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γ-分泌酶抑制剂DAPT对哮喘小鼠气道炎症的调控作用分析
目的 探究γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对哮喘小鼠气道炎症的调控作用.方法 选择健康C57BL/6雌性小鼠120只,随机分成4组,每组30只,分别为健康对照组、哮喘模型组、二甲基亚砜(DMOS)溶剂对照组、DAPT组.除健康对照组,剩余3组小鼠创建哮喘模型.DAPT组在末次激发前0.5 h经气道使用DAPT,DMSO溶剂对照组给予相同体积的DMSO,健康对照组给予相同体积的生理盐水,哮喘模型组不给予任何处理.末次激发1 d后,脱颈法处死所有小鼠,收集气道内灌洗液(BALF),测定BALF内Th1/2细胞因子变化情况,对BALF中各种炎性细胞进行计数.结果 健康对照组、哮喘模型组、DMOS溶剂对照组和DAPT组小鼠BALF内的IL-4和IFN-γ水平,白细胞总数、淋巴细胞计数、嗜酸性粒细胞计数比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 DAPT可一定程度纠正哮喘小鼠的免疫偏倚现象,减少肺组织炎性细胞浸润比例,是治疗哮喘的新药物,值得进一步深入研究.
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Notch信号通路和多发性骨髓瘤
Notch信号通路是介导细胞和细胞之间直接接触的主要信号通路之一,调控了多细胞机体的细胞凋亡、增殖和分化,是造血微环境调节造血细胞增殖与分化的重要信号通路,与多种血液系统恶性肿瘤的发病有关.多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是以浆细胞克隆性增殖为特征的B系肿瘤.由于骨髓瘤细胞的增殖比例低及多药耐药的形成,因此其对常规剂量的化疗药耐药,使得MM的临床治疗仍十分困难.近年来的研究发现,多发性骨髓瘤病人肿瘤细胞和骨髓瘤细胞株都大量表达Notch的配体Jagged-2,而正常的浆细胞或是其它恶性疾病来源的病人肿瘤细胞低量表达Jagged-2.Jagged-2可诱导基质细胞分泌白介素6(IL-6)、血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)、胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1).Notch信号通路激活后可通过与NF-KB,C-yc的相互作用,调节细胞的增殖,促进骨髓瘤细胞的生长,从而抑制骨髓瘤细胞的凋亡,它与骨髓瘤的发生和耐药有关.抑制Notch信号通路能诱导骨髓瘤细胞的凋亡,增强化疗药的细胞毒作用.研究表明,单独使用Notch信号通路的特异性化学抑制刑剂γ分泌酶抑制刑(γ-secretase inhibitors,GSI)可通过特异性阻滞Notch信号通路从而诱导骨髓瘤细胞的凋亡,并且与传统化疗药物联合应用可以增强骨髓瘤细胞对化疗药的敏感性.本文就Notch信号通路的组成、Notch信号通路的作用机制及Notch信号通路与多发性骨髓瘤的关系进行综述.
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Notch信号分子在人淋巴瘤细胞中的表达及意义
本研究探讨Notch信号分子在人淋巴瘤细胞中的表达及其意义.选择人B淋巴瘤细胞系(Raji、Maver、Z138)和T淋巴瘤细胞系Jurkat细胞,利用RT-PCR技术检测Notch信号分子在这些细胞中的表达情况；利用流式细胞术检测γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号后对淋巴瘤细胞凋亡以及细胞周期的影响；利用CCK-8法检测DAPT对淋巴瘤细胞增殖的影响.结果表明:Notch分子在不同淋巴瘤细胞中的表达有所不同,Notch1和Notch2在4种细胞中均有表达,Notch3主要表达于Jurkat细胞,而Notch4仅在Raji细胞中弱表达；另外,Notch下游靶基因Hes1仅表达于Raji和Jurkat细胞.DAPT对Jurkat和Raji细胞的增殖抑制以及凋亡诱导作用比较明显,并将细胞周期阻滞在G1期,但是对Maver和Z138细胞的作用较弱.DAPT可以通过抑制Notch下游靶基因Hes1的表达而发挥作用.结论:Notch信号的异常表达与活化对淋巴瘤细胞的增殖起着重要作用,Notch信号有望成为淋巴瘤治疗的一个新靶点.
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γ-分泌酶抑制剂对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的作用
目的 γ-分泌酶抑制剂(DAPT)是Notch信号通路特异性阻断剂,本实验将研究DAPT对SD大鼠离体心脏缺血再灌注损伤(I/RI)的影响,为探明Notch信号通路在心肌I/RI中的作用提供理论依据.方法 采用离体大鼠心脏Langendorff逆行灌注模型,缺血50 min,再灌注60 min.实验分为4组,分别为正常对照组(Control)、I/RI组、DAPT(1 μM)+I/RI组,DAPT(1 μM)组.监测缺血前后血流动力学各项指标,包括:心率(HR)、左心室发展压(LVDP)、左心室内压大变化速率(+dp/dtmax)、冠脉流量(CF)、计算出心率压力指数(DP,LVDP×HR/1000);氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定各组心肌梗死(MI)的面积;专用试剂盒测定冠脉流出液(CF)中乳酸脱氢酶含量(LDH).结果 与Control组比较,I/R组缺血后各时间点的收缩及舒张功能均显著降低(P<0.01),MI面积显著增加(P<0.01),冠脉流出液中LDH含量显著升高(P<0.01);与I/RI组比较,DAPT+I/RI组可以加重上述指标进一步恶化(P<0.01);与Control组比较,DAPT各项指标无统计学差异(P>0.05).结论 DAPT有加重心肌缺血再灌注损伤的作用,Notch信号通路可能在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要的调控作用.
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γ-分泌酶抑制剂DAPT对炎症诱导新生小鼠未成熟脑白质损伤影响
目的 探讨γ-分泌酶抑制剂DAPT在新生鼠炎症暴露致未成熟脑白质损伤的影响.方法 取C57BL/10J新生3 d(P3)小鼠60只,随机分为正常对照组(control)、正常对照+DAPT组(control+ DAPT)、炎症暴露组(LPS)、DAPT预处理炎症暴露组 (LPS+ DAPT);LPS组和LPS+ DAPT新生3d小鼠予以LPS(0.25 mg·kg-1)腹腔注射,control+ DAPT组和LPS+DAPT组采用Notch信号特异抑制剂DAPT(10 mg· kg-1)腹腔注射.生后5 d(P5)断头取脑:Real-time PCR检测IL-1β、IL-8、TNF-α、Hes1及NICD表达变化;免疫荧光化学染色检测髓鞘磷脂蛋白(myelin basic protein,MBP)表达;Western blot定量检测MBP和caspase 3蛋白的表达量.结果 与control组比较,LPS组小鼠IL-1β、IL-8、TNF-α、Hes1及NICD mRNA的表达均增高(P＜0.05);与LPS组比较,LPS+ DAPT组IL-1β、IL-8、TNF-α、Hes1及NICD mRNA表达明显降低(P＜0.05);免疫荧光和Westernblot结果均显示炎症暴露(LPS组)后MBP表达低于control组(P＜0.05);而与LPS组比较,LPS+ DAPT组MBP表达显著增多(P＜0.05);炎症感染后脑内细胞凋亡蛋白caspase 3明显增加,而DAPT预处理后可逆转这种变化.结论 γ-分泌酶抑制剂DAPT参与了炎症暴露致新生鼠脑白质损伤过程,其机制可能与影响少突胶质细胞的成熟有关.
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DAPT对骨肉瘤U2OS细胞增殖和凋亡影响的实验研究
目的 观察γ-分泌酶抑制剂DAPT对人骨肉瘤细胞系U2OS增殖和凋亡的影响,探讨DAPT抑制骨肉瘤增殖并诱导其凋亡的可能机制.方法 采用体外培养人成骨肉瘤细胞系U2OS,CCK-8法检测不同浓度DAPT对成骨肉瘤细胞系U2OS生长的抑制作用;Annexin V-FITC/PI双标染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率;Hoechst 33258染色,倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化;应用RT-PCR和Western blot法检测DAPT对凋亡通路相关mRNA和蛋白表达的影响;采用Caspase活性检测试剂盒检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性变化.结果 CCK-8检测显示5～50 μmol/L的DAPT可抑制人骨肉瘤U2OS细胞增殖并具有时间和剂量依赖性;流式细胞术检测显示5、10、20 μmol/L的DAPT可明显诱导骨肉瘤U2OS细胞发生凋亡,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);5、10、20 μmol/L的DAPT处理后,Hoechst 33258染色可见凋亡小体;RT-PCR和Western blot分析显示,经DAPT(5、10、30 μmol/L)处理后的骨肉瘤细胞系U2OS表达Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA较对照组明显增高(P＜0.05),促凋亡蛋白Bax表达增加(P＜0.05),抑制凋亡蛋白Bcl-2表达减少(P＜ 0.05);Caspase活性检测显示,DAPT(5、10、20、30 μmol/L)处理后,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性较对照组明显升高(P＜0.05).结论 γ-分泌酶抑制剂DAPT对骨肉瘤细胞系U2OS的增殖有显著抑制作用,并可诱导其发生凋亡,其作用机制可能与激活Caspase依赖的凋亡途径有关.
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阻断Notch信号通路治疗多发性骨髓瘤的研究进展
Notch在多个物种中均有表达,其家族成员的结构具有高度保守性,Notch信号通路更是在众多病理生理过程中发挥关键作用.Notch家族成员Notch1不仅全程参与正常MM细胞的发育,同时也与多发性骨髓瘤的发生密切相关.Notch信号通路激活后可通过对NF-κB、C-myc的相互作用,调节细胞的增殖,促进骨髓瘤细胞的生长,从而抑制骨髓瘤细胞的凋亡,它与骨髓瘤的发生和耐药有关.通过对Notch及其通路的研究,使得对MM的发病机制有了更深入的了解,从而为MM的诊治提供了新靶点.一些阻断Notch信号的药物如砷剂及γ-分泌酶抑制剂等应用使MM的治疗得到了极大的突破.本文就该领域的研究现状进展进行综述.
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Notch信号通路在1-甲基-4-苯基吡啶诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡中的作用
目的 探讨Notch信号通路在1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)诱导的入神经母细胞瘤细胞凋亡中的活性变化及Notch信号通路抑制剂DAPT对凋亡的调控作用.方法 (1)体外培养的SHSY5Y与不同浓度(0、0.5、1、1.5、2 mmol/L)的MPP+共同孵育0、24、48、72 h.Annexin V-FITC/PI双染及流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹法检测Notch信号通路相关蛋白Notch-1、Jagged-1及Hes-1的表达.(2)将10 μmol/L的γ-分泌酶抑制剂(DAPT)预处理15 min后的SH-SY5Y细胞与1.5 mmol/LMPP+共同孵育48 h,Annexin V-FITC/PI双染及流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹法检测Notch-1、Jagged-1、Hes-1蛋白表达的变化.结果 MPP+以剂量(3.20％±0.19％、10.00％±1.72％、20.60％±3.76％、32.80％±5.12％、46.00％±5.06％,均P＜ 0.05)和时间(2.80％±0.21％、12.30％±1.82％、19.60％±2.89％、35.00％±4.78％,均P＜ 0.05)依赖方式诱导SH-SY5Y细胞凋亡,并显著上调Notch信号通路相关蛋白Notch-1、Jagged-1、Hes-1的表达.DAPT可显著抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡(3.10％ ±0.21％比35.50％±4.98％、19.20％±2.98％,均P＜ 0.05)以及Notch-1、Jagged-1、Hes-1蛋白的表达.结论 MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡中Notch信号通路活化,DAPT可阻断Notch信号通路激活,减少MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡.
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γ-分泌酶抑制剂对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI 8226细胞小鼠移植瘤的抑制作用
目的 探讨通过γ-分泌酶抑制剂MRK003抑制Notch1及蛋白激酶B(AKT)表达,观察其对人多发性骨髓瘤(MM)小鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 将MM细胞系RPMI8226细胞皮下注射给NOD/SCID小鼠,建立人MM小鼠移植瘤模型.将成瘤小鼠分为两组,实验组小鼠瘤体内每日注射γ-分泌酶抑制剂MRK003 5 mg.kg-1.d-1(0.2 ml),连续注射14d;对照组小鼠瘤体内注射等量的生理盐水,观察肿瘤生长情况.于末次注射第2天颈椎脱臼法处死小鼠后取瘤组织制作石蜡切片,应用免疫组织化学和Western blot方法检测Notch1、AKT表达.结果 RPMI8226细胞小鼠皮下注射后5～7 d成瘤,10～12 d肿瘤生长明显.注射MRK003前两组小鼠肿瘤平均体积分别为509.2和511.2 mm3(p＞0.05)；连续给药第9天测量实验组、对照组肿瘤平均体积分别为636.6和691.2 mm3(P＞0.01)；末次给药后的第2天实验组肿瘤体积为683.5mm3,明显小于对照组的1798.7mm3(p＜0.01)；免疫组织化学染色显示实验组小鼠肿瘤组织Notch1及AKT阳性率为11.1％和13.3％,明显低于对照组的95.6％和93.3％(P值均＜0.01)；Western b1ot结果显示实验组小鼠肿瘤组织Notch1及AKT蛋白的表达明显低于对照组.结论 γ-分泌酶抑制剂MRK003可抑制人MM小鼠移植瘤的生长,其作用可能是通下调Notch1信号通路蛋白的表达实现的.
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阿尔茨海默病治疗药Semagacestat
2009年美国的一项调查研究数据显示,阿尔茨海默病(AD)已成为人类第7大死亡病因.AD发病机制的研究已确定γ-分泌酶为AD药物干预的一个靶标.在AD发病过程中,γ-分泌酶由早老素(presenilin)介导产生,可裂解淀粉样前体蛋白(APP)而产生β-淀粉样蛋白(Aβ)斑块,这些斑块被认为在AD病人脑组织中可阻碍神经细胞功能、促进神经元退变和参与神经元纤维缠结的形成,从而导致神经元细胞死亡,表现为记忆丧失.目前尚无γ-分泌酶抑制剂获准用于治疗AD.
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AD治疗新药物--γ-分泌酶抑制剂
家族性阿尔采末病属常染色体显性遗传,其中大部分与编码早老素的基因发生突变所导致的γ-分泌酶功能异常有关,γ-分泌酶是一包括PS二聚体、Nicastrin、PEN-2等组分的多酶复合体.γ-分泌酶剪切APP、Notch、E-cadherin、ErbB-4受体酪氨酸激酶等膜蛋白.目前已发现了许多类型的γ-分泌酶抑制剂:基于二氟酮、二氟乙醇基团的γ-分泌酶抑制剂;脲多肽模拟化合物;基于羟乙基二肽电子等配体的化合物;具有α-螺旋结构的小肽;具有4-氯-异香豆素基本母核的非肽抑制剂;含有丙氨酰基团的化合物.但这些抑制剂目前大多还只是作为一种工具药来研究γ-分泌酶的结构、功能以及作用机制.其中选择性抑制Aβ生成的γ-分泌酶抑制剂很有希望成为一种高效的阿尔采末病治疗药物.
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应用GSI药物阻断Notch-1通路对骨肉瘤小鼠模型肿瘤生长及血管形成的影响
[目的]研究Notch-1通道阻断剂γ分泌酶抑制剂(gamma-secretase inhibitor,GSI)在抑制骨肉瘤小鼠模型中肿瘤增长以及其抑制肿瘤血管生成作用,进而探讨Notch-1信号通路在小鼠骨肉瘤模型中的作用及其作用机制.[方法]建立人骨肉瘤荷瘤SCID小鼠模型,将荷瘤成功后小鼠随机分为三组,实验组肿瘤内注射Notch通路阻断药物GSI,对照组注射PBS和DMSO.研究各组小鼠生物学指标、肿瘤增长变化及肿瘤组织检测微血管密度(microvessel density,MVD)的表达情况与差异.[结果]处死小鼠测量瘤体,同对照组相比,GSI治疗组小鼠的生物学指标明显较好,其小鼠的体重、饮食、睡眠、运动情况、精神状态、对刺激的反应及小鼠的皮毛光泽度等优于对照组,其皮下肿瘤体积明显较小,实验组平均体积为(196.3 mm3)较DMSO对照组平均体积(650.3 mm3)及PBS对照组平均体积(694.6 mm3)明显缩小,差别具有统计学意义,P＜0.01.实验组及对照组内瘤体切片内血管均见不同程度的CD31表达,其表达于血管内皮细胞内,与对照组相比实验组CD31表达均明显降低,实验组及PBS、DMSO对照组CD31平均秩次分别为4.03、28.9和32.5,P＜O.05,差异具有统计学意义.[结论](1)证实GSI可抑制SCID小鼠骨肉瘤动物模型肿瘤的生长;(2) GSI对SCID小鼠骨肉瘤动物模型的治疗作用可通过抑制Notch通路进而干预肿瘤血管形成来实现;(3)应用GSI药物阻断Notch信号通路有望成为骨肉瘤抗肿瘤治疗的新方法.
关键词： 骨肉瘤 Notch信号转导通路 血管生成 γ-分泌酶抑制剂 -
DAPT抑制妊娠滋养细胞肿瘤Notch信号通路对细胞增殖和EMT影响的研究
目的:探讨Notch信号通路在人妊娠滋养细胞肿瘤发生发展过程中的重要作用,及其与EMT之间的关系. 方法:采用γ-分泌酶抑制剂DAPT处理JAR和JEG-3两种人绒毛膜癌细胞株,MTT法检测两种细胞株的增殖情况,qPCR法检测Notch1 mRNA表达. Western blot法检测DAPT阻断Notch信号通路后JAR细胞中EMT相关蛋白E-cad的表达情况. 结果:DAPT能抑制JEG-3、JAR细胞生长,10μmol/L和15μmol/L DAPT作用48 h开始分别抑制JEG-3和JAR细胞生长( P<0 . 05 ) ,且抑制作用呈时间和浓度依赖关系. JEG-3细胞中,1μmol/L和10μmol/L DAPT作用组中Notch1 mRNA表达下调,两组比较差异无统计学意义(P>0. 05);JAR细胞中,10μmol/L和15μmol/L DAPT作用组中Notch1 mRNA表达下调,两组比较差异有统计学意义( P<0 . 05 ). DAPT能上调JAR细胞中E-cad表达. 结论:Notch信号通路和EMT与妊娠滋养细胞肿瘤的发生发展有关;γ-分泌酶抑制剂DAPT或可成为妊娠滋养细胞肿瘤治疗的一个新靶点.
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γ-分泌酶抑制剂DAPT对宫颈癌细胞系及HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系作用的研究
目的:研究γ-分泌酶抑制剂DAPT对宫颈癌细胞系以及HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系的作用,探讨DAPT临床治疗宫颈癌的可行性.方法:体外培养宫颈癌Siha、HeLa细胞系和HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系(CRL2614).加入不同浓度的γ-分泌酶抑制剂DAPT,不同时间点终止细胞生长,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色方法检测细胞生长情况;使用流式细胞计数仪检测细胞增殖周期中增殖指数(PI)、S期细胞比例(SPF)和凋亡细胞百分比.结果:应用MTT法检测细胞生长情况,5μmol/L及10μmol/L DAPT作用宫颈癌细胞系72h,可显著抑制其生长(P均＜0.05).10μmol/L DAPT对CRL2614细胞系作用72h无抑制作用(P＞0.05).流式细胞计数仪检测细胞增殖周期及细胞凋亡百分比.用5μmol/L及10μmoL/L DAPT作用宫颈癌细胞系24,48,72h均可见SPF、PI明显降低,凋亡细胞百分比明显增加(P均＜0.05).10μmoL/L DAPT作用CRL2614细胞系72h对SPF、PI及凋亡细胞百分比无影响(P＞0.05).结论:DAPT能抑制宫颈癌HeLa、Siha细胞系增殖,促进肿瘤细胞凋亡,对HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系的增殖和凋亡没有明显影响.DAPT可能为药物治疗宫颈癌提供新思路.
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DAPT对结肠癌细胞株HT-29增殖及乙醛脱氢酶1、Notch信号通路受体和配体表达的影响
目的 观察γ-分泌酶抑制剂(GSIs)DAPT对结肠癌细胞株HT-29增殖及结直肠癌肿瘤干细胞标志物乙醛脱氢酶1(ALDH1)、Notch信号通路受体Notch4、Notch信号通路配体DLL1表达的影响.方法 体外培养HT-29细胞,取对数生长期细胞用于实验.分别以0、5、10、20、40、80 μmol/L的DAPT作用于HT-29细胞24、48、72 h后,倒置显微镜下观察细胞形态,用MTT比色法检测细胞增殖能力(以OD值表示).分别以0、20、40 μmol/L的DAPT作用于HT-29细胞24 h后,采用RT-PCR法检测细胞中的ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA,分别采用Western blotting法和免疫组化法检测ALDH1、Notch4、DLL1蛋白.分析HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA及蛋白表达的相关性.结果 DAPT对HT-29细胞的增殖抑制作用呈一定剂量、时间依赖性,40、80 μmol/L浓度组培养48、72 h时细胞增殖能力低于培养24 h时(P均<0.05).DAPT处理后的细胞形态出现典型凋亡状态改变.20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA相对表达量低于0 μmol/L组(P均<0.05).0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白相对表达量依次降低(P均<0.05).免疫组化染色图像分析结果示,0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29细胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白表达OD值依次降低(P均<0.05).HT-29细胞中ALDH1、DLL1 mRNA表达与Notch4 mRNA表达均呈正相关关系(r分别为0.997、0.998,P均<0.05).HT-29细胞中ALDH1、DLL1蛋白表达与Notch4蛋白表达均呈正相关关系(r分别为0.998、0.999,P均<0.05).结论 DAPT作用后,细胞增殖受到抑制,细胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA和蛋白表达下调;DAPT对HT-29细胞的增殖抑制作用可能与降低肿瘤干细胞特性、下调Notch信号通路受体与配体表达实现的.
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γ-分泌酶抑制剂对骨肉瘤细胞的作用
目的 观察Notch通路抑制剂对骨肉瘤细胞U2OS的作用.方法 常规培养U2OS细胞,应用RO4929097处理U2OS细胞,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)法观察RO4929097对U2OS细胞的毒性作用,通过流式细胞仪检测RO4929097对U2OS细胞周期的影响及诱导凋亡的作用.结果 CCK-8检测结果显示不同浓度RO4929097对U2OS细胞有明显的抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),流式细胞检测结果显示RO4929097能促进U2OS细胞凋亡而不影响细胞周期.结论 Notch通路抑制剂可诱导U2OS凋亡.
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γ-分泌酶抑制剂对大鼠肾小管上皮细胞间充质转分化的抑制作用
目的 探讨γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对大鼠肾小管上皮(NRK52E)细胞间充质转分化(EMT)的抑制作用及机制.方法 含10μg/L转化生长因子-β1(TGF-β1)的无血清培养基孵育NRK52E细胞48 h构建EMT模型;或10 mol/L DAPT预处理15 min后构建NRK52E细胞EMT模型.Western blot法检测NRK52E细胞Notch-1、Hes-1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-cadherin)蛋白表达,小室迁移实验检测细胞迁移能力.结果 TGF-β1显著上调NRK52E细胞Notch-1、Hes-1、α-SMA蛋白表达,下调E-cadherin表达,并增强细胞迁移能力[(482.87±78.23)个比(1464.16± 31.82)个,P＜0.05].DAPT可显著抑制TGF-β1诱导的NRK52E细胞Notch-1、Hes-1、E-cadherin、α-SMA蛋白表达的变化及迁移能力的增强[(509.23 ±83.21)个比(1493.64±463.34)个、(983.06±169.49)个,P＜0.05].结论 Notch信号通路的活化参与了TGF-β1诱导NRK52E细胞EMT,DAPT阻断Notch信号通路活性,抑制TGF-β1诱导的NRK52E细胞EMT.
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γ-分泌酶抑制剂对血管内皮细胞抗过氧化氢损伤的保护作用及其机制
目的 探讨Notch信号特异性阻断剂γ-分泌酶抑制剂DAPT对血管内皮细胞抗过氧化氢(H2O2)损伤的保护作用及机制.方法 分别用不同浓度H2O2(100、200、400 μmol/L)处理体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 2、4、8h,噻唑蓝(MTT)比色法测定内皮细胞活力；Western blot法检测Notch信号通路受体Notch1、线粒体凋亡通路相关蛋白bax及抗凋亡蛋白B淋巴细胞/白血病-2(bcl-2)的表达.H2O2(300 μmol/L)建立HUVECs损伤模型,不同浓度DAPT(40、20、10 μmol/L)与H2O2共同处理HUVECs 2、4、6h,分别检测细胞存活率、黏附能力、凋亡率；Western blot法检测过氧化氢和DAPT共处理的内皮细胞中Notch1、bel-2和bax蛋白的表达.结果 经不同浓度的H2O2(100、200、400 μmol/L)处理内皮细胞2、4、6h后,内皮细胞的存活率明显降低(P＜0.01)；Notch1和bax的表达升高,抗凋亡蛋白bcl-2的表达降低.DAPT能明显提高H2O2损伤的内皮细胞存活率和黏附能力,降低凋亡率(P＜0.01)；经DAPT和H2O2共处理的内皮细胞与过氧化氢损伤组比较,Noteh1和bax蛋白的表达显著降低,但是bcl-2蛋白的表达显著升高(P＜0.01),其中DAPT浓度为10 μmol/L时效果明显.结论 低浓度DAPT对内皮细胞抗过氧化氢损伤有保护作用,可能与其抗氧化能力和抑制Notch信号通路有关.
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DA PT 对耐雷帕霉素骨肉瘤细胞增殖、凋亡的影响
目的：通过研究γ‐分泌酶抑制剂（DAPT ）对耐雷帕霉素（RAPA ）骨肉瘤细胞株增殖、凋亡的影响，探讨mTOR通路与Notch通路在骨肉瘤细胞增殖、凋亡中的关系。方法体外培养骨肉瘤MG63细胞株及建立耐雷帕霉素骨肉瘤MG63细胞株；噻唑蓝（MTT）比色法测定不同剂量雷帕霉素及DAPT对各细胞株增殖的影响；流式细胞仪检测不同剂量药物对各细胞株凋亡的影响；Western blot法检测各细胞株中p53的表达。结果 MTT法检测显示雷帕霉素及DAPT均能抑制各细胞株的增殖。流式细胞术检测结果表明雷帕霉素及DAPT均能诱导各细胞株发生凋亡，MG63细胞早、晚期凋亡率均与药物作用剂量呈正比，耐雷帕霉素M G63细胞仅在高浓度药物作用下，早、晚期凋亡率与细胞正常凋亡率相比差异有统计学意义。Western blot检测结果显示，不同浓度雷帕霉素、DAPT作用下，MG63细胞p53表达量随药物浓度升高而增加，而耐雷帕霉素MG63细胞p53表达量未随药物浓度升高而增加。结论雷帕霉素、DAPT对M G63细胞及耐雷帕霉素M G63细胞均能抑制增殖、促进凋亡。二者均可能是通过促进p53蛋白表达而发挥凋亡效应。凋亡过程中阻断mTOR后可能会降低骨肉瘤细胞对DAPT的敏感性，同时抑制Notch通路与p53的协同作用。
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新型γ-分泌酶抑制剂的设计与合成
目的 通过在数据库中虚拟筛选,以期发现新的γ-分泌酶抑制剂.方法 在MDL数据库中以γ-分泌酶抑制剂药效团模型为条件进行搜寻、设计并合成了一系列化合物.结果 所设计的目标化合物均经类药性分析.具有类药性;合成的化合物结构均经IR、~1H-NMR及~(13)C-NMR等验证.结论 设计并合成的新的γ-分泌酶抑制剂经药效团模型预测,具有更高的预测活性.其中佳化合物的预测活性值为0.025 nmol/L,可作为先导化合物进一步研究.
