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低氧培养促进大鼠髓核间质干细胞增殖
目的 研究低氧培养对大鼠髓核间质干细胞(NPMSCs)增殖的影响.方法 分离大鼠尾椎髓核获得NPMSCs并进行体外扩增培养,观察细胞形态,流式细胞仪鉴定细胞免疫表型.取第3代NPMSCs分为常氧组和2%低氧组,分别培养7 d及14 d,观察细胞形态;MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞活力和RT-qPCR检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、沉默信息调节蛋白1(SIRT1)及SIRT6的mRNA表达情况.结果 原代NPMSCs细胞早期可形成葵花样细胞集落,传代后细胞增殖明显加快,细胞形态以纺锤形为主.第3代细胞高表达干细胞相关阳性表面抗原分子,低表达干细胞相关阴性表面抗原分子.低氧组细胞形态以多角形为主,细胞更容易聚集成团块,且细胞增殖速度明显加快(P<0.05),细胞凋亡率明显下降(P<0.05).低氧组HIF-1α、VEGF、GLUT-1、SIRT1及SIRT6表达量明显高于常氧组(P<0.05).结论 2%O2的低氧环境促进髓核间质干细胞增殖,其机制可能与SIRT1及SIRT6介导的HIF-1α信号通路有关.
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慢性低氧性肺动脉高压大鼠肺组织P53表达增高
目的 观察P53在低氧性肺动脉高压大鼠肺组织中的表达.方法 采用减压低氧方法复制大鼠慢性低氧性肺动脉高压模型;取肺组织,常规SABC免疫组化法染色和Hoechst染色,观察P53表达的变化及细胞凋亡变化.结果 P53在慢性肺动脉高压大鼠肺小动脉壁中有少量表达,其中低氧3周组＞低氧2周组＞正常组.Hoechst染色显示肺组织凋亡细胞增加,其变化趋势与P53的表达变化趋势相同.结论 在慢性低氧性肺动脉高压形成过程中,肺小动脉壁发生了增殖和凋亡,程度随低氧时间的延长而增加,同时P53表达增多,提示P53参与了慢性低氧性肺动脉高压肺小血管重建的调控.
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低氧增强巨噬细胞中脂多糖诱导的IL-1β表达
目的 探讨低氧对巨噬细胞表达IL-1β的作用及可能机制.方法 给予巨噬细胞系RAW264.7常氧(21%O2)、低氧(2%O2)、常氧联合脂多糖(LPS)培养和低氧联合LPS培养,RT-qPCR检测Vegf、Nlrp3和Il1b的mRNA水平,Western blot检测HIF-1α、NLRP3、caspase-1、cleaved caspase-1、Pro-IL-1β和IL-1β的蛋白水平;Vhlfl/fl/Apoe-/-及VhlΔMac/Apoe-/-小鼠腹腔巨噬细胞给予或不给予LPS培养,RT-qPCR检测Vhl、Nlrp3、Il1b和Il6的mRNA水平.结果 与常氧组相比,低氧仅显著升高RAW264.7 Vegf、Nlrp3和Il1b的mRNA水平(P<0.01).给予LPS培养后,与常氧组相比,低氧可进一步升高LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中NLRP3和IL-1βmRNA及蛋白水平(P<0.01),低氧联合LPS培养不能激活caspase-1及剪切Pro-IL-1β.给予LPS培养后,VhlΔMac/Apoe-/-小鼠腹腔巨噬细胞与Vhlfl/fl/Apoe-/-小鼠相比,Nlrp3、Il1b和Il6的mRNA表达水平升高更显著(P<0.05).结论 低氧可以放大巨噬细胞中LPS诱导的IL-1β表达.
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核心蛋白聚糖抑制结直肠腺癌细胞系HCT116的体外侵袭
目的探讨常氧和低氧条件下核心蛋白聚糖(DCN)对结直肠腺癌细胞系HCT116体外侵袭的作用及机制.方法Transwell法检测HCT116细胞体外侵袭能力;Real-time PCR法检测细胞CD133和TIMP-2 mRNA的表达;Western blot检测细胞HIF-1α、CD133和TIMP-2蛋白的表达.结果1)常氧和低氧环境下,DCN浓度为0、1和3 mg/L时HCT116细胞的侵袭数量分别为(241±46)、(168±46)和(51±17)个/视野(P<0.01)及(207±61)、(213±64)、(156±54)和(44±17)个/视野(P<0.01).2)在常氧条件下,DCN(3 mg/L)显著上调HCT116细胞TIMP-2 mRNA和蛋白的表达(P<0.01),而对CD133 mRNA和蛋白的表达无明显作用.3)低氧条件下DCN(3 mg/L)显著下调HCT116细胞HIF-1α/CD133/TIMP-2 蛋白的表达(P<0.01),而对CD133 mRNA的表达无明显影响.结论DCN抑制结直肠腺癌细胞HCT116体外侵袭能力,在常氧和低氧条件下可能通过不同机制发挥作用.
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低氧对人结肠癌细胞自噬相关分子表达的影响
目的 为探索低氧对 SW480细胞自噬影响的分子机制.方法 免疫磁珠分选筛选出具有干细胞特性的CD133+细胞,将SW480细胞和CD133+在低氧环境中进行培养,免疫荧光检测HIF-1α表达,Western blot检测LC3的表达,用免疫组化检测94例结直肠癌组织中HIF-2α和Beclin1的表达.结果 低氧可诱导SW480细胞内HIF-1α的表达激活.低氧时,SW480细胞与CD133+细胞内LC3的表达量均在增加,并具有时间依赖性,但是CD133+细胞中LC3Ⅰ向LCⅡ的转化不断增加,而 SW480细胞内这种转化却不断减弱.在结直肠癌组织当中,HIF-2α 和Beclin1在低分化组中的表达量均高于高分化组(P<0.05),但HIF-2α表达量在淋巴无转移组中高于淋巴转移组(P<0.05),Beclin1表达量在淋巴转移组中高于淋巴无转移组(P<0.05),在Duke、s分期的A-B期中低于C-D(P<0.01).结论 低氧可通过诱导HIF在SW480细胞中的表达,并提高LC3的表达,使大部分SW480细胞发生凋亡,但可使一小部分CD133+细胞发生自噬,保护CD133+细胞免于凋亡.
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HIF-1α基因启动子-1946位点 基因多态性与紫绀型先天性心脏病低氧耐受的相关性
目的 研究低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因多态性与紫绀型先天性心脏病(CCHD)低氧耐受能力是否具有相关性.方法 用靶向捕获技术,对97例CCHD患儿和108例非紫绀型先天性心脏病(ACHD)患儿HIF-1α基因二代测序;生物信息学分析后找出差异分布的多态位点;用Sanger测序验证.针对HIF-1α启动子区多态位点,构建不同基因型HIF-1α启动子-荧光素酶报告基因载体;转染HEK293T和H9C2细胞;用双荧光素酶报告基因检测系统,分析HIF-1α不同基因型启动子活性.结果 CCHD组HIF-1α启动子区-1946位点A碱基删除变异频率高于ACHD组(P<0.05).与AA基因型比较,DD基因型HIF-1α启动子转录活性更高(P<0.05).结论 HIF-1α基因-1946位点与CCHD耐受低氧能力相关,DD基因型HIF-1α转录活性明显增高,可能是耐受低氧的分子遗传学机制之一.
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低氧对结肠癌SW480细胞生存的影响及与细胞自噬的关系
目的 观察低氧微环境对结肠癌细胞增殖、侵袭及自噬的影响,探讨低氧对结肠癌细胞生存及与自噬的关系.方法 免疫磁珠分选CD133+细胞;Boyden小室实验研究结肠癌细胞的侵袭;透射电子显微镜(TEM)观察细胞的超微结构;MDC荧光检测自噬囊泡;联合运用流式细胞仪和锥虫蓝染色研究自噬与细胞增殖的关系.结果 Boyden小室实验中低氧微环境增加结肠癌细胞SW480进入下室的细胞数量;在实验组低氧的微环境中SW480细胞的MDC荧光强度由20.53±0.64降低至17.00±0.20,而CD133+细胞的MDC荧光强度由19.89±0.58增加至33.13±1.95(P＜0.05).锥虫蓝染色实验显示,与对照组相比,低氧微环境中SW480活细胞率随着时间的延长而降低(P＜0.05):但CD133+活细胞率无显著改变.结论 低氧可增加SW480细胞的侵袭性,细胞自噬水平下降,活细胞率降低;CD133+细胞在低氧微环境中自噬的发生增加,活细胞率基本不变.
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低氧对胎鼠中脑NSCs的促体外增殖作用
目的观察低氧对大鼠中脑神经干细胞体外增殖的影响,并探讨其增殖的可能机制.方法取孕13.5 d的Wistar大鼠,麻醉后取胚胎,分离中脑神经干细胞(NSC),常规培养鉴定后分3组:对照组;10%O2组;3%O2组.采用4孔板培养3～4 d后进行神经球记数,用流式细胞仪测定其增殖指数,后用RT-PCR方法测定低氧(10%O2)不同时间点(1、3、6、12、24、48和72 h)低氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA的表达水平.结果低氧组神经球记数和增殖指数明显高于对照组,尤以10%O2组为明显(P＜0.01);10%O2组12 h和48 h时的HIF-1α mRNA表达水平比同一时间点的对照组明显增加.结论轻中度低氧有利于NSC的体外增殖,而HIF-1可能在其中发挥了重要作用.
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芒果苷减轻低氧致原代大鼠心肌细胞的凋亡
目的 观察芒果苷对低氧诱导的原代大鼠心肌细胞凋亡的影响.方法 无菌分离、培养原代大鼠心肌细胞,对心肌细胞予以2、4、8和12 h 的低氧处理,根据心肌细胞凋亡结局确定低氧诱导的原代大鼠心肌细胞凋亡模型的低氧处理时间.将心肌细胞分为正常组、低氧组和芒果苷干预组, 每组平行做3批次实验,每批次实验平行做3个复孔.实验结束后,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率;分光光度法检测心肌细胞裂解液中凋亡蛋白酶 caspase-3和 caspase-9的活性;Western blot检测促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达水平.结果 低氧处理12 h后,低氧组较对照组心肌细 胞凋亡率显著上升(P＜0.05);凋亡蛋白酶caspase-3和caspase-9的活性均显著上升(P＜0.05);促凋亡蛋白酶Bax的蛋白表达量显著上升(P＜0.05),抑 凋亡蛋白酶Bcl-2的蛋白表达量显著下降(P＜0.05).经150μmol/L芒果苷干预后能显著缓解低氧组的各项变化.结论 芒果苷能显著减轻低氧诱导的原 代大鼠心肌细胞凋亡.
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慢性低氧性肺动脉高压大鼠肺内肺动脉中尾加压素Ⅱ的变化
本实验旨在研究尾加压素Ⅱ(uⅡ)在慢性低氧性肺动脉高压及肺血管结构重构形成中的变化.应用免疫组化技术对慢性低氧性肺动脉高压大鼠不同节段肺内动脉uⅡ蛋白表达进行定位及半定量分析.结果显示:低氧1周和2周组大鼠肺动脉平均压(mPAP)、右心室肥厚指标R/(L+S)、肺动脉相对中膜面积(RMA)和相对中膜厚度(RMT)均明显高于对照组(P＜0.001).低氧2周组大鼠各节段肺内动脉内皮细胞中uⅡ表达较对照组分别下降27.75%、32.50%、39.63%(P均＜0.01).相关分析显示:与呼吸性细支气管伴行的肺动脉内皮细胞uⅡ表达与mPAP呈显著负相关;各节段肺动脉内皮细胞uⅡ表达分别与各级肺动脉RMA、RMT呈明显负相关(P均＜0.05).研究表明:低氧性肺动脉高压及肺血管结构重构形成过程中,肺内动脉内皮细胞uⅡ表达呈现明显下调;推测uⅡ在慢性低氧性肺动脉高压形成机制中具有重要的病理生理意义.
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pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒的构建及其在MCF-7细胞中的表达
目的 构建低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒,并在MCF-7细胞中进行功能验证.方法 利用RT-PCR扩增带有Xba Ⅰ和HindⅢ酶切位点的HIF-1α编码基因,插入T载体测序正确后,克隆入pcDNA3真核表达载体,然后将其转染MCF-7细胞.Western blot和双荧光素酶报告基因法分别检测HIF-1α表达及其DNA结合活性;实时定量PCR检测HIF-1α对低氧诱导基因C-MET mRNA表达的影响;Caspase3/7活性检测来初步判断HIF-1α对低氧MCF-7细胞凋亡的影响.结果 酶切及测序结果 证明pcDNA3-HIF-1α表达质粒的DNA序列完全正确.将此质粒转染MCF-7细胞后,HIF-1α蛋白表达明显增加,它不仅增强了pGL3-EPO-HRE报告基因活性而且促进了C-MET mRNA的表达,同时还降低了低氧MCF-7细胞中Caspase3/7的水平.结论 pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒构建成功,它不但具有很强的DNA结合和诱导活性,而且在细胞低氧过程中具有一定的抗凋亡作用.
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肾上腺髓质素缓解大鼠低氧性肺动脉高压
目的 探讨肾上腺髓质素(ADM)对大鼠低氧性肺动脉高压的防治作用及机制.方法 雄性Wistar大鼠18只,分为对照组、低氧组和低氧+ADM组,每组6只.持续皮下注射ADM1-50后,测定平均肺动脉压(mPAP)、右心室肥大指数RV/(LV+S)、肺小动脉病理及形态计量学和体循环平均压(mSBP),放免法测定肺动脉血浆ADM水平,原位杂交测定肺动脉ADMR mRNA的表达.结果 ①低氧组大鼠mPAP,RV/(LV+S),管壁厚度与血管外径比值(MT%)及管壁面积与血管面积比值(MA%)均显著升高(P＜0.01);ADM组显著缓解以上变化(P＜0.01).②低氧组与低氧+ADM组肺动脉血浆ADM浓度均高于对照组,且低氧+ADM组较低氧组ADM浓度低(P＜0.05).③低氧组与低氧+ADM组的ADMR mRNA表达较对照组增强(P＜0.01).结论 持续皮下注射ADM对慢性低氧所致的肺动脉高压及肺血管重塑有预防和部分逆转作用.
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低氧微环境下胶质瘤干细胞表型的改变与RNA结合蛋白相关
目的 研究低氧微环境下胶质瘤干细胞表型变化与RNA结合蛋白表达之间的关系.方法1% O2的低氧条件培养胶质瘤干细胞U87MG-SLC和GSC5,20% O2为常氧对照.分别利用MTS实验和肿瘤球形成实验检测其增殖能力和自我更新能力;Western blot检测干性相关蛋白和RNA结合蛋白表达水平的变化;通过吸光度扫描进行统计分析.结果 低氧条件下肿瘤干细胞的增殖能力下降(P<0.05),自我更新能力上升(P<0.05),HIF-1α和干性标志物Nestin和SOX2上调(P<0.01;P<0.05).与常氧组相比,低氧组胶质瘤干细胞的多种RNA结合蛋白表达水平发生变化:hnRNPF、UNRIP以及HuD表达水平上调(P<0.05),PCBP2和UNR表达水平下调(P<0.01;P<0.05),而其他RNA结合蛋白(hnRNPK、ADAR1、PCBP1、CIRP、EBP1、eEF1A、PTBP1、PTBP2)表达水平没有显著性变化.结论 低氧微环境下,胶质瘤干细胞的表型变化与RNA结合蛋白hnRNPF、UNRIP、HuD、PCBP2和UNR表达水平相关.
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低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞血红素加氧酶-1 mRNA 表达及细胞增殖的影响
探讨血红素加氧酶-1(HO-1)mRNA在低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的表达及HO-1/一氧化碳(HO-1/CO)体系对PASMC增殖的影响.应用荧光定量RT-PCR法测定HO-1 mRNA表达.用双波长法检测碳氧血红蛋白(HbCO)吸光值.应用免疫细胞化学方法检测细胞增殖核抗原(PCNA)及核转录因子-κB(NF-κB)的表达.发现HO-1 mRNA在常氧大鼠PASMC有低水平的表达,低氧12h HO-1 mRNA水平是常氧时的1.5倍,且HbCO产量随之显著增高(P＜0.01);低氧24h HO-1 mRNA表达呈回落趋势,HbCO产量亦有所减少,但两者仍高于常氧水平.低氧12h及24h PASMC PCNA核阳性反应颗粒表达较常氧时增强(P＜0.01,P＜0.001),使用HO抑制剂ZnPP-9,其PCNA核阳性反应颗粒表达较单纯低氧时增加更多(P＜0.001,P＜0.01).低氧组核NF-κB阳性染色较常氧组增强(P＜0.001),使用ZnPP-9,其表达则比低氧时更多(P＜0.01).低氧通过诱导大鼠PASMC的HO-1 mRNA基因表达,上调HO/CO体系活性,使内源性CO含量增高,抑制PASMC增殖;NF-κB参与了PASMC增殖的调控机制.
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ERK和P38MAPK升高MLC20磷酸化调节大鼠平滑肌低氧反应性
目的 研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)亚类ERK、P38 MAPK和JNK在低氧血管平滑肌收缩反应性调节中的作用,并从肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化的钙敏感性调节途径上初步探讨其机制.方法 用低氧培养血管平滑肌细胞(VSMC)模型和大鼠失血性休克模型,用荧光法检测VSMC收缩反应,用Western blot检测血管平滑肌MLC20磷酸化水平,用离体血管张力测定技术观察休克血管钙敏感性.结果 低氧损伤使VSMC对去甲肾上腺素(NE)诱导的收缩反应性明显降低,同时休克血管平滑肌MLC20磷酸化水平和血管钙敏感性降低;给予具有MAPK激动作用的AngⅡ处理可恢复低氧VSMC的收缩反应性、升高休克血管MLC20磷酸化水平和钙敏感性.PD98059(ERK抑制剂)、SB203580(P38 MAPK抑制剂)和SP600125(JNK抑制剂)均可拮抗AngⅡ诱导低氧VSMC反应性升高的作用;同时ERK和P38 MAPK的抑制剂也拮抗了AngⅡ诱导的休克血管MLC20磷酸化水平和钙敏感性升高,而JNK抑制剂无明显作用.结论 ERK、P38 MAPK和JNK都参与了低氧VSMC收缩反应性的调节,其中ERK和P38MAPK的作用机制可能与MLC20磷酸化的钙敏感性调节途径有关,而JNK可能通过其他途径发挥调节低氧VSMC反应性的作用.
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急性重复低氧对小鼠脑组织中糖酵解和线粒体氧化磷酸化以及能量负荷的影响
目的 探讨小鼠在重复急性低氧暴露后脑组织中的糖酵解、线粒体氧化磷酸化及能量负荷的变化.方法 成年BALB/c小鼠重复低氧暴露5次,测定每次低氧暴露时的平均耐受时间、体温及第0、1、3、5次低氧暴露后脑组织中的磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)、线粒体复合体Ⅰ活性和磷酸腺苷水平.结果 重复低氧暴露使小鼠低氧耐受性增强,体温降低,脑组织中PFK和PK活性先增高后降低,复合体Ⅰ活性持续降低,能量负荷保持稳定.结论 重复急性低氧使小鼠脑组织的糖酵解活性出现规律性变化,线粒体的氧化磷酸化受抑制,但能量负荷保持稳定.
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低氧促进P19细胞向多巴胺能神经元分化
目的 观察低氧对P19细胞神经分化的影响,针对其向多巴胺能神经元分化的现象及机制进行探讨.方法 实验分为常氧组(20%O2)和低氧组(3%O2,每天低氧10 min).对诱导分化的神经元采用免疫细胞化学染色方法鉴定.用流式细胞术及Western blot检测多巴胺能神经元,高效液相色谱法测定分泌的多巴胺.用RT-PCR技术检测低氧诱导因子HIF-1 α mRNA水平.结果 ①在分化的P19细胞中,低氧组神经元含量高于常氧组(P＜0.05),低氧组多巴胺能神经元含量及所分泌的多巴胺显著高于常氧组(P＜0.001);②低氧组诱导期HIF-1 α mRNA表达水平明显高于常氧组.结论 低氧可以促进P19细胞的神经分化,尤其促进P19细胞向多巴胺能神经元分化,HIF-1α可能在其中起了一定作用.
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Annexin V在低氧滋养细胞中的表达下调
目的 探讨膜联蛋白V( Annexin V)在体内低氧滋养细胞中的表达及其意义.方法 采用免疫组化、流式细胞术等实验技术测定低氧滋养细胞内膜联蛋白V的表达.结果 1)体内低氧状态下滋养细胞Annexin V的表达显著低于正常滋养细胞.2)体外实验显示随着Annexin V浓度的增加,其抗凝功能呈梯度性变化.结论 低氧滋养细胞中Annexin V表达呈明显下调,可能影响胎盘滋养细胞的生理功能,导致多种不良妊娠结局.
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内源性一氧化碳对低氧大鼠肺动脉胶原代谢的影响
探讨内源性一氧化碳(CO)对低氧大鼠肺动脉胶原代谢的作用及其机制.采用常压低氧大鼠肺动脉高压模型,观察血红素加氧酶(HO)抑制剂锌原卟啉-9(ZnPP-9)对肺动脉平均压(PAMP)和肺组织匀浆碳氧血红蛋白(HbCO)含量的影响, 并用免疫组织化学和核酸原位杂交法分别观察Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达和肺动脉Ⅲ型前胶原[Proα1(Ⅲ) 胶原]mRNA、间质性胶原酶(MMP-1)mRNA、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP) mRNA表达的变化.结果发现ZnPP-9使低氧大鼠PAMP明显升高,肺组织匀浆CO含量明显降低;ZnPP-9显著促进低氧大鼠肺动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达(P＜0.01) 和Proα1(Ⅲ) 胶原mRNA表达及MMP-1mRNA与TIMP-1mRNA表达(P＜0.01).内源性CO可能通过抑制胶原蛋白的合成对低氧大鼠肺动脉胶原代谢发挥重要的调节作用.
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低氧促进兔骨髓间充质干细胞增殖
目的 观察低氧/常氧间传代培养对兔骨髓间充质干细胞(rMSCs)增殖的影响.方法 将在5%O2下扩增的细胞接种后,或继续在5%O2下培养,记为L-L;在20%O2下培养,记为L-N;对20%O2下扩增的细胞作同样的处理,分别记为N-N和N-L.取各组细胞进行生长曲线、集落形成率、葡萄糖乳酸代谢和胞内ROS的测定.结果 L-L组的细胞数和集落形成率高,N-N组低,而胞内ROS的水平则与此相反.低氧下培养的MSCs葡萄糖比消耗速率和乳酸比生成速率较高,乳酸对葡萄糖的得率大于2.0 mmol/mmol.结论 持续低氧传代培养促进rMSCs的增殖;低氧对MSCs增殖的影响与胞内ROS的表达密切相关.
