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脂多糖诱导血管内皮细胞骨架重构中RhoA/ROCK通路的作用及中药干预
脂多糖(Lipopolysaceharide,LPS)可直接或间接的作用于内皮细胞,引起内皮屏障功能和血管通透性的变化,其诱导的内皮细胞纤维形肌动蛋白(F-actin)骨架重构是重要病理基础.大量研究证实RhoA/Rho激酶(RhoA/ROCK)信号通路是调控F-actin骨架重构的重要信号通路.RhoA/ROCK通路通过影响氧化应激及各种血管活性因子,调控内皮细胞黏着斑(focal contact; focal adhesion plaques)、应力纤维的形成等,引起细胞形态及细胞与基质之间的张力变化,导致细胞骨架重构.很多中药可以通过抑制RhoA/ROCK通路,降低相关信号分子的表达来调控细胞骨架,从而发挥保护内皮细胞的作用.
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β-榄香烯抑制肝星状细胞表达ANGⅡ及RhoA/ROCK信号
目的:探讨β榄香烯对肝星状细胞表达分泌血管紧张素Ⅱ、血管紧张素原及Rho/ROCK的影响.方法:HSC-T6细胞株培养24 h,以不同浓度β榄香烯及空白对照分别作用4,12,24 h后,放射免疫法检测培养上清中ANGⅡ的量,RT-PCR检测HSC中AGT及Rho/ROCK mRNA的表达.结果:在4 h时,10.0 mg·L~(-1)β-榄香烯组培养上清中ANGⅡ的分泌量为(50.970±8.081)pmol·L~(-1),较空白组(74.500±10.999)pmol·L~(-1)明显下降(P＜0.05),而5.0,2.5 mg·L~(-1)β-榄香烯组对ANGⅡ分泌无明显抑制作用.12 h时,10,5 mg·L~(-1)β-榄香烯组ANGⅡ分泌量分别为(83.727±6.850),(91.090±3.226)pmol·L~(-1),显著低于空白对照组(104.367±5.030)pmol·L~(-1), (P＜0.01,P＜0.05);而2.5 mg·L~(-1)β-榄香烯组作用不明显.24 h时,5,2.5mg·L~(-1)β-榄香烯组ANGⅡ分泌量分别为(104.133±3.296),(100.957±2.581)pmol·L~(-1),与空白组(116.620±7.110)pmol·L~(-1)比较明显减少(P＜0.05,P＜0.01);而10 mg·L~(-1)β-榄香烯组作用不明显.与空白组比较,4,12,24 h各时间点,各个浓度的β榄香烯对HSC表达AGTmRNA均有抑制作用,F分别为30.33,28.04,107.19,P均为0.4,12,24 h各时间点,2.5,5.0,10 mg·L~(-1)β-榄香烯对HSC表达RhoAmRNA均有抑制作用,F分别为19.87,14.35,40.13,均P=0,无明显剂量依赖性;4,24h时间点,2.5,5.0,10mg·L~(-1)β榄香烯对HSC表达ROCK-1,ROCK-2mRNA均有抑制作用(P＜0.01),而12h时各组之间无显著差异.结论:β榄香烯能使HSC分泌ANGⅡ及HSC内AGT mRNA表达降低,同时抑制下游信号RhoA,ROCK-1,ROCK-2 mRNA的表达,抑制ANGⅡ的生物学效应,从而延缓肝纤维化及门脉高压的发生.
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1,25-二羟维生素D3抑制RhoA/ROCK通路减轻幼鼠海水淹溺型肺损伤的实验研究
目的 探讨1,25-二羟维生素D3对幼鼠海水吸入型肺损伤的干预作用及其机制.方法 32只SD幼鼠随机分为空白对照组、海水处理组、活性VitD3处理组和地塞米松处理组,每组8只.海水处理组幼鼠给予气管内灌注3 ml/kg海水,VitD3处理组和地塞米松处理组在海水处理组的基础上分别给予25 μg/kg VitD3和10 mg/kg地塞米松灌胃处理.分别检测各组肺组织湿干比和通透性变化,ELISA法检测肺组织中炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞-1β(IL-1β)的表达,Western blot检测GTP-RhoA和磷酸化MYPT-1的表达变化.结果 与正常对照组比较,海水气管内滴入4h后幼鼠肺部组织出现明显炎症和水肿,炎症因子TNF-α和IL-1β的表达显著增高,RhoA的活化和MYPT-1磷酸化增加;1,25-二羟维生素D3和地塞米松干预可显著减轻海水导致的肺组织损伤,减少了TNF-α和IL-1β的释放,并且抑制了RhoA的活化和MYPT-1的磷酸化.结论 RhoA/ROCK通路参与幼鼠海水吸入型肺损伤的发展,1,25-二羟维生素D3能够通过调节该信号通路减轻肺损伤.
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FAP促卵巢癌侵袭和迁移的细胞内途径
目的：明确FAP发挥促增殖、侵袭和迁移作用的细胞内传递途径。方法： Transwell 实验和迁移实验检测FAP、RhoA/ROCK、Rac1-GTP对卵巢癌细胞系HO-8910 PM的增殖，侵袭和迁移的影响。结果：迁移和侵袭实验证实用Y-27632抑制RhoA/ROCK途径能促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭，与FAP联合作用时可使促进作用增强。迁移和侵袭实验证实NSC23766可抑制Rac1迁移和侵袭，与FAP联合作用可使FAP的促进作用减弱。结论：FAP不是通过细胞内RhoA/ROCK，而是通过Rac1-GTP信号通路在HO-8910 PM细胞发挥促增殖、迁移和侵袭作用的。
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Y-27632对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
目的 探讨RhoA/ROCK通路特异性阻断剂Y-27632对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖及成骨分化的影响.方法 自小鼠股骨、胫骨骨髓腔分离培养小鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪细胞表面标记检测及细胞成骨、成脂、成软骨三系分化鉴定小鼠骨髓单个核细胞.将第3代小鼠骨髓间充质干细胞随机分为2组,单纯成骨诱导液对照组、Y-27632干预组.分别于细胞培养后ld、2d、3d、4d收集细胞,噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)比色法观察BMSCs增殖能力;成骨诱导后7d、14 d收集细胞,可见光比色法检测碱性磷酸酶(ALP)变化;成骨诱导后24h收集细胞,western blot法检测Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil-containing protein kinases1,ROCK1)的表达.结果 流式细胞术细胞表面标志检测及成骨、成脂、成软骨三系分化鉴定均证实我们所获细胞为BMSCs.与对照组相比,Y-27632能促进BMSCs增殖,差异具有统计学意义(P＜0.05);Y-27632能降低ALP表达,差异具有统计学意义(P＜ 0.05);Y-27632能明显阻断ROCK1的表达,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 Y-27632阻断RhoA/ROCK信号通路可以促进BMSCs增殖,抑制BMSCs成骨分化.
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RhoA/ROCK与糖尿病肾病
Rho具有与GTP及GDP结合的能力,同时具有GTP酶活性,通过与GTP、GDP结合形式的转换调控许多细胞内信号转导.糖尿病时在高糖环境下肾小球系膜细胞RhoA/Rho激酶活性增加,诱导激活蛋白(AP)-1、转化生长因子(TGF)-β、血管内皮生长因子(VEGF)等上调,抑制内皮型一氧化氮合酶(eNOS),增强Ca2+依赖的血管平滑肌收缩,在肾脏缺血、纤维化中起重要作用.他汀类药物亦通过抑制RhoA活性,对肾脏结构和功能起保护作用.
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FAP和Rho家族蛋白在卵巢癌侵袭迁移中的作用
目的:明确FAP是否通过RhoA/ROCK、Rac 1-GTP通路发挥促增殖、侵袭和迁移作用.方法:用MTT实验,Transwell实验和迁移实验检测FAP、RhoA/ROCK、Rac 1-GTP对卵巢癌细胞系HO-8910PM的增殖,侵袭和迁移的影响.结果:1、MTT法,迁移和侵袭实验证实用Y-27632抑制RhoA/ROCK途径能够促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭,与FAP联合作用时促进作用增强.2、MTT法,迁移和侵袭实验证实NSC23766抑制Rac1途径能够抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭,与FAP联合作用使FAP的促进作用减弱.结论:1、RhoA/ROCK通路抑制HO-8910PM细胞增殖、迁移和侵袭;Rac 1-GTP促进HO-8910PM细胞增殖、迁移和侵袭.2、FAP不是通过RhoA/ROCK而是通过Rac 1-GTP信号通路在HO-8910PM细胞发挥促增殖、迁移和侵袭作用的.
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RhoA／ROCK 信号通路与原发性高血压患者血压变异性及颈动脉内膜中层厚度的相关性
目的：探讨原发性高血压患者血清 RhoA 激酶（ROCK）水平与血压变异性（BPV）及颈动脉内膜中层厚度（IMT）的关系。方法选取2013年9月至2014年8月山东大学附属济南市中心医院心内科原发性高血压患者73例，根据血清 ROCK1水平分为高表达组（n ＝37）和低表达组（n ＝36）。选取同期体检血压正常者40例为正常对照组。采用 Human Rock1 Elisa kit 及酶标仪检测血清 ROCK1水平；监测24 h 血压，记录24 h、白昼、夜间血压均值以及相应的血压标准差；采用彩色多普勒超声仪测量颈动脉 IMT。结果高表达组和低表达组血清 ROCK1水平明显高于正常对照组（P ＜0．01）；高表达组24 h 收缩压标准差（24hSSD）、日间收缩压标准差（dSSD）、夜间收缩压标准差（nSSD）均明显高于低表达组（P ＜0．05）；高表达组和低表达组颈动脉 IMT 比正常对照组明显增厚，高表达组颈动脉 IMT 比低表达组明显增厚（P ＜0．05）；血清 ROCK1水平与24hSSD、dSSD、nSSD 及颈动脉 IMT 呈显著正相关性（P ＜0．05）。结论高血压患者血压变异性增高与 RhoA／ROCK1信号通路高表达有关，RhoA／ROCK1信号通路过度激活可导致颈动脉 IMT 增厚及颈动脉粥样硬化斑块（AS）形成。
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当归四逆汤对糖尿病血瘀症大鼠周围神经病变及水通道蛋白1、RhoA/ROCK信号通路的影响
目的:研究当归四逆汤对糖尿病血瘀症大鼠周围神经病变及水通道蛋白1 (AQP1)、RhoA/ROCK信号通路的影响.方法:65只健康雄性SD大鼠,12只作为正常对照组(A组),其余53只制备2型糖尿病大鼠血瘀症模型.48只成模大鼠再分为:糖尿病血瘀症组(B组)、甲钴胺治疗组(C组)、当归四逆汤低剂量治疗组(D组)和当归四逆汤高剂量治疗组(E组),每组12只.检测各组大鼠坐骨神经传导速度、坐骨神经含水量;背根神经节AQP1和RhoA/ROCK信号通路相关因子mRNA/蛋白表达水平变化.结果:造模大鼠体重明显下降,血糖、血脂、血流变指标水平明显异常(P＜0.01);B组大鼠坐骨神经含水量显著高于A组(P＜0.01),C组与A组接近(P＞0.05),E组与C组相当(P＞0.05),好于D组(P＜0.05);各组坐骨神经传导速度差异无统计学意义(P＞0.05);各组大鼠背根神经节信号通路因子mRNA表达比较,B组AQP1高于A组,RhoA、ROCKⅡ低于A组(P＜0.05),C组AQP1、RhoA、ROCKⅡ表达水平接近A组(P＞0.05),E组接近C组(P＞0.05),D组AQP1表达高于E组,RhoA、ROCKⅡ表达量低于E组(P＜0.05),各组ROCKⅠ mRNA表达未见统计学差异(P＞0.05);各组大鼠信号通路因子蛋白表达,B组AQP1、RhoA、ROCKⅡ较A组显著下调(P＜0.01),C组AQP1、RhoA、ROCKⅡ表达接近A组(P＞0.05),E组接近C组(P＞0.05),D组表达低于E组(P＜0.05),各组ROCKⅠ蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论:当归四逆汤治疗糖尿病周围神经病变有效,且高剂量组效果更好,作用机理可能与其调节AQP1及RhoA/ROCK信号通路表达水平有关.
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羟基红花黄色素通过RhoA/ROCK通路保护大鼠心肌再灌注损伤的机制研究
目的:研究羟基红花黄色素A对大鼠离体缺血心脏再灌注的保护作用,探讨其与Rho/ROCK信号通路的作用.方法:36只大鼠被随机分为7组,采用离体心脏灌流模型,给予缺血预处理及药物灌流,比较各组心率、冠状动脉流量,测定左心室内压,TTC心肌染色评估梗死范围,Western blot检测心肌组织内ROCK1、ROCK2活性以及Caspase-3的表达.结果:治疗组大鼠心脏缺血再灌注损伤减轻,心肌梗死面积减少,ROCK1、ROCK2活性以及Caspase-3的表达减低.结论:羟基红花黄色素A能够减轻大鼠心脏缺血再灌注损伤,同时减少心肌梗死面积,其作用机制可能与其抑制RhoA/ROCK信号通路,减少Caspase-3的表达有关.
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MEK1/2抑制剂PD98059对ox-LDL诱导HUVEC损伤的保护机制及对LOX-1表达影响
目的 探讨MEK1/2抑制剂PD98059对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护机制及对低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)表达的影响.方法 使用ox-LDL诱导HUVEC损伤模型并进行PD98059处理,分阴性对照组、ox-LDL组、阳性对照组和PD98059+OX-LDL组;检测抑制MEK1/2对ox-LDL诱导HUVEC损伤的影响.结果 与阴性对照组比较,ox-LDL组LOX-1、pMEK1/2、RhoA、ROCK1、ROCK2、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的释放增多,细胞增殖能力及培养液中一氧化氮(NO)水平降低(P＜0.05);与ox-LDL组比较,阳性对照组和PD98059+ox-LDL组LOX-1、pMEK1/2、RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α和IL-6的释放减少,细胞增殖能力及NO水平增高(P＜0.05).结论 PD98059抑制MEK1/2信号通路可降低HUVEC中LOX-1的表达以减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤.
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Rho/ROCK通路在大鼠实验性弥漫性轴索损伤中的作用
目的 研究RhoA和Nogo-A在弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)后的动态表达,并探讨Rho/ROCK通路抑制对DAI后脑内Nogo A表达的调控及其在DAI中的作用.方法 用头颅瞬间旋转损伤装置制作大鼠DAI模型.观察DAI后RhoA和Nogo-A表达的时间依赖性和严重程度依赖性,并用辛伐他汀和Y27632药理性抑制RhoA/ROCK通路的活性,观察该通路在DAI后神经修复中的作用.用HE染色和PTAH染色指示DAI后脑组织病理学改变.Western blot检测RhoA和Nogo-A的表达,并检测β-APP的表达来指示轴突的损伤程度.并用免疫荧光染色指示RhoA和Nogo-A表达的空间相关性.结果 DAI后均出现明显的神经细胞坏死和轴突变性、断裂等病理改变;DAI后RhoA和Nogo-A的表达趋势一致,两者的表达量均随着DAI后时间的延长而增加,同时也随着损伤程度加重而增加,经免疫荧光双染色显示两者在脑内的表达有显著的同一性;用辛伐他汀和Y27632抑制RhoA/ROCK通路后能明显改善DAI后神经功能,并降低β-APP的表达,同时两者也能明显减少Nogo-A的表达.结论 DAI后脑内RhoA和Nogo-A的表达有高度相关性,抑制Rho/ROCK通路可改善神经功能并减轻轴突损伤.
