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荧光定量PCR检测WT1基因在白血病中的表达
目的:建立荧光定量RT-PCR检测WT1基因的方法,探讨WT1基因在各类白血病中的表达.方法:RT-PCR分别扩增K562细胞WT1基因及β-actin基因,凝胶切割并回收、纯化,经紫外分光光度计定量后作为标准模板.采用荧光定量RT-PCR方法检测80例白血病患者骨髓或外周血及10例正常人外周血中WT1基因表达.结果:白血病患者组(49例AML、18例ALL、7例HAL、6例CML)与正常人外周血WT1基因表达有显著差异,髓系表达高于淋巴系,M5显著低表达.结论:荧光定量RT-PCR方法检测WT1基因灵敏性高、特异性好.与正常人外周血比较,WT1在各类型白血病中呈高度表达.
关键词： 白血病 WT1 荧光定量RT-PCR -
实时荧光定量RT-PCR检测大肠腺癌中WT1基因表达
目的 探讨大肠腺癌标本中WT1基因的表达水平及其与临床病理特征的关系.方法 建立实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测了27例大肠腺癌标本和11份正常大肠黏膜组织中WT1基因及内参照β-actin基因的表达水平.结果 大肠腺癌标本中WT1基因表达水平的范围5.4×10-5～8.9×10-1,在11份正常肠黏膜中有5份存在WT1的低表达,范围从7.6×10-5～7.2×10-4,其余6份未检出表达,81%(22/27)的患者癌组织中WT1 mRNA表达水平高于正常肠黏膜组织,另外,研究表明WT1 mRNA表达水平与病理分级,淋巴结转移,Duke's分期无明显相关性.结论 WT1基因在大肠腺癌中高表达,可作为诊断和治疗大肠癌新的分子指标.
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WT1 c-erbB-2在大肠癌中的表达及其相关性研究
目的 探讨WT1、c-erbB-2在大肠癌中的表达、相互关系及其临床意义.方法 采用免疫组织化学SP法检测两者在大肠癌中的表达,应用SPSS 10.0统计软件进行数据处理.结果 ①在大肠癌中WT1蛋白阳性表达率为45.1%(23/51),与临床病理因素之间无相关性;c-erbB-2蛋白阳性表达率为60.8%(31/51),与淋巴结转移有关(χ2=9.07,P＜0.01);在Duckes各期中分别为A期(63.6%),B期(68.7%),C期(85%),D期(100%),其中C+D期表达明显高于A+B期(u＝149.5,P＜0.01).②WT1表达水平与c-erbB-2表达水平呈正相关(χ2=5.39,P＜0.01).结论 WT1与c-erbB-2可能协同作用参与了大肠癌的发生发展.
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两种组蛋白乙酰转移酶P/CAF和p300协同提高WT1基因启动子和内部增强子活性
目的 P/CAF(p300/CBP-associated factor)和p300都是组蛋白乙酰转移酶家族成员,它们都含有组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)区.本文的目的 是检测P/CAF和p300及其HAT区在维耳姆斯氏瘤1(WT1)基因转录调控中的作用.方法 构建WT1启动子/内部增强子/荧光素酶报告基因质粒,通过瞬时转染和荧光素酶活性测定实验检测P/CAF和p300及其HAT区在WT1基因转录调控中的作用.结果 P/CAF和p300都能提高WT1基因启动子和内部增强子活性.当P/CAF和p300共同作用时,它们能协同提高WT1基因的转录活性.在WT1基因转录激活的过程中,P/CAF和p300的HAT区发挥重要作用.结论 P/CAF和p300能够协同提高WT1基因的转录活性,在此过程中,P/CAF和p300的HAT区发挥重要作用.
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肥胖相关性肾病肾组织中nephrin desminWTI的表达
目的 研究肥胖相关性肾病患者肾小球足细胞病变,分析不同肾组织病理类型患者肾小球足细胞中neph-rin、desmin、WT1的表达和分布特征.方法 收集2001-2008年河北医科大学第二医院肾内科收治的16例经肾穿刺活检明确诊断的肥胖相关性肾病患者资料,根据其肾脏病理分为肥胖相关性肾小球肥大症(O-GM)组11例,肥胖相关性局灶节段性肾小球硬化症(O-FSGS)组5例.对照组5例,为外科切除的且已诊断为肥胖的肾脏肿瘤标本的正常皮质组织.应用免疫组织化学方法检测足细胞特异标志物nephrin、desmin、WT1,同时结合临床及肾组织病理有关指标的进行多因素分析.结果 nephrin、desmin、WT1在正常肾组织沿肾小球基底膜呈连续、线形分布.O-GM组nephrin、desmin、WT1的表达量降低,与对照组比较,差异无统计学意义,O-FSGS组nephrin、desmin、WT1的表达下降,呈点状、短线条状,较正常组织少,差异有统计学意义(P<0.05).O-FSGS组足细胞计数少于O-GM组,差异有统计学意义(P<0.01),且足细胞融合、微绒毛化改变和肾小球硬化数明显增多(P<0.05).结论 肥胖相关性肾病患者早期即出现肾小球足细胞中nephrin、desmin、WT1的表达和分布减少,随着病变的加重,这种变化愈发明显.
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环孢素A治疗WT1基因突变所致遗传性肾病综合征研究进展
遗传性肾病综合征指由于肾小球滤过屏障组成蛋白的编码基因或其他相关基因突变所致的肾病综合征,临床绝大多数表现为激素耐药型肾病综合征(SRNS)[1].目前已知大多数由单基因突变导致的遗传性肾病综合征激素以及免疫抑制剂治疗无效.因此,国内外均主张对于确诊的遗传性肾病综合征不予激素或免疫抑制剂治疗,对于拟诊病例应慎用[2].然而,近年来有研究尝试用环孢素A(CsA)治疗WT1基因突变所致的遗传性肾病综合征并取得明确的效果[3-7].
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儿童急性白血病WT1和bcl-2基因的表达及意义
目的 研究急性白血病患儿WT1和bcl-2基因表达情况及其相关性,探讨两者与儿童急性白血病发病机制和预后的关系.方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定56例急性白血病患儿及12例对照患儿的WT1基因表达,同时采用免疫荧光流式细胞术观察40例急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿抗凋亡基因bcl-2的表达.结果 56例急性白血病患儿中38例WT1基因表达阳性,较对照组明显为高(P＜0.01);在ALL和急性髓系白血病(AML)患儿WT1基因表达阳性率分别为65.96%和77.78%,差别没有统计学意义(P＞0.05);WT1表达阳性患儿的完全缓解率(CR)低于表达阴性患儿(P＜0.05).40例ALL患儿中bcl-2高表达28例,较对照组明显为高(P＜0.01);AML患儿的bcl-2表达与WT1基因表达正相关(Pearson相关系数为0.262);bcl-2高表达患儿CR低于低表达患儿(P＜0.05);联合WT1及bcl-2表达情况将ALL患儿分为高危、中危和低危三组,其CR率分别为33.33%、72.73%和100%,三组间差异有显著性(P＜0.05).结论 WT1基因和bcl-2表达与儿童急性白血病的发病和预后密切相关;WT1基因及bcl-2的共同表达情况可作为预测ALL患儿预后的重要指标.
关键词： 儿童 急性白血病 WT1 Bcl-2 逆转录-聚合酶链反应 -
醛固酮受体拮抗剂联合贝那普利对阿霉素肾病大鼠肾组织nephrin、WT1表达的影响
目的 观察nephrin和WT1在阿霉素肾病大鼠肾组织中表达的变化,探讨醛固酮受体拮抗剂及贝那普利对其的影响及二者与尿蛋白的关系.方法 SD大鼠60只,随机分为正常对照(A组)、阿霉素肾病(B组)、贝那普利干预(C组)及醛固酮受体拮抗剂联合贝那普利干预(D组)各15只,实验开始后6 w观察大鼠24 h尿蛋白、血肌酐及肾脏病理改变,采用RT-PCR方法对肾组织nephrin和WT1表达进行分析.结果 与A组比较,B组24 h尿蛋白明显升高,肾组织nephrin、WT1表达明显降低(P<0.01);与B组比较,C、D组24 h尿蛋白定量显著降低(P<0.05),D组治疗效果更显著(P<0.01);C、D组与同时期B组比较病理变化明显减轻.C、D组肾脏nephrin、WT1表达较B组明显增高(P<0.05,P<0.01).结论 阿霉素肾病大鼠尿蛋白的变化与肾组织nephrin和WT1的表达改变有关,醛固酮受体拮抗剂及贝那普利可能通过上调nephrin和WT1的表达,降低尿蛋白、改善肾小球足细胞功能.
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Wt1在心脏发育中的作用
Wt1初被认为是一种抑癌基因,现在发现其在器官形成和病理生理过程中发挥作用,它不仅影响肾脏而且影响心脏的发育.心外膜细胞在经历了上皮-间充质细胞转化后成为心血管前体细胞,之后继续分化为心肌细胞、冠状动脉血管细胞等,该过程在心脏发育中起到重要作用,而Wt1调控了这一重要的转化过程.本综述主要阐述Wt1通过Wnt/β-catenin信号通路和维甲酸信号通路调控EMT,影响心脏发育的机制.充分理解Wt1调控EMT产生心血管前体细胞的过程与分子机制,对于研究正常心脏发育及心脏再生有很大帮助.
关键词： WT1 EMT Wnt/β-catenin 维甲酸 -
WT1基因在白血病中的表达及意义
目的探讨WT1基因在白血病中的表达与临床意义.方法采用筑巢式逆转录聚合酶链反应(Nest RT-PCR)检测K562白血病细胞系、39例急性白血病(AL)患者、5例慢性粒细胞白血病(CML)患者和22例正常对照骨髓或外周血细胞的WT1基因表达.结果 30例初治或复发AL中有22例患者高表达WT1基因,阳性率73.3%.在急性非淋巴细胞白血病(ANLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)阳性率分别为70.8%和83.3%,两组无显著差异.随着WT1基因表达水平的升高,完全缓解(CR)率有明显下降的趋势,CR后WT1基因表达水平明显下降,复发后又显著升高.结论用Nest RT-PCR测定WT1基因的表达可作为检测白血病微小残留病(MRD)的一项指标.
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急性白血病患者PRAME、WT1基因表达及其临床意义
目的 探讨急性白血病患者PRAME、WT1基因的表达临床意义及其与疾病分型的关系.方法 所西南医科大学附属医院白血病初发患者58例,包括急性髓系白血病(AML)患者36例,急性淋巴细胞白血病(ALL) 22例;AL完全缓解组(CR)20例,为同期血液科门诊白细胞或血小板正常或轻度减少,骨髓一致正常人20例为对照,采用Real-timePCR方法对PRAME、WT1基因的表达进行检测.结果 初治组患者的PRAME、WT1相对表达量均显著高于缓解组和对照组(P＜0.05),但缓解组和对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),跟踪11例白血病初治患者,诱导化疗缓解后两种基因的相对表达量均显著低于诱导化疗前(P＜0.05),WT1阳性表达率为70.7％(41/58),PRAME阳性表达率为56.9％(33/58).结论 PRAME、WT1基因联合检测可提高阳性率,可用于监测白血病患者的微小残留病(MRD),并且PRAME、WT1基因的表达与白细胞的发生、疾病的分型密切相关,对白血病患者的化疗、预后判断以及监测微小病灶具有一定的意义.
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WT1在急性髓系白血病患者骨髓中表达及临床意义分析
目的 分析WT1在急性髓系白血病患者骨髓中表达及临床意义.方法 选取2013年2月至2015年5月本院收治的急性髓系白血病患者70例为研究对象,采用实时荧光定量聚合酶链反应技术(PCR)测量其各治疗阶段骨髓WT1基因、ETO基因、内参因子(GADPH)的拷贝数,以WT1基因拷贝数/GADPH拷贝数比值计算WT1、ETO表达水平,并用DNA测序法检测c-kit基因突变情况,后以所测WT1平均值为界,按WT1表达水平高低将其分为A、B两组各35例,对比其WT1变化情况及治疗1年内完全缓解率、无病生存率、死亡率、复发率、2年内总生存率,并分析WT1基因表达水平与ETO、c-kit基因水平的相关性.结果 A组治疗前WT1/GADPH(0.00139±0.00014)较B组高(P<0.05),随治疗时间延长,两组WT1/GADPH水平均显著下降(P<0.05),组间比较无显著差异(P>0.05);A组1年内完全缓解率71.43%、2年总生存率42.86%,明显低于B组,两组1年内无病生存率、死亡率、复发率比较无显著差异(P>0.05);相关分析WT1基因表达水平与ETO、c-kit基因表达水平呈正相关(P<0.05).结论 WT1在急性髓系白血病患者骨髓中的表达有升高趋势,临床可将其作为评估预后的有效指标.
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WT1抗原负载的DC联合CIK对鼻咽癌细胞的体外杀伤活性研究
目的：探讨WT1抗原负载的树突状细胞（DC）诱导多种细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）对鼻咽癌细胞（CNE）的体外杀伤效应。方法采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞，常规法诱导DC、CIK细胞；流式细胞技术分析测定细胞表型；MIT法分别测定在4个不同效靶比时CIK、DC＋CIK和WT1抗原负载的DC＋CIK三组效应细胞对鼻咽癌细胞（ CNE）的杀伤活性。结果在4个不同效靶比时WT1抗原负载的DC诱导CIK对鼻咽癌细胞的体外杀伤效应明显高于CIK、DC＋CIK。结论 WT1抗原负载的DC诱导CIK对鼻咽癌细胞（ CNE）的体外杀伤效应增强，为肿瘤临床生物免疫治疗提供了实验室基础。
关键词： WT1 树突状细胞 多种细胞因子诱导的杀伤细胞 鼻咽癌细胞 -
WT1在非小细胞肺癌中的表达及其与肺癌细胞增殖的关系
目的:探讨人非小细胞肺癌及其相应癌旁组织中WT1基因(Wilms' tumor gene 1,WT1)的表达,体外研究其与肺癌细胞增殖的关系.方法:应用实时荧光定量PCR法检测79例非小细胞肺癌组织及其相应癌旁组织中WT1 mRNA的表达情况.构建重组质粒pLV-GFP-WT1,并通过脂质体LipofectAMINE 2000将其瞬时转染至非小细胞肺癌H1299细胞中,应用蛋白质印迹法检测转染后H1299细胞中WT1蛋白的表达,CCK-8 (cell counting kit-8)法检测细胞的增殖情况.结果:非小细胞肺癌组织中WT1 mRNA的表达水平高于相应的癌旁组织,差异有统计学意义(P＜0.01).重组质粒pLV-GFP-WT1成功构建,并将其成功转染至H1299细胞中；转染后的H1299细胞中,WT1蛋白的表达水平上调；在pLV-GFP-WT1转染后24、36和48 h时,过表达WT1的H1299细胞增殖率高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:WT1 mRNA在非小细胞肺癌组织中的表达水平明显高于相应癌旁组织,高表达WT1基因能促进非小细胞肺癌H1299细胞的增殖,提示WT1在非小细胞肺癌中扮演癌基因的角色.
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CD2相关蛋白在足细胞分化中的作用
本文旨在研究肾脏足细胞的分化特点及CD2相关蛋白(CD2-associated protein,CD2AP)在足细胞分化过程中的作用.用RPMI 1640培养基在33.C许可条件下培养永生化小鼠足细胞系(未分化组),转染针对CD2AP的小分子干扰RNA(smallinterfering RNA,siRNA)后置于37.C非许可条件下培养(转染组),并将非许可条件下未转染组作为对照组.用MTT法检测足细胞的生长速度;用RT-PCR方法检测CD2AP、WTI、synaptopodin和nephrin mRNA表达;用Western blot检测CD2AP、wTl和nephrin蛋白表达;用免疫荧光结合激光共聚焦方法检测CD2AP、nephrin、F-actin和tubulin在分化及未分化足细胞中的分布及其共定位情况.结果显示,CD2AP、WTl和nephrin在分化及未分化足细胞中均可稳定表达,而synaptopodin仅表达于已分化足细胞,在未分化足细胞无表达.在足细胞分化过程中,CD2AP和nephrin的表达上调(P<0.05);CD2AP、tubulin和F-actin在细胞内的分布发生改变,CD2AP与nephrin及F-actin在未分化足细胞中存在共定位关系.转染特异性siRNA下调CD2AP表达,细胞生长速度明显减慢,synaptopodin mRNA表达下调(P<0.05),细胞分化迟滞.结果表明,足细胞分化过程中伴随细胞骨架的重新分布和细胞形态的改变;CD2AP可能作为足细胞裂孔隔膜分子与细胞骨架的连接蛋白,在足细胞分化过程中发挥重要作用.
关键词： CD2相关蛋白 足细胞 nephrin Synaptopodin WT1 -
肾组织WT1蛋白表达与大鼠阿霉素肾病模型蛋白尿关系的实验研究
目的 观察WT1(Wilms' tumor 1)在大鼠阿霉素肾病模型中的表达,探讨其在蛋白尿发生发展过程中的作用.方法 30只SD大鼠随机分为模型组和对照组,建立阿霉素肾病模型,在第2、4、6、8周,应用光镜、电镜观察肾组织的病理改变, BCA法检测24 h尿蛋白排泄量,半定量Western Blot的方法检测大鼠肾皮质中WT1的表达.结果 ①随着模型组大鼠肾组织病理改变逐步加重及尿蛋白量逐渐增加,肾皮质WT1的表达量亦逐渐增加,第2、4、6、8周分别为对照组的1.5、2.7、3.1、4.3倍;② WT1的表达水平与尿蛋白量之间呈正相关性(P＜0.001).结论 阿霉素肾病模型大鼠肾皮质WT1的表达与大鼠蛋白尿的发生发展密切相关.
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白血病细胞系中WT1基因启动子区域DNA甲基化的研究
目的应用基于聚合酶链反应(PCR)的实验方法,研究白血病细胞系中WT1基因启动子区域的DNA甲基化水平及其与WT1基因表达的关系.方法采用RT-PCR技术及甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术,检测HL-60、Jurkat及KG-1等白血病细胞系中WT1基因mRNA表达水平及其启动子区域的DNA甲基化状态;以5-杂氮脱氧胞嘧啶(5-aza-CdR)对启动子区域DNA高甲基化的U937细胞系进行去甲基化处理后,观察WT1基因表达水平的改变.结果 HL-60、K562、KG-1、NB4及SHI-1细胞系中WT1水平高表达,而Jurkat和U937细胞表达水平极低,同时检测到这两个细胞系存在WT1基因启动子区域DNA高甲基化;经去甲基化处理后,U937细胞系的WT1基因表达水平较未处理者升高.结论 WT1基因启动子区域DNA高甲基化是抑制其表达的机制之一.
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58例肾母细胞瘤临床病理特征及分型
目的 探讨肾母细胞瘤(Wilms'tumor,WT)的临床病理学特征、诊断和鉴别诊断,分析WT1蛋白和CD10与其病理分型的关系.方法 回顾性复习58例WT的临床资料和光镜形态,免疫组织化学法标记WT1、CD10在WT不同成分中的表达并进行统计学分析.结果 男性30例,女性28例;平均年龄和中位年龄分别为3.2岁和2岁(87天~9岁).肿瘤发生于左侧肾脏30例、右侧肾脏28例.形态学上含有3种成分:胚芽成分、上皮成分和间叶成分.WT1阳性率为62%,阳性部位为胚芽及上皮成分的细胞核,间叶成分中向骨骼肌分化的细胞质也为阳性(P<0.05);CD10在分化的上皮成分中弥漫表达(P<0.01).结论 WT是发生在6岁以下儿童常见的先天性肾脏肿瘤,具有多向分化的特点,熟悉WT的临床病理形态学特点及通过WT1和CD10免疫组化染色区分肾母细胞瘤的成分,可帮助明确诊断和分型.
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UCH-L1在高糖刺激的足细胞及大鼠糖尿病肾病模型中的表达
目的 探讨泛素羧基末端水解酶-1(ubiquitin carboxy-terminal hydrolase-1,UCH-L1)在高糖诱导的体外足细胞及糖尿病肾病大鼠模型体内足细胞中的表达.方法 以25 mmol/L高糖刺激体外足细胞0、12、24 h后,提取细胞蛋白,采用Western bolt法检测UCH-L1的表达.20只8～10周龄Wistar大鼠,随机分为对照组和糖尿病肾病模型(STZ)组并造模,各10只,定期检测体重、血糖变化,处死大鼠取肾脏组织,HE染色和PAS染色观察肾脏形态学改变,采用免疫组化PV 9000两步法染色以WT1定位足细胞,检测足细胞内UCH-L1的表达.结果 在不同时间高糖处理后,足细胞UCH-L1蛋白表达量随时间延长明显升高(P＜0.01);体重、血糖检测及HE、PAS染色证明糖尿病肾病模型构建成功,STZ组足细胞(WT1定位)内UCH-L1呈阳性,而对照组几乎无明显表达.结论 分子生物学和形态学两种方法联合证明高糖可诱导体内外足细胞中UCH-L1的表达升高.
关键词： 泛素羧基末端水解酶-1 糖尿病肾病 足细胞 WT1 -
蟾蜍灵在体内外抑制急性红白血病细胞K562增殖及下调WT1表达的研究
目的：研究蟾蜍灵在体内外抗 K562细胞增殖及对WT1表达影响。方法半固体集落形成实验检测蟾蜍灵对K562细胞的增殖抑制作用,流式细胞术分析蟾蜍灵对K562细胞周期的影响,Western blot观察蟾蜍灵对WT1表达作用。通过高致瘤性K562细胞制备裸鼠皮下荷瘤模型,分组为模型组、蟾蜍灵组及高三尖杉酯碱组,比较各组皮下瘤体积与重量、病理形态学改变及WT1蛋白表达情况。结果①半固体集落形成实验、流式及Western blot结果显示,蟾蜍灵能明显抑制K562细胞增殖,阻滞细胞在G0/G1期,并下调其WT1蛋白表达,呈剂量依赖性；②蟾蜍灵组和阳性对照组裸鼠肿瘤的抑瘤率均明显高于模型组(P<0．05),且蟾蜍灵组和阳性对照组裸鼠皮下瘤重量均明显低于模型组(P <0．05)；③病理切片显示,蟾蜍灵导致K562皮下瘤组织内肿瘤细胞大量坏死、凋亡,继发出血及纤维化等改变；并明显抑制K562皮下瘤组织中WT1蛋白表达水平。结论蟾蜍灵在体外可抑制K562细胞增殖及阻滞细胞周期于G0/G1期,并下调其WT1蛋白表达,在体内可明显抑制裸鼠K562皮下瘤体积和重量,导致皮下瘤组织坏死、凋亡,并可下调其WT1蛋白的表达。
