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铝盐对乳鼠神经细胞膜ATPase活力的影响
铝是公认的慢性蓄积性神经毒物,它在老年性神经退行性疾病的毒作用已受广大学者的关注[1-4],但铝(主要形式为Al3+)是如何发挥其毒性作用的,目前尚少见报道.膜毒理是从亚细胞水平阐明毒作用机制的一个重要环节,本研究采用体内实验从铝盐对乳鼠神经细胞膜酶的相互作用后活力变化,初步探讨铝神经毒作用的机制.
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Nec-1对铝致神经细胞凋亡和自噬的作用
目的 观察和探讨在铝致神经细胞死亡中,坏死抑制剂1(Nec-1)对凋亡和自噬的作用.方法 用体外原代培养小鼠神经细胞的方法,制造铝损伤神经细胞模型,然后用细胞活力检测、荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白印迹(Western-Blot)以及流式细胞术等方法从多角度对Nec-1的作用进行研究.结果 ①流式结果显示,在Al3+(2 mmol/L)作用于神经细胞后,随着Nec-1剂量的增加,细胞的凋亡率呈下降趋势,且差异有统计学意义(P<0.05);②qRT-PCR结果显示,以Al3+(2 mmol/L)为对照,Nec-1(60和90 μmol/L)可使神经细胞的凋亡和自噬相关基因的表达呈显著性下降(P<0.05);③Western-Blot结果显示,同Al3+(2 mmol/L)组比,Nec-1(60和90 μmol/L)组凋亡相关蛋白caspase-3的表达下降(P<0.01),Nec-1(30和60 μmol/L)可使自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达下降(P<0.05).结论 在本试验条件下,Nec-1可减少铝导致的神经细胞凋亡和自噬,起到保护神经细胞的作用.
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慢性氯化铝染毒对大鼠大脑皮层内钙稳态影响
目的研究铝对大鼠大脑皮层细胞内游离钙([Ca2+]i)质量浓度的影响,探讨铝的神经毒性的机制.方法应用248.7、74.7和37.3 mg/kg AlCl3对Wistar大鼠经口灌胃染毒,分别在染毒45、75和120 d和染毒结束后30 d处死大鼠,取脑分离大脑皮层.将荧光染料Fura-2/AM与皮层细胞一起孵育,应用荧光分光光度计测定[Ca2+]1质量浓度.应用Western Blot方法测定各组大鼠脑皮层中钙调蛋白(CaM)和钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达情况.结果在染毒45、75和120 d时,74.7 mg/kg剂量组大鼠[Ca2+]i质量浓度为(273.8±91.2)、(308.0±96.9)和(453.0±90.5)nmol/L,均显著高于对照组(P＜0.05);染毒120 d时,高剂量组大鼠大脑皮层[Ca2+]i质量浓度为(445.5±68.8)nmol/L,显著高于对照组(P＜0.01);染毒结束后30 d,各染毒组大鼠大脑皮层[Ca2+]i质量浓度高于对照组大鼠,但差异无显著性(P＞0.05).染毒45、75和120 d时,各染毒组大鼠大脑皮层中CaM表达与对照组相比均减少.各染毒组大鼠大脑皮层中CaMKⅡ表达与对照组相比,在不同染毒时期内均有不同程度上升.结论 AlCl3可以增加皮层神经细胞内[Ca2+]i质量浓度,同时引起CaM表达减少和CaMKⅡ表达增加,可见铝可使神经细胞内钙稳态失调而发挥神经毒作用.
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氯化铝致神经母细胞瘤细胞不同死亡的方式及意义
目的 研究铝诱导的神经母细胞瘤细胞的死亡方式及途径,探讨其毒理学及在神经细胞退行性变中的意义.方法 用铝染毒神经母细胞瘤细胞株制作铝致神经细胞损伤模型,在铝和Nec-1处理后用光学显微镜观察细胞的生长状况,CCK-8法检测细胞的活力变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡率、坏死率、线粒体膜电位和活性氧含量,电子显微镜观察细胞的超微结构变化.蛋白质印迹(Western blot)法检测LC3蛋白表达量.结果 铝染毒神经母细胞瘤细胞形态学观察结果 表明,凋亡与坏死并存于染铝细胞中;流式细胞术定量检测铝染毒后细胞的凋亡率和坏死率均显著升高(P<0.05,P<0.01).超微结构显示有凋亡早期和晚期典型的核凝聚和多量典型双层膜结构的自噬小体.铝染毒SH-SY5Y细胞中加入Nec-1后,可以有效地降低细胞的坏死率(P<0.05,P<0.01),显著降低线粒体的膜电位(P<0.05,P<0.01),有效减少自噬体的形成及发展,且与细胞的自噬过程有关.Western blot结果 显示LC3蛋白表达量随Nec-1(0～90 μmol/L)作用浓度的提高而显著下降(P<0.05,P<0.01).绪论铝诱导的神经母细胞瘤细胞的死亡方式不仅包括传统的凋亡和坏死,自噬和程序性坏死也存在于其中,这可能与铝致神经退行性变的细胞丢失方式有关.
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铝染毒对大鼠大脑皮层Ryr2和L-Ca2+α1c基因表达的影响
目的 研究铝对大鼠大脑皮层细胞中Ryanodine受体2(ryanodine receptor,Ryr2)和L-型钙通道α1C亚基(α1Csubunit of L-type calcium channels,L-Ca2+α1C)基因表达的影响,探讨铝对细胞内钙浓度改变的机制.方法 健康Wistar大鼠随机分为4组,分别按照大鼠氯化铝经口LD50的1/15 LD50(248.7 mg/kg)、1/50 LD50(74.7 mg/kg)、1/100 LD50(37.3mg/kg)给予灌胃染毒,同时设立阴性对照组(蒸馏水).连续灌胃120 d,分别在染毒45、75和120 d和染毒结束后30 d处死4只实验动物,取大脑皮层.应用荧光定量链式反应(RT-PCR)方法 ,检测各组动物皮层中Ryr2和L-Ca2+α1C基因表达情况.结果 染毒大鼠大脑皮层中Ryr2 mRNA表达显著高于对照组;各组动物大脑皮层中Ryr2 mRNA表达均随时间延长而增高;染毒大鼠大脑皮层细胞中L-Ca2+α1c mRNA表达在不同染毒时期均高于对照组;各组动物大脑皮层中L-Ca2+α1c mRNA表达均随时间延长而降低.结论 铝可引起大脑皮层中Ryr2和L-Ca2+α1c基因表达的增加,而增加细胞内游离钙浓度,从而发挥神经毒性作用.
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慢性染铝大鼠海马 PKC、MAPK活力与LTP的相关性
目的 研究慢性铝暴露引起大鼠海马蛋白激酶C(PKC)、有丝分裂激活蛋白激酶(MAPK)活力的变化,对海马齿状回(CAI区)产生长时程增强(LTP)幅值改变的调节作用,探讨铝暴露对学习记忆功能的影响.方法 选择断乳后Wistar大鼠,随机分4组(1个对照组,3个染毒组),每组20只,染毒组大鼠分别喂食质量浓度为0.2%、0.4%和0.6%氯化铝的水,饲养3个月后,测量大鼠海马LTP,用改良的Takai法测定PKC、MAPK活力的变化.结果 3个浓度的染铝,PKC的活力均依浓度依赖方式被抑制,细胞浆比活力的倍数分别为:4.95±0.76、5.31±0.90、5.50±1.46(P＜0.01);细胞膜为9.84±3.84、8.35±2.32、7.56±2.06(P＜0.01).MAPK活力依浓度依赖方式被抑制,比活力的倍数分别为:3.43±0.91、2.53±1.21和2.64±0.55(P＜0.05).结论 慢性铝暴露引起PKC及ERK活力降低,导致大鼠海马LTP幅值下降.
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三氯化铝染毒对小鼠骨骼和牙的影响
目的 探讨过量铝对小鼠骨骼和牙的毒性,分析骨组织病变特征及其作用机制.方法 将昆明种小鼠随机分成3组,低铝组和高铝组分别用200、600mg/L AlCl3经饮水染毒,对照组用自来水,24周后观察小鼠斑釉牙发生情况并分度,采集血清和尿液,测定骨代谢标志物血清碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、甲状旁腺素(PTH)、Ca、P、Mg及尿Ca、P.观察长骨干骺端病理变化,图像分析仪测量骨小梁面积、类骨质面积,计数成骨细胞和破骨细胞个数.结果 铝处理组小鼠牙面出现明显斑釉牙特征,高铝组分度高于对照组(t=5.11,P<0.01).铝处理组血清钙和骨钙素均降低(F=8.91、11.82,P<0.01),骨组织病理学改变为骨组织矿化骨形成减少,类骨质和软骨增生,骨质疏松明显.形态计量学研究显示高铝组成骨细胞数增多.结论 高剂量的铝可引起斑釉牙.慢性铝中毒可通过抑制骨形成及矿化过程而影响骨转换,终导致骨软化型骨质疏松的发生.
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内质网在铝致神经细胞凋亡过程中的作用
目的 探讨内质网在铝致神经细胞凋亡过程中的作用.方法 体外培养0～3 d新生大鼠的神经元细胞并用不同剂量氯化铝(AlCl3)染毒.(1)在光学显微镜和电子显微镜下观察神经元的凋亡和内质网的形态学改变;(2)测定凋亡相关蛋白Caspase和Ctyc在内质网的含量变化.结果 (1)光学显微镜和电子显微镜形态学观察发现了凋亡的典型形态学改变,电子显微镜下可观察到内质网的变形肿胀及脱颗粒现象.(2)凋亡相关蛋白Caspase的含量随染毒剂量的加大而上升,二者具有相关性;在染毒后可检测到Ctyc由内质网释放到胞浆的过程.结论 铝能诱导神经元凋亡,内质网在凋亡过程中发挥了重要的调控作用.
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铝对大鼠海马神经细胞线粒体酶的影响
目的探讨线粒体酶在铝致大鼠凋亡神经细胞中的改变.方法健康雄性SD大鼠40只,按体重随机分为4组:生理盐水、Al3+2.5、5、10 mg/kg组.腹腔注射染毒60d后处死,用TUNEL法检测细胞凋亡,电镜观察线粒体结构的改变,用试剂盒测定线粒体超氧化物歧化酶(SOD),琥珀酸脱氢酶(SDH),三磷酸腺苷(ATP)酶(总ATP、Na+-K+ATP,Ca2+ATP和Mg2+ATP酶)活力.结果随染铝剂量的增高,凋亡指数(AI)逐渐升高(P<0.05),Na+-K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶和SOD均降低(P<0.05);海马神经细胞SDH均数降低,但差异无显著性(P>0.05).海马神经细胞凋亡指数与Na+-K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶和SOD呈负相关(r=-0.439,-0.501,-0.530,-0.815,P<0.05),与SDH没有相关性(r=0.287,P>0.05).结论铝可以诱导大鼠海马神经细胞凋亡,并引起线粒体结构和线粒体酶活力的改变.
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慢性铝染毒对大鼠海马细胞内[Ca2+]i和CaMKⅡ蛋白表达的影响
目的 通过进一步研究慢性铝暴露引起大鼠海马细胞内[Ca2+]i和钙调蛋白激酶激酶Ⅱ(CaM Ⅱ)蛋白表达的变化,来探讨铝损害学习记忆的作用机制.方法 选择断乳后Wistar大鼠,以含有不同浓度AlCl3的水进行饲养.3个月后,取海马测定细胞内[Ca2+]i,用Western blotting方法检测CaMK Ⅱ的蛋白表达.结果 (1)各染铝组的[Ca2+]i与对照组比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),但各染铝组间差异无统计学意义;(2)各染铝组CaMKⅡ蛋白表达与对照组比较也显著降低,并成剂量关系,差异有统计学意义(P<0.01).结论 铝能够降低大鼠海马细胞内的[Ca2+]i浓度并造成CaMKⅡ]的蛋白表达降低,从而损伤学习记忆功能.
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氯化铝对大鼠皮层神经元凋亡及bcl-2、bax基因表达的影响
目的探讨氯化铝(AlCl3)对大鼠皮层神经元凋亡的诱导作用及对bcl-2、bax基因表达的影响.方法体外原代无血清培养至第7天的大鼠皮层神经元,实验组的培养液中加入A1C13(终浓度分别为10、100、1000μmol/L),对照组的培养液中加入等体积分数为0.9%的生理盐水,培养48 h后,用原位末端标记法(TUNEL)测定其细胞凋亡率;培养24h后,用RT-PCR法检测bcl-2、bax基因的表达.结果各染铝组大鼠皮层神经元凋亡率明显升高,与对照组相比,差异有显著性(P＜0.05),并具有明显的剂量-反应关系;bcl-2基因表达明显下降,bax基因表达明显升高,bcl-2/bax逐渐下降,与对照组相比,差异有显著性,也具有明显的剂量-反应关系.相关分析表明,大鼠皮层神经元凋亡率与bcl-2基因表达呈负相关,与bax基因表达呈正相关,而与bcl-2/bax呈负相关(P＜0.01).结论铝可以诱导大鼠皮层神经元凋亡,其机制可能与bcl-2基因表达下调,bax基因表达上调以及bcl-2/bax下降有关.
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铝暴露对海马LTP及PKC生物活力的影响
学习记忆能力是人类思维活动的基本环节,对人类智慧的形成、意识的产生、知识的积累和科学文化的发展都起着关键的作用,因此,对学习与记忆的研究已成为当今神经科学的热点问题之一.海马是学习记忆的关键部位之一,其突触传递长时程增强(long-term potentiation,LTP)是研究学习记忆的一个可用电生理模型,动物行为实验的研究显示蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)和学习与记忆也有密切关系.但学习与记忆经常会受各种因素影响而发生障碍,现仅就铝暴露对海马LTP及PKC生物活性影响作一简要综述.
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染铝对大鼠大脑皮层中CaM和CaMKⅡ蛋白表达影响
目的研究铝对大鼠大脑皮层CaM和CaMKⅡ蛋白表达影响,探讨铝的神经毒性的机制.方法应用248.7、74.7和37.3 mg/kg AlCl3对Wistar大鼠经口灌胃染毒,分别在染毒45、75和120 d和染毒结束后30 d处死大鼠,取脑分离大脑皮层.应用Western Blot方法测定各组大鼠脑皮层中钙调蛋白(CaM)和钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达情况.
关键词： 铝 钙调蛋白 钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ 大鼠 皮层 -
氟铝联合对MC3T3-E1细胞Runx2、Osterix mRNA表达的影响
目的 观察氟铝单独及联合对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1细胞增殖、分化及Runx2、Osterix mRNA表达的影响.方法 在细胞培养液中加入50μmol/L氟化钠或/和5μmol/L氯化铝,观察MC3T3-E1细胞增殖和分化能力,用RT-PCR法测定MC3T3-E1细胞Runx2和Osterix mRNA表这的情况.结果与对照组相比.氟铝联合染毒可显著提高MC3T3-E1细胞增殖和分化能力(P<0.05),MC3T3-E1细胞Runx2和Osterix mRNA的表达水平也显著提高(P<0.05),且氟铝具有协同作用(P<0.05).结论 氟铝联合通过刺激成骨细胞增殖、分化,提高成骨细胞Runx2和Osterix基因表达水平,从而促进骨形成.
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铝对体外培养大鼠神经元线粒体的影响
目的通过体外培养大鼠神经元细胞来探讨铝对大鼠神经元线粒体的影响.方法取新生1～3d SD大鼠脑皮质进行神经元细胞的培养,用透射电镜观察神经细胞线粒体超微结构的变化,用流式细胞仪检测神经细胞的死亡率、活性氧的生成和线粒体膜电位的改变;用MTT[3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide]试验来检测体外培养神经元线粒体酶的活性.结果 Al3+10mg/kg染铝组大鼠神经元线粒体超微结构发现,线粒体普遍肿胀,内膜嵴断裂,可见空泡形成.严重者线粒体内部结构模糊,只残留线粒体轮廓.不同剂量铝对神经元线粒体的氧化损伤结果显示,与对照组相比,Al3+ 100μmol/L组和Al3+ 500μmol/L组ROS生成量显著增加(P<0.01);Al3+ 500μmol/L组细胞死亡率明显增加(P<0.01);Al3+ 100μmol/L组和Al3+ 500μmol/L组线粒体膜电位(MMP)明显降低(P<0.01);Al3+500μmol/L组线粒体酶活力明显降低(P<0.01).结论神经元线粒体的形态结构和功能的改变可能在铝的神经毒作用机制中发挥了重要作用.
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天麻对铝致大鼠学习记忆障碍的影响
目的探索天麻改善铝致大鼠学习记忆障碍的作用机理.方法将SD大鼠36只在动物室适应性喂养一周后,分成6组,腹腔注射生理盐水或AlCl3溶液0.2ml/d,每连续注射3天间歇1天,60天内共计注射45次.在间歇天肌肉注射青链霉素以抗感染.所有动物饲以普通饲料,自由饮水和进食,加天麻组,以0.4g/kgBW的剂量在饮水中加入天麻.每周定时称体重一次,调整铝(Al)的浓度和饮水中天麻的浓度.染毒期结束后,用跳台实验法测大鼠的学习记忆成绩;然后取脑皮质,测定脑铝,做匀浆测定皮质中AChE和MAO-B的活力.结果与生理盐水组相比,Al3+5mg/kg组脑铝含量升高(P＜0.01)、ENl增加(P＜0.05)、潜伏期缩短(P＜0.01);AChE活力降低(P＜0.05)、MAO活力升高(P＜0.01);Al3+10mg/kg组脑铝含量升高(P＜0.01);EN1和EN2均明显增加(P＜0.01)、潜伏期明显缩短(P＜0.01);AChE活力降低(P＜0.01),MAO活力升高(P＜0.01).与Al3+5mg/kg组相比,Al3+5mg/kg+天麻组大鼠EN1减少(P＜0.05),潜伏期延长(P＜0.05);AChE活力显著升高(P＜0.05)、MAO活力显著降低(P＜0.01).与Al3+10mg/kg组相比,Al3+10m/kg+天麻组大鼠EN1和EN2均明显减少(P＜0.01),潜伏期延长(P＜0.01);AChE活力增高(P＜0.01),MAO活力降低(P＜0.01).结论天麻不能降低脑铝含量,其改善大鼠学习记忆障碍的作用之一是通过作用于胆碱能系统和单胺类递质系统来实现的.
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铝电解工神经行为、自主神经功能的改变
为探讨职业性铝接触对作业工人神经系统功能的损害,采用世界卫生组织推荐的神经行为测试组合(NCTB)以及Ewing DJ推荐的自主神经功能测试组合对铝厂电解车间32名工人和34名无职业性接触的面粉厂扛包工进行测试.结果表明:铝电解工人的消极情感困惑-迷茫和紧张-焦虑的得分较对照组明显增加;而愤怒-敌意、忧郁-沮丧、疲惫-惰性和有力-好动的得分没有明显改变.数字译码数和目标追踪的打点数比对照组降低,而数字广度、提转捷度和视觉保留时的得分两组未见显著性差异.自主神经功能测试中反映副交感神经调节功能的R-R间隔的变化能力降低. 提示电解接触铝对作业工人的情感状态、神经行为和副交感神经的调节功能均产生了明显的负面影响.
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铝对原代培养神经细胞线粒体氧化功能的损伤
目的通过测定不同浓度铝对原代培养的神经细胞线粒体的氧化功能的损伤以探讨铝神经毒作用的可能机理.方法采用原代培养的神经细胞,以不同浓度进行体外三氯化铝染毒,测定细胞的死亡率、线粒体酶活力、线粒体活性氧含量和线粒体膜电位,衡量铝对线粒体氧化功能的损伤.结果随着三氯化铝体外染毒剂量(0μmol/L、 50μmol/L、100μmol/L、500μmol/L)的增加,细胞的死亡率分别为(10.53%、11.99%、12.03%、25.00%)、线粒体酶活力分别为0.56、0.47、0.42和0.32、线粒体活性氧含量分别为17.12、19.71、29.67和45.46、线粒体膜电位分别为8.03、8.02、4.69和3.01.结论铝对大鼠皮层神经细胞线粒体氧化功能的损伤是其毒作用机制之一.
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铝对大鼠神经细胞数目及颗粒空泡变性的影响
给SD大鼠腹腔注射氯化铝溶液60天,研究不同剂量铝对神经行为以及各脑区神经细胞数和海马颗粒空泡变性(GVD)的影响.穿梭箱实验和敞箱行为实验表明,按体重腹腔注射 4.0 mg/kg和10.0 mg/kg可使大鼠主动回避反应能力和自发活动显著下降.光镜下对HE染色的大脑顶叶、小脑和海马切片进行神经细胞计数,发现腹腔注射10.0 mg/kg可使大脑顶叶椎体层椎体细胞、海马椎体细胞数和小脑浦肯野细胞数显著减少.光镜下发现各组海马神经细胞均发生GVD,腹腔注射4.0 mg/kg和10.0 mg/kg组GVD细胞数有明显增加;各组GVD细胞阳性率与铝剂量有显著相关性.本结果进一步证实了铝的神经行为毒性,并提示该毒性与铝导致神经细胞数减少有关.
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MAPK信号通路在铝致SH-SY5Y细胞死亡中的作用
目的 研究铝致人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)死亡过程中MAPK信号通路的作用,探索铝致神经细胞死亡的机制.方法 用4 mmol/L的AlCl3 ·6H20染毒SH-SY5Y细胞模拟铝致神经细胞死亡模型,用凋亡的特异性阻断剂zVAD-fmk(20 μmol/L)抑制凋亡发生,用程序性坏死的特异性阻断剂necrostatin-1(Nec-1,60μmol/L)抑制程序性坏死发生,用CCK-8检测不同组间细胞活力的变化,用流式细胞术检测凋亡率及坏死率的差异,用蛋白印迹法检测MAPK信号通路蛋白磷酸化水平的改变.结果 与空白对照组、溶剂对照组、zVAD-fmk对照组和Nec-1对照组相比,染铝组、凋亡抑制组和程序性坏死抑制组的细胞活力下降(P＜0.05);与染铝组相比,程序性坏死抑制组和凋亡抑制组的细胞活力上升(P＜0.05).与空白对照组、溶剂对照组、zVAD-fmk对照组和Nec-1对照组相比,染铝组、凋亡抑制组和程序性坏死抑制组的凋亡率和坏死率上升(P＜0.05);与染铝组相比,凋亡抑制组和程序性坏死抑制组的凋亡率和坏死率下降(P＜0.05).与空白对照组、溶剂对照组、zVAD-fmk对照组和Nec-1对照组相比,染铝组、凋亡抑制组和程序性坏死抑制组p38磷酸化水平升高,ERK磷酸化水平下降(P＜0.05);与染铝组相比,程序性坏死抑制组的p38磷酸化水平下降,ERK磷酸化水平上升(P＜0.05).结论 MAPK信号通路中的p38和ERK信号通路参与了铝致SH-SY5Y细胞程序性坏死,ERK信号通路参与了铝致SH-SY5Y细胞凋亡,而JNK信号通路未参与铝致SH-SYSY细胞死亡.
