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新藤黄酸联合阿霉素通过JNK信号通路诱人乳腺癌细胞凋亡的相关机制研究
目的:研究新藤黄酸(GNA)与阿霉素(ADR)联合应用对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响,并进一步探讨两药联用的相关机制.方法:体外培养人乳腺癌细胞MCF-7细胞株,采用MTT法检测GNA与ADR单独及联合处理后细胞的存活率;Chou-Talalay联合指数法评价GNA与ADR的药物联合作用;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测给药后MCF-7细胞凋亡率;流式细胞仪检测JC-1染色细胞线粒体膜电位变化;Western blot法分别检测GNA与ADR单独及联合处理MCF-7细胞后ASK-1、p-ASK-1、JNK、p-JNK、Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3通路蛋白表达的变化,同时检测经JNK通路抑制剂SP600125处理后相关蛋白指标的变化.结果:在一定浓度范围内,人乳腺癌细胞MCF-7的细胞存活率随着GNA(0.0625-4.0000μmol/L)与ADR(0.5-16.0μmol/L)给药剂量增加而降低(P＜0.01),且联合用药组细胞存活率低于单独用药组(P＜0.01).联合指数法分析计算后得出合用指数CI＜1,提示两药联合具有协同作用.GNA与ADR单独和联合作用均能诱导MCF-7细胞凋亡,且联合用药组细胞凋亡率与单独用药组比较,显著增加(P＜0.01).单独给药组MCF-7细胞线粒体膜电位有所降低(P＜0.01),而联合用药组与单独给药组相比则膜电位明显降低(P＜0.01).与正常对照组比较,单独给药组中ASK-1、p-ASK-1、JNK、p-JNK、Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3蛋白均被激活,相关蛋白表达量增加,而联合用药组蛋白表达显著上调(P＜0.01).使用JNK通路抑制剂SP600125处理后,ASK-1和p-ASK-1蛋白表达与未处理组无明显差异,Cyt-c和Caspase-9蛋白表达量略微下降,Caspase-3蛋白表达无显著变化,而SP600125抑制了JNK,p-JNK蛋白表达上调,且联合用药组蛋白表达与单独给药组相比有所降低(P＜0.01).结论:GNA与ADR单独和联合应用均能诱导人乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡,且两者联合应用可产生协同效应,其作用机制可能与调控JNK信号通路相关.
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HPLC法测定藤黄中藤黄酸和新藤黄酸的含量
目的 建立藤黄中藤黄酸和新藤黄酸的含量测定方法.方法 采用反相高效液相色谱法,色谱柱为Hypersil ODS C18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-0.1%冰醋酸水溶液(93:7),流速1.0 mL/min;检测波长为360nm,外标法定量.结果 藤黄酸线性范围为2.45～49 μg,回归方程Y-11 334.8+232 781X(r=0.999 9,n=5),平均回收率99.3%,RSD=1.02%(n=6);新藤黄酸线性范围为2.55～51μg,回归方程Y=75 197.5+226 301X(r=0.999 7,n=5),平均回收率100.5%,RSD=1.48%(n=6).结论 本法精密度高,重复性好,简便、可靠,可作为藤黄的质量控制方法.
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新藤黄酸体外抗肺癌血管生成的作用机制研究
为了观察新藤黄酸(gambogenic acid,GNA)对肺癌血管生成的影响及初步的作用机制.该实验以新藤黄酸处理肺腺癌A549细胞的条件培养基培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),建立非直接接触型细胞共培养体系;应用Matrigel胶建立HU-VEC的二维培养模型,观察新藤黄酸对血管生成的影响;DAPI染色倒置荧光显微镜下观察新藤黄酸对HUVEC细胞凋亡的影响;Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术分析新藤黄酸对HUVEC凋亡率的影响;Western blot法检测新藤黄酸对HUVEC中PI3K,p-PI3K,Akt,p-Akt,VEGF蛋白表达的影响;采用PTEN-siRNA转染细胞后,RT-PCR法检测PI3K,Akt基因的表达水平.结果表明,新藤黄酸能明显抑制血管生成,其抑制效果与剂量相关;DAPI染色荧光显微镜下可见HUVEC可出现凋亡形态特征;Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测结果显示新藤黄酸诱导HUVEC细胞凋亡;Western blot法检测结果表明新藤黄酸下调了p-PI3K,p-Akt蛋白的表达水平,而对PI3K,Akt蛋白表达影响不明显.RT-PCR法检测表明PTEN-siRNA转染入细胞后,能上调PI3K,Akt mRNA基因的表达.体外研究表明新藤黄酸能抑制肺癌血管生成,抑制血管生成的机制可能与PI3K/Akt信号通路有关.
关键词： 新藤黄酸 人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 肺癌A549 血管生成 细胞凋亡 -
新藤黄酸诱导细胞凋亡抑制A549细胞裸鼠移植瘤增长的研究
目的:通过体内移植瘤模型探讨新藤黄酸干预人非小细胞肺癌的发生发展的可能机制.方法:采用肺腺癌A549裸鼠移植瘤实验,评价新藤黄酸对人肺腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用;透射电镜观察细胞超微结构的变化;TUNEL法检测凋亡指数;免疫组织化学方法检测瘤体组织COX-2和VEGF蛋白的表达.结果:新藤黄酸8,16 mg·kg-1给药后裸鼠的移植瘤较模型组生长缓慢,瘤重及瘤体积明显低于模型组(P<0.01);透射电镜观察发现新藤黄酸各组肿瘤细胞出现典型的凋亡特征;模型组中癌细胞质无明显空泡化,核膜内侧异染色质区域表现正常,其他染色质正常分散分布;TUNEL结果表明,给药组瘤体组织的凋亡指数明显高于模型组;免疫组织化学分析结果显示新藤黄酸作用后能够降低肿瘤组织的COX-2和VEGF的表达(P<0.01).结论:新藤黄酸可能通过诱导肺腺癌A549细胞凋亡而干预人非小细胞肺癌的发生发展,并调控肿瘤组织VEGF和COX-2蛋白的表达.
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新藤黄酸通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导黑色素瘤B16细胞凋亡的研究
目的:探讨新藤黄酸诱导黑色素瘤B16细胞凋亡的机制.方法:MTT试验检测新藤黄酸对B16细胞增殖抑制的作用;采用Hochest 33258荧光染色观察新藤黄酸对B16细胞的影响;透射电镜观察新藤黄酸对B16细胞的超微结构的改变;Western blot法检测PI3K,p-PI3K,Akt,p-Akt,p-mTOR,PTEN蛋白的变化以探讨新藤黄酸诱导B16细胞凋亡的分子机制.结果:新藤黄酸对黑色素瘤细胞B16生长和增殖有明显地抑制作用,并随着新藤黄酸浓度的增加和作用时间的延长细胞活力明显下降;Hochest 33258染色结果显示,新藤黄酸处理的细胞中呈现明显的凋亡特征;透射电镜观察发现新藤黄酸作用B16细胞后,细胞发生明显凋亡的形态学变化;Western blot检测表明p-PI3K蛋白表达呈时间依赖性下降;p-Akt蛋白表达呈时间依赖性下降,而PI3K,Akt蛋白表达量基本不变,p-mTOR蛋白的表达随着时间的延长有所下降,PTEN蛋白的表达呈时间依赖性增加.结论:新藤黄酸在一定的时间和浓度范围内能够抑制黑色素瘤B16细胞的增殖,诱导细胞凋亡,其诱导细胞凋亡的机制可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路有关.
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新藤黄酸-羟丙基-β-环糊精包合物的制备及质量控制
目的:制备难溶性药物新藤黄酸的羟丙基-β-环糊精包合物,并对包合物进行鉴定及质量控制.方法:采用冷冻干燥法制备包合物,并经差示量热扫描、红外光谱、扫描电镜、相溶解度等方法对其进行表征;高效液相色谱法测定包合物中新藤黄酸的含量.结果:新藤黄酸和羟丙基-β-环糊精形成了包合物,且形成的包合物的主客分子物质的量比为1:1,表观稳定常数为K_a=117 L·mol~(-1);新藤黄酸线性范围为4.12～24.72μg·mL~(-1)(r=0.999 9),平均回收率为100.1%,RSD为0.48/%.结论:冷冻干燥法制备包合物方法简单可行,增加了药物的溶解度.
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新藤黄酸体内外抗肿瘤作用研究
目的 初步探讨新藤黄酸的体内外抗肿瘤作用.方法 采用MTT方法观察新藤黄酸对多种肿瘤细胞的增殖抑制作用;采用4、8、16、32 mg/kg剂量新藤黄酸作用于人肿瘤裸小鼠(BALB/c-nude)模型,观察新藤黄酸的体内抗肿瘤作用.结果 MTT法显示新藤黄酸对培养的人肿瘤细胞(人结肠癌细胞HCT-8、人肝癌细胞Bel-7402、人胃癌细胞BGC-823、人非小细胞肺癌细胞A549、人卵巢癌细胞A2780)增殖有一定的抑制作用,作用72 h的IC50在1.75～3 μmol/L;8、16、32 mg/kg新藤黄酸iv给药,对人非小细胞肺癌A549细胞肿瘤移植的模型小鼠有一定的抑制肿瘤增长作用(P＜0.05).但4～16 mg/kg剂量的新藤黄酸iv给药,对人肝癌Bel-7402肿瘤模型的抑制生长作用不明显.结论 新藤黄酸能够抑制培养的肿瘤细胞生长;iv给药时对A549细胞肿瘤移植的模型小鼠肿瘤增殖有明显的抑制作用.
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新藤黄酸纳米脂质载体制备及其药剂学性质研究
目的 制备新藤黄酸纳米结构脂质载体并表征其药剂学性质.方法 采用乳化蒸发-低温固化法制备新藤黄酸纳米脂质载体(GNA-NLC),正交试验设计优化佳工艺处方,并对其包封率、平均粒径及Zeta电位等性质进行考察.结果 优化后处方制备的GNA-NLC多为圆整、实体的类球形,平均粒径为(144.07±1.44) nm,多分散系数为0.24±0.01,Zeta电位为(-28.03±0.29)mV,包封率为(84.65±0.98)％,载药量为(4.21±0.05)％;DSC显示GNA纳米粒确已形成,并且GNA以非晶态分布在基质中.结论 乳化蒸发-低温固化法能成功制备GNA-NLC,工艺简单,易于控制.
关键词： 新藤黄酸 纳米脂质载体 微柱离心法 乳化蒸发-低温固化法 正交试验设计 -
新藤黄酸包合物冻干粉针制备及工艺优化
目的 优化新藤黄酸羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)包合物冻干粉针的制备工艺.方法 采用不饱和水溶液法,以L-精氨酸与新藤黄酸成盐助溶,制备新藤黄酸HP-β-CD包合物；采用冷冻干燥法制备新藤黄酸HP-p-CD包合物冻干粉针；HPLC法测定新藤黄酸的量；以包合率为指标,应用正交设计法优化制备工艺.结果 优化的制备工艺为HP-p-CD与新藤黄酸质量配料比为10∶1、20℃包合5h；制备的包合物包合率高；包合物冻干粉色泽均匀、粉末蓬松、溶解性好.结论 工艺优化合理、重现性好.
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新藤黄酸诱导黑色素瘤B16细胞线粒体自噬的机制研究
目的 探讨新藤黄酸诱导黑色素瘤B16细胞线粒体自噬的机制.方法 MTT试验检测新藤黄酸对黑色素瘤B16细胞增殖的抑制作用;倒置显微镜观察黑色素瘤B16细胞在新藤黄酸作用下产生的形态变化;透射电镜观察新藤黄酸对黑色素瘤B16细胞线粒体超微结构的影响;流式细胞术检测新藤黄酸诱导黑色素瘤B16细胞线粒体膜电位及ROS的改变;Western blot法检测LC-3、mTOR、AMPK及SIRT3等自噬相关蛋白的变化.结果 MTT结果显示新藤黄酸在体外对黑色素瘤B16细胞的生长及增殖有明显抑制作用,且随着新藤黄酸浓度的增加和作用时间的延长,细胞活力明显下降;倒置显微镜观察黑色素瘤B16细胞显示随着新藤黄酸浓度增加,细胞结构被明显破坏,细胞死亡增多;透射电镜观察发现新藤黄酸作用黑色素瘤B16细胞后,细胞发生明显的线粒体自噬的形态学变化;Western blot法检测表明随着新藤黄酸给药时间的延长,AMPK、SIRT3及LC3-Ⅱ蛋白表达量呈时间依赖性上升,LC3-Ⅰ蛋白表达量呈时间依赖性下降,mTOR蛋白表达量随着时间延长有所下降.结论 新藤黄酸在一定时间和浓度范围内能够抑制黑色素瘤B16细胞的增殖,诱导细胞发生线粒体自噬,其诱导细胞线粒体自噬的机制可能与调控ROS/SIRT3/AMPK信号通路有关.
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新藤黄酸制备液相分离方法
目的：分离制备藤黄中化学对照品新藤黄酸。方法：采用硅胶柱层析和制备液相色谱法进行分离、纯化，采用TLC、HPLC进行纯度鉴定，采用波谱法进行结构鉴定。结果：制备液相法制得新藤黄酸纯度高于98％，符合化学对照品的质量要求。结论：制备液相法制备化学对照品新藤黄酸工艺简单、快速有效，成本低于常规硅胶柱层析。
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UPLC法分析藤黄炮制前后4种成分的变化
目的 建立UPLC法分析藤黄Garcinia hanburyiHook.f.及其炮制品(高压制、豆腐制、清水制)中藤黄烯酸、表藤黄烯酸、藤黄酸、新藤黄酸含有量的变化.方法 该植物乙腈提取液的分析采用UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1mm,1.8μm);流动相乙腈-0.1％甲酸(80∶20);体积流量0.3 mL/min;检测波长360 nm.结果 4种成分在各自范围内均呈良好的线性关系(r ＞0.999 3),平均加样回收率100.9％～103.0％(RSD＜ 3.0％).炮制后,藤黄酸和新藤黄酸的含有量均有所下降,分别在清水、豆腐制品中低.同时,新生成了藤黄烯酸和表藤黄烯酸,两者含有量在清水制品中高,高压制品中低.结论 清水制法有利于藤黄烯酸和表藤黄烯酸的生成.
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新藤黄酸诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的作用机制研究
目的:探讨新藤黄酸诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的作用及其可能的分子机制.方法:采用MTT法检测新藤黄酸对人结肠癌HCT116细胞增殖的抑制作用;DAPI染色及荧光显微镜观察细胞凋亡情况;FCM法检测细胞周期分布;蛋白质印迹法检测新藤黄酸对cyclin D1、cyclin E、P21、P27和多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]蛋白表达的影响.结果:新藤黄酸对HCT116细胞增殖有明显的抑制作用,并呈浓度和时间依赖性.DAPI染色后荧光显微镜观察发现,新藤黄酸能明显诱导HCT116细胞凋亡.FCM法检测发现,新藤黄酸可以使HCT116细胞G<,0>/G<,1>期比例显著升高,S期比例相应降低,表明细胞周期阻滞于G<,0>/G<,1>期.蛋白质印迹法检测结果表明,新藤黄酸下调了细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E的表达,上调了P21和P27的蛋白表达,诱导了PARP蛋白的剪切.结论:新藤黄酸通过下调细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E的表达和上调P21、P27的表达,使HCT116细胞阻滞在G<,0>/G<,1>期,进而显著抑制HCT116细胞的增殖,并诱导其凋亡.
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新藤黄酸诱导LP-1人多发性骨髓瘤细胞凋亡及抑制血管生成作用的实验研究
目的:研究新藤黄酸对于多发性骨髓瘤LP-1细胞凋亡的诱导作用及血管生成抑制作用.方法:通过采用CCK-8细胞活力检测法研究了新藤黄酸对LP-1多发性骨髓瘤细胞体外增殖的影响;采用Annexin V-EGFP荧光染色法定性检测及流式细胞术定量检测了新藤黄酸对LP-1多发性骨髓瘤细胞凋亡的诱导作用;采用级联酶底物显色法检测了新藤黄酸对LP-1多发性骨髓瘤细胞caspase-3酶原活化状态的影响;划痕法检测了新藤黄酸对血管内皮细胞体外血管生成能力的影响.结果:新藤黄酸能明显抑制LP-1多发性骨髓瘤细胞体外增殖,其IC50为7.765 μM.新藤黄酸可诱导LP-1细胞发生细胞凋亡,此效应具有剂量依赖性,新藤黄酸60μM作用于LP-1细胞24h细胞凋亡百分率达到59.8％.进一步的研究表明,新藤黄酸可引起LP-I细胞caspase-3酶原活化,提示新藤黄酸引起的LP-1细胞凋亡过程中caspase-3酶原活化发挥了重要作用.新藤黄酸能剂量依赖性地抑制人血管内皮细胞划痕修复,提示新藤黄酸能抑制人脐静脉血管内皮细胞体外血管生成能力.结论:新藤黄酸对于多发性骨髓瘤细胞具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用,此作用机制部分是通过级联酶原活化的途径实现,新藤黄酸亦可抑制血管内皮细胞体外血管生成的能力.
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高效液相色谱法测定藤黄药材中藤黄酸与新藤黄酸的含量
目的 建立藤黄药材中藤黄酸与新藤黄酸的含量测定方法.方法 采用反相高效液相色谱法,色谱柱为Purospher RP-18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈A-0.1％乙酸水溶液B(0-30min80％-90％A,30-32min90％-80％A);流速:1ml/min;检测波长为360nm,外标法定量.结果 藤黄酸的线性范围为0.0408 ～ 0.4080mg/mL,回归方程Y=16023031X-54083 (r=0.9991,n=5),平均回收率为99.7％,RSD=1.39％(n=9);新藤黄酸的线性范围为0.0372～0.3720mg/mL,回归方程Y=11893364X-34797(r=0.9999,n=5),平均回收率为100.1％,RSD=1.00％(n=9).结论 本方法精密度高,重复性好,简便、可靠,可作为藤黄中藤黄酸和新藤黄酸的含量检测方法.
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新藤黄酸大鼠在体肠吸收动力学研究
目的:探讨新藤黄酸在大鼠各肠段的吸收动力学特征,为设计新藤黄酸新型给药系统提供可靠的生物药剂学依据.方法:采用大鼠在体肠灌流吸收实验模型,并考察新藤黄酸在浓度为3.0、10、30 μg/mL、以及不同肠段(结肠、回肠、空肠、十二指肠)对新藤黄酸吸收的影响,用HPLC-UV测定新藤黄酸的浓度.结果:在3.0～30 μg/mL范围内新藤黄酸的浓度与吸收速率成线性关系,新藤黄酸在结肠、回肠、空肠、十二指肠的吸收速率常数(Ka)分别为(0.03944±0.00158)、(0.04012±0.00103)、(0.04104±0.00124)、(0.08620±0.00272) h-1.结论:新藤黄酸在大鼠肠道符合一级动力学的吸收过程,在大鼠肠道为被动扩散的吸收机制.新藤黄酸在大鼠的各个肠道都有吸收,因此将新藤黄酸设计为控释制剂是可行的.
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miR-218对新藤黄酸抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖作用的影响及机制研究
目的 研究miR-218对新藤黄酸抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖作用的影响及其可能的分子机制.方法 人宫颈癌HeLa细胞转染过表达真核表达载体pmiR-218, real-time PCR检测HeLa细胞miR-218的表达.将HeLa细胞分为空白对照组、新藤黄酸组、pmiR-218组、质粒对照组、新藤黄酸联合pmiR-218组.MTT法检测各组细胞增殖;流式细胞仪检测各组细胞凋亡;Western blot检测Bcl-2、Bax、E-cadherin表达;real-time PCR检测Bcl-2、Bax和E-cadherin 的mRNA表达水平.结果 miR-218真核表达载体pmiR-218转染HeLa细胞后,细胞内miR-218表达水平明显增加(P<0.05).miR-218可提高 HeLa细胞对新藤黄酸的敏感性,高表达miR-218能促进新藤黄酸对HeLa细胞的增殖抑制作用,促进细胞凋亡,下调新藤黄酸对HeLa细胞Bcl-2/ Bax蛋白的表达水平.结论 miR-218可提高HeLa细胞对新藤黄酸的敏感性,miR-218能增强新藤黄酸对HeLa细胞增殖抑制作用,并促进HeLa细胞凋亡,其作用机制可能与下调 Bcl-2/Bax的表达有关.
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大鼠血浆中的新藤黄酸HPLC测定及其药代动力学研究
目的 建立测定大鼠血浆中新藤黄酸浓度的HPLC方法,并用于新藤黄酸在大鼠体内的药代动力学研究.方法 以藤黄酸为内标,建立大鼠血浆中新藤黄酸的HPLC测定方法.采用该方法测定大鼠单剂量静脉注射1、2、4 mg·kg-1新藤黄酸后不同时间点大鼠血浆中的新藤黄酸的浓度,对其血药浓度-时间采用BABP 3.0软件拟合,计算药动学参数.结果 血浆中新藤黄酸在0.07~18.0 mg·L-1浓度范围,其线性关系良好(r=0.999),定量下限为0.07 mg·L-1,提取回收率分别为大于70%,其日内、日间RSD均小于10%.新藤黄酸以1、2和4 mg·kg-1静脉给药后,在大鼠体内的T12分别为(43.61±0.61)、(46.07±2.11)和(46.73±1.14) min,AUC0-t分别为(158.52±6.27)、(211.13±9.33)和(361.37±14.97) min·mg·L-1.结论 所建立的HPLC法样品前处理简便、操作简便、能满足新藤黄酸在大鼠体内的药代动力学研究.
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新藤黄酸诱导HepG2细胞凋亡与Bax及Bcl-2的关系
中药藤黄（gamboge）系藤黄科植物藤黄树（Garcinia hanburyi Hook．F．G）所分泌的干燥树脂,近年来,藤黄的抗肿瘤作用受到高度关注.已有研究证实,新藤黄酸（neogambogic acid, NGA）为藤黄抗肿瘤作用的主要有效成分之一［1-3］.肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上常见的恶性肿瘤之一［4］,同时也是第三大引起患者死亡的肿瘤［5］.为此,本实验探讨了新藤黄酸诱导肝细胞癌HepG2细胞凋亡的作用机制,旨在为进一步开发新藤黄酸提供实验依据.
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HPLC测定芙蓉膏凝胶剂中新藤黄酸的含量
目的:建立高效液相色谱法测定芙蓉膏凝胶剂中新藤黄酸的含量方法:色谱柱为Hypersil ODS (4.6×250mm,5μm)；以甲醇:0.5％磷酸(90:10)为流动相;流速:1.0 ml/min；检测波长:360nm进行实验.结果:线性回归方程为:Y=27345.133X+27591.233,相关系数r=0.9984,新藤黄酸在0.280～1.400μg范围内呈线性,平均回收率为99.81％,RSD为1.63.结论:该方法准确可靠,稳定性、重现性好,适用于芙蓉膏的含量测定.
