase基因.定向克隆到PET-28a(+)载体后转化到表达宿主大肠杆菌BL21中,筛选阳性克隆并测序,然后在LB培养基中优化发酵条件.结果:目的基因片断长度为1 302 bp.表达产物经SDS-PAGE和酶活测定表明PyPNase基因在大肠杆菌中获得活性表达,43 ku处有表达蛋白.37℃培养2 h至对数生长中期,降温到31℃,0.1mmol/L IPTG诱导5 h获得大酶活力为512.3 U/mg,为出发菌株的17.2倍.重组PyPNase的成功表达为今后大规模生产5-FUR打下了基础.

利用产气肠杆菌EAM-Z1转化合成5-氟尿苷的转化率影响因素的研究

利用产气肠杆菌EAM-Z1转化合成5氟尿苷,从筛选中间体稳定剂、底物流加、底物诱导、菌体冻融和石英砂研磨等方面研究转化率的影响因素,结果:(1)转化过程中加入40mmol/L的硼砂可以将转化率达到75.56%,提高30.28%;加入10mmol/L的甘氨酸可以使转化率达到61.92%,提高6.76%;(2)流加5-氟尿嘧啶可以将转化率提高到87.78%;(3)培养过程中加入尿苷诱导效果并不明显,尿苷浓度为0.001 g/L时效果佳,提高3.63%;(4)菌体冻融和石英砂研磨使转化率下降26%.

酶法合成5-氟尿苷

采用产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes) CPU 7856变异株的游离细胞,利用其中的嘧啶核苷磷酸化酶(Uridine Phosphorylase)通过碱基交换进行酶法合成目的物.试验以30mmol/L尿苷(UR),30mmol/L 5-氟尿嘧啶( FU),30mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8)的混合物加入10%的产气肠杆菌湿菌体反应3h,底物UR的转化率可达50%.

影响产气肠杆菌EAM-Z1中嘧啶核苷磷酸化酶活力的因素

目的:研究影响产气肠杆菌EAM-Z1的嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)酶活力的因素.方法:分别考察添加底物、金属离子、速效碳源和磷酸盐对菌体浓度及PyNPase活力的影响.结果:加入4 g/L胞苷,菌体的量增加了19.30%,综合考虑对菌体量和比酶活,加入3 g/L胞苷可使PyNPase活力增加10.46%;4 mg/L Ca2+使菌体量增加了10.90%,PyNPase活力增加了30.25%;低浓度的速效碳源可以增加菌体浓度,但均使PyNPase的活力降低;1 g/L磷酸盐使PyNPase活力增加了17.40%.结论:底物诱导、金属离子、速效碳源和磷酸盐均对PyNPase的活力有一定的影响.

5-氟尿苷生物转化率的影响因素研究

目的:利用产气肠杆菌EAM-Z1转化合成5-氟尿苷(5-FUR),并对影响5-FUR转化率的因素进行了考察.方法:以磷酸盐缓冲液(PBS)为溶剂的5-FUR的转化率为对照,考察反应溶剂Na2SO4溶液、中间体稳定剂、金属离子、固定化细胞、粗酶液等因素对转化率的影响.结果:以Na2SO4溶液为溶剂进行转化,转化率可提高10%左右;双中间体稳定剂硼砂+硼酸使转化率提高20%左右;Mg2+和Zn2+可提高产物的转化率,在以PBS为溶剂的转化反应中,1 mmol/L Mg2使转化率提高了11.31%,以Na2SO4溶液为溶剂的转化反应中,4 mmol/L Zn2+使转化率提高了9.43%;以固定化细胞进行生物转化,反应时间缩短为1 h,但转化率略有降低;以粗酶液进行生物转化,反应时间为4 h,转化率提高21.29%.结论:5-FUR的转化率受多种因素的影响,合理的反应溶剂如Na2SO4溶液、中间体稳定剂、金属离子、提取酶粗提液等方法均可以较显著的提高5-FUR的转化率.

去氧氟尿苷的研究进展

去氧氟尿苷(5'-DFUR)是5-氟尿嘧啶(5-FU)的一个无毒的前药，它被机体吸收后在瘤组织内主要转换成5-Fu而发挥抗肿瘤作用。嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)不但是实现这一转换的关键酶，而且是一个肿瘤优势酶。它决定了5'-DFUR既具有选择性的抗肿瘤作用，又具有毒副反应小的特点。本文对5'-DFUR的作用机制、实验研究和临床应用进行了综述．旨在促进它的合理应用及新的抗肿瘤药物的开发。

嘧啶核苷磷酸化酶与原发性肝癌预后的关系

目的初步探讨嘧啶核苷磷酸化酶在原发性肝癌中表达的临床预后意义.方法随机从我院外科2001年6月～2004年6月间185例原发性肝癌手术切除标本中随机抽取40例.术前均未经任何放化疗.使用SP免疫组化法分别检测肝癌细胞中PyNPase的表达.对所有病例的AFP水平,瘤体直径,门脉癌栓,转移复发率进行回顾性分析.结果① PyNPase的表达与肝癌Edmondson病理分级正相关.②PyNPase的表达与是否有PVTT、是否有肝内转移、淋巴结转移、肿瘤大小有关系,而与AFP水平、HbsAg阳性率无关.结论 PyNPase在原发性肝癌组织中的表达水平除了对手术后的药物治疗有指导意义,其表达对肿瘤的预后有一定的提示意义.

原发性肝癌细胞中PyNPase的表达及其临床意义

目的通过免疫组化检测原发性肝癌中嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)的表达,揭示依赖于嘧啶核苷磷酸化酶转化的化疗药物在临床应用的分子基础.方法从我院外科2001年6月至2004年6月间183例原发性肝癌手术切除标本中随机抽取40例作为实验组.术前均未经任何放化疗.并随机抽取同期肝内胆管结石手术肝切除标本40例,且证实为正常肝组织,作为对照组.使用SP免疫组化法分别检测肝癌细胞与正常肝细胞PyNPase的表达.结果原发性肝癌细胞和正常肝细胞PyNPase的表达指数分别为62.34+/-19.53和12.61+/-10.17,有显著性差异(P＜0.05).不同组织分型的肝癌组织的PyNPase的表达也有显著的差异(P＜0.05).结论原发性肝癌细胞中PyNPase呈高表达,则提示其对依赖于嘧啶核苷磷酸化酶转化的化疗药物如氟铁龙,希罗达等更为敏感.

术前口服5′-DFUR对胃肠道恶性肿瘤组织中PyNPase的影响及意义

背景与目的:嘧啶核苷磷酸化酶 (pyrimidine nucleoside phosphorylase,PyNPase)主要分布在肿瘤组织,去氧氟尿苷( 5′- deoxy- 5- fluorouridine,5′- DFUR)可以降低 PyNPase在肿瘤组织中的含量.但术前口服 5′- DFUR不同时间后对肿瘤组织中 PyNPase的影响如何尚未见报道.本研究通过观察术前口服 5′- DFUR不同时间后对 胃肠道恶性肿瘤组织中 PyNPase水平的影响, 探讨术前化疗的适宜时间.方法:胃肠道恶性肿瘤患者共 73例, 根据术前口服 5′- DFUR (600～ 1 200 mg/d)至手术时间的不同分为 A组 (3天组 )27例, B组 (1周组 )22例, C组 (2周组 )15例, D组 (2月组 )9例; E组(对照组) 24例为同期住院手术的胃肠道恶性肿瘤患者.上述患者术前均未接受化疗或放疗.采用逆转录-聚合酶链反应 (reverse transcription polymerase chain reaction,RT- PCR)和免疫组织化学 (immunohistochemistry,IHC)等方法检测各组肿瘤组织中 PyNPase的表达水平.结果:( 1)在电镜下, C组肿瘤细胞常出现不可逆的致死性改变,但在光镜下所见肿瘤细胞形态正常,仅 D组可见肿瘤间质中纤维结缔组织增多;( 2)与 E组肿瘤组织中的 PyNPase mRNA及蛋白表达水平( 0.95± 0.09, 29.34± 1.82)相比, A组( 0.79± 0.08, 19.26± 1.65)已明显降低, C组 (0.43± 0.07, 5.91± 1.45)为明显,而 C组与 D组( 0.42± 0.04, 5.36± 1.19)相比无明显差别.各组间肿瘤组织中 PyNPase mRNA与蛋白表达水平比较差异有显著性 (r=0.92, P< 0.0001).结论:术前口服 5′- DFUR可以破坏胃肠道恶性肿瘤细胞;随服药时间延长,肿瘤组织中 PyNPase含量呈进行性减少, 2周左右达到低水平;服药时间以 2周左右为宜.

嘧啶核苷磷酸化酶和P-糖蛋白在肝癌组织中的表达及意义

近年来 , 原发性肝癌的预后有了一定的提高 , 高的转移复发率是进一步提高疗效的障碍 , 化 疗是一种有效的预防转移复发手段 , 但是过多的副反应和肿瘤的多药耐药成为提高化疗疗效 的障碍 . 本研究通过 SP法对正常肝组织和原发性肝癌组织中的嘧啶核苷磷酸化酶 (Pyrimidine Nucleoside Phosphorylase, PyNPase)和 P 170进行免疫组化检测 , 为需要依 赖于 PyNPase转化的化疗药物的临床应用提供理论依据 .

Exiguobacterium sp.MY02菌株PyNPase基因的克隆与表达

目的 鉴定、构建并高效表达从土壤中筛选到的一株耐热型、高活性的嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase).方法 以MY02总DNA为模板,通过简并PCR、特异PCR引物、筛选和DNA测序,在5'引物和3'引物中分别引Nco I和Xba I酶切位点,将pynp基因克隆至分泌表达载体pBAD/gⅢ A中,转化至E.coli TOP 10F',以L-阿拉伯糖诱导表达,并对诱导剂浓度、诱导时间等进行优化.结果 成功构建了重组表达载体pBAD/gⅢ A-pynp,通过磷酸化和转化反应,鉴定此酶为PyNPase.结论 优化PyNPase的纯化条件与复性条件,可获得大量的PyNPase.

嘧啶核苷磷酸化酶在乳腺癌中的表达及意义

目的:观察嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase)在乳腺癌组织中的表达,探讨其与肿瘤病理类型、转移及预后的 关系.方法:应用免疫组织化学方法,观察了46例乳腺癌组织及10例正常乳腺组织中PyNPase的表达.结果:PyN-Pase在乳腺癌组织中的表达阳性率明显高于在正常乳腺组织中的表达,p＜0.01;在不同病理类型的癌组织中PyNPase的表达无差别p＞0.05;在发生淋巴结转移的癌组织中,PyNPase的强阳性表达率(+++)为52.6%,明显高于未发生转移的组织18.5%,p＜0.05;在术后生存不足5年的病例中,PyNPase的强阳性表达率为58.8%,在生存超过5年的病例中为17.2%,二者差异非常显著,p＜0.01.结论:PyNPase在乳腺癌组织中表达明显增高,与癌肿的转移及预后密切相关.

乳腺癌中的嘧啶核苷磷酸化酶及血管内皮细胞生长因子

乳腺癌是我国女性常见的一种恶性肿瘤,研究乳腺癌中嘧啶核苷磷酸化酶与血管内皮细胞生长因子在乳腺癌血管生成中的作用及意义,阐明乳腺癌的增生、发展与嘧啶核苷磷酸化酶和血管内皮细胞生长因子的关系.

5-氟脲嘧碇与醋酸安宫黄体酮联合治疗对二甲基苯并蒽诱导的肿瘤细胞中嘧啶核苷磷酸化酶和胸苷酸合成酶活性的影响