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铝对原代培养神经细胞线粒体氧化功能的损伤
目的通过测定不同浓度铝对原代培养的神经细胞线粒体的氧化功能的损伤以探讨铝神经毒作用的可能机理.方法采用原代培养的神经细胞,以不同浓度进行体外三氯化铝染毒,测定细胞的死亡率、线粒体酶活力、线粒体活性氧含量和线粒体膜电位,衡量铝对线粒体氧化功能的损伤.结果随着三氯化铝体外染毒剂量(0μmol/L、 50μmol/L、100μmol/L、500μmol/L)的增加,细胞的死亡率分别为(10.53%、11.99%、12.03%、25.00%)、线粒体酶活力分别为0.56、0.47、0.42和0.32、线粒体活性氧含量分别为17.12、19.71、29.67和45.46、线粒体膜电位分别为8.03、8.02、4.69和3.01.结论铝对大鼠皮层神经细胞线粒体氧化功能的损伤是其毒作用机制之一.
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两种方法提取乳鼠神经细胞建立缺氧/复氧损伤模型的研究
目的 比较两种不同方法培养乳鼠神经细胞稳定性,并探讨H2O2对原代培养神经细胞造成缺氧/复氧损伤模型的佳处理时间.方法 两种方法培养原代神经细胞,加入600 μmol/L H2O2培养50 min、2h、3h后换正常培养液继续培养18 h,造成神经细胞缺氧/复氧损伤.MTT法检测各组细胞生存率,检测LDH活性、SOD、MDA含量和RhoA活性.结果 与空白组相比,缺氧50 min、2h、3h培养各组细胞存活率下降,LDH活性增加,SOD含量下降,MDA含量升高,RhoA含量增加P均＜0.05.与直接法组相比,种植法组细胞在缺氧50 min、2h各组细胞存活率高,细胞LDH漏出少,SOD含量高,MDA生成少P均＜0.05.结论 与直接法相比,种植法培养的神经细胞状态更稳定,缺氧50 min、复氧18 h时制作神经细胞损伤模型接近体内缺氧损伤状态,可用于实验.
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携强绿色荧光蛋白重组慢病毒的构建及其在原代培养SD大鼠皮层神经细胞中的表达
目的:构建携带强绿色荧光蛋白的重组慢病毒(Lent/EGFP),感染原代培养SD大鼠皮层神经细胞,观察其感染能力及报告基因的表达水平.方法:采用PCR方法克隆EGFP cDNA将EGFP基因片段亚克隆到慢病毒穿梭质粒多克隆位点内;用4质粒共转染系统在293ET细胞中包装出携带EGFP基因的重组慢病毒Lent/EGFP;重组病毒感染NIH 3T3细胞,FACS检测重组病毒滴度;Lent/EGFP感染体外培养的原代SD大鼠皮层神经细胞,共聚焦荧光纤维镜观察原代神经细胞内绿色荧光蛋白的表达情况.结果:基因测序证明克隆的EGFP cDNA与GenBank提供的序列完全一致;琼脂糖凝胶电泳结果证实EGFP正确插入pLenti6/V5TOPO;FACS检测病毒滴度为2×106;在体外分离培养的原代SD大鼠皮层神经细胞中,重组病毒感染72 h后可见较强的绿色荧光蛋白表达.结论:采用改良的4质粒共转染方法成功构建了携EGFP的重组慢病毒载体;Lent/EGFP对非分裂的神经细胞具有较强的感染能力,且携带的EGFP基因可以在神经细胞内有效表达.
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绞股蓝皂甙抗谷氨酸诱导的氧化性神经毒性
目的:探讨绞股蓝皂甙(gypenoside,GP)对谷氨酸(glutamate,Glu)介导的氧化性神经毒性的拮抗作用.方法:体外培养胎鼠大脑皮层神经细胞,建立Glu氧化性损伤模型,用MTT法测定细胞活力,透射电镜观察Glu所致的神经细胞死亡方式,流式细胞术分析细胞凋亡率.结果:GP以时间依赖性方式明显拮抗谷氨酸介导的氧化性神经毒性,于Glu损伤前达到佳保护效果,Glu氧化性毒性导致神经细胞发生凋亡兼具坏死特征的死亡,Glu损伤组细胞凋亡率(21.63%)明显高于正常对照组(0.09%)及GP保护组(8.94%).结论:GP可明显拮抗Glu介导的氧化性神经毒性.
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绞谷蓝皂苷含药血清对谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用
目的 研究绞股蓝皂苷(gypenosides,GP)含药血清对谷氨酸(glutamic acid ,Glu)诱导的氧化性神经损伤的保护作用.方法 采用中药血清药理学方法,收集GP含药血清,以体外培养的胎鼠大脑皮层神经元为研究对象,采用倒置相差显微镜观察细胞形态;MTT法测定细胞存活率;Ho33342/PI荧光双染法鉴定细胞死亡方式;生化法检测细胞内超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase,SOD)活性和谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH)含量;流式细胞仪测细胞内游离Ca2+变化,综合评价GP含药血清对谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用.结果 谷氨酸可导致神经细胞发生凋亡和坏死;GP含药血清能明显拮抗谷氨酸的细胞损伤作用,提高细胞的存活率,维持细胞内较高GSH含量和SOD活性,抑制细胞内游离Ca2+浓度的升高.结论 GP含药血清能明显拮抗Glu诱导的氧化性神经毒性,以400 mg· kg-1·d-1GP灌胃含药血清作用显著.
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AβOs对大鼠原代海马神经细胞丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路的影响
目的:观察β-淀粉样蛋白寡聚体(AβOs)对原代培养大鼠海马神经细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的影响.方法:原代培养大鼠海马神经细胞,用免疫荧光染色鉴定纯度,制备并鉴定AβOs,用不同浓度AβOs(0.25、0.5、1及10 μmol/L)处理细胞48 h,采用CCK-8试验检测细胞的存活率,蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)及p38磷酸化及总蛋白表达水平.结果:免疫荧光染色结果显示原代大鼠海马神经细胞的体外培养纯度达85％以上;低于0.5 μmol/L AβOs对原代神经细胞无明显毒性作用,但可见phospho-ERK1/2和phospho-JNK蛋白表达升高;1 μmol/L及更高浓度的AβOs对原代神经细胞有细胞毒性作用,同时可引起phospho-ERK1/2和phospho-JNK蛋白表达水平均降低,但总ERK1/2及总JNK蛋白表达水平未受明显影响,而phospho-p38及总p38蛋白表达水平与AβOs作用浓度呈负相关.结论:AβOs与MAPK信号通路之间的作用可因AβOs的作用浓度不同而出现差异.
