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活化蛋白-1和巨噬细胞炎性蛋白-1α在实验性关节炎大鼠发病中的分子机制及亚砷酸的影响
目的研究活化蛋白(AP)-1和巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α在佐剂性关节炎大鼠发病中的分子机制及亚砷酸(SA)对它们的影响.方法随机将大鼠分成4组:正常对照组(NC组)、模型组(M组)、SA1组(腹腔注射SA 0.5 mg·kg-1·d-1)、SA2组(腹腔注射SA 1.0 mg·kg-1·d-1).免疫组织化学检测各组C-fos、MIP-1α的表达;生化法测C反应蛋白.结果NC组未见C-fos和MIP-1α表达,M组C-fos及MIP-1α大量表达(P＜0.05),C反应蛋白水平升高(P＜0.01);与M组比较,SA1组及SA2组C-fos、MIP-1α表达降低(P＜0.05),C反应蛋白水平下降(P＜0.01),且SA2组更明显.结论AP-1和MIP-1α在大鼠佐剂性关节炎发生发展具有重要作用;亚砷酸能下调AP-1和MIP-1α的表达,降低CRP的水平,提示亚砷酸对RA有一定的治疗作用.
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亚砷酸对狼疮鼠自身抗体和白细胞介素-1012表达的影响
目的 探讨亚砷酸(ATO)对狼疮鼠自身抗体和白细胞介素(IL)-10、IL-12表达的影响.方法 MRL/lpr狼疮鼠随机分为ATO组、环磷酰胺(CTX)组和生理盐水(NS)组,给药2个月.用四色流式细胞术测脾脏CD3~+(T)细胞和CD3~+CD4~+(Th)细胞的百分率以及CD3~+CD4~+(Th)细胞内IL-10和IL-12的水平;用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测血清中抗双链DNA(dsDNA)抗体、IL-10和IL-12的浓度.分别采用单因素方差分析、LSD检验,配对t检验进行统计学处理.结果 ①给药后ATO组小鼠血清的抗dsDNA抗体水平吸光度值(A)0.92±0.06,较给药前1.14±0.58明显下降(P<0.01);②ATO组CD3~+细胞和CD3~+CD4~+百分率[分别为(44±4)%和(20±4)%]均显著均低于NS组水平[分别为(59±5)%和(30±3)%](P<0.01);③ATO组的血清IL-12浓度(84±12)pg/ml较NS组水平(103±13)pg/ml显著降低(P=0.018);④ATO组Th细胞内IL-10和IL-12的表达水平(1.5±0.4)%和(2.43±0.42)%显著低于NS组(2.5±0.5)%和(3.24±0.40)%(P<0.01).结论 亚砷酸能显著降低MRL/lpr狼疮鼠血清抗dsDNA抗体的水平,抑制T细胞和Th细胞增生和活化功能,降低IL-12的血清水平和Th细胞的诱生水平,及能降低IL-10的Th细胞的诱生水平.
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胸腺肽α1联合三氧化二砷治疗中晚期原发性肝癌的疗效观察
目的：评价胸腺肽α1与三氧化二砷联合治疗中晚期原发性肝癌（PLC）的疗效。方法选取2011年7月－2014年7月泰州市姜堰中医院收治的中晚期PLC患者59例，分为两组，其中对照组在保肝对症支持治疗的基础上加用三氧化二砷治疗，联合组采用胸腺肽α1与三氧化二砷联合治疗。计量资料组间比较采用t检验，计数资料组间比较采用χ2检验。结果对照组临床获益率（CBR）为37．9％，联合组CBR为66．7％，差异具有统计学意义（χ2＝4．88，P＜0．05）；在生活质量方面，联合组生活质量改善率（63.3％）明显高于对照组（37．9％），差异具有统计学意义（χ2＝3．81，P＜0．05）；在疼痛方面，联合组疼痛缓解率（76.7％）明显高于对照组（44．8％），差异具有统计学意义（χ2＝6．28，P＜0．05）；甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原（CA）19－9、GGT均下降，联合组下降更明显（P值均＜0．05）；治疗后联合组中CD3＋T淋巴细胞，CD4＋T淋巴细胞，CD4＋与CD8＋T淋巴细胞比值均较治疗前有显著提高（P值均＜0．05），CD8＋T细胞显著降低（P＜0．01）；两组患者毒副反应差异无统计学意义。结论胸腺肽α1联合三氧化二砷治疗中晚期PLC能改善患者生活质量，提高患者免疫功能，且未发现明显毒副作用，值得临床推广应用。
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不同价态染砷大鼠肝脏MRP2表达水平与砷甲基化产物关联性
目的 分析亚砷酸钠(iAs3+)和砷酸氢钠(iAs5+)染毒后,对大鼠多药耐药相关蛋白2(MRP2)表达的影响,及其与肝脏砷及甲基化产物的关联性,寻找不同价态砷体内代谢转运间的差异,为进一步阐明砷毒作用机制提供依据.方法 70只Wistar大鼠分成7组,第1组为正常对照组,给予饮用去离子水;第2～4组为染毒iAs3+高、中、低剂量组,分别给予20.0、6.7、2.2 mg/kg体质量亚砷酸钠溶液;第5～7组为染毒iAs5+高、中、低剂量组,分别给予20.0、6.7、2.2 mg/kg体质量砷酸氢钠溶液.各组大鼠于染毒90 d后处死,取肝脏组织,用蛋白印迹法(Western-blotting)测定MRP2表达的变化.采用高效液相-氢化物发生原子荧光光谱分析法(HPLC-HGAFS)分析各组肝脏中砷及甲基化产物含量,并运用Pearson相关法分析MRP2表达与砷及甲基化产物的相关性.结果 对照组、iAs3+和iAs5+高、中、低剂量组MRP2蛋白表达分别为1.21±0.13、1.85±0.09、1.65±0.19、1.61±0.18、1.69±0.04、1.42±0.19、1.27±0.10,iAs3+的高、中、低剂量组和iAs5+高、中剂量组MRP2蛋白表达均高于对照组(P均＜0.05)；相同受试物比较,iAs3+和iA83+的高剂量组MRP2蛋白表达均高于低剂量组(P均＜ 0.05)；不同受试物同一剂量组比较,iAs3+高、中、低剂量组的MRP2蛋白表达均强于iAs5+高、中、低剂量组(P均＜0.05).同时,iAs3+染毒组肝脏中MRP2蛋白表达量与iAs3+和砷甲基化代谢产物MMA和DMA的含量均呈正相关关系(r值分别为0.575、0.678、0.395,P均＜0.05)；iAs5+染毒组肝脏中MRP2表达量与MMA和DMA的含量均呈正相关关系(r值分别为0.593、0.643,P均＜0.05),与iAs3+的含量无相关关系(P＞0.05).结论 随着砷染毒剂量的增加,MRP2表达逐渐上调,从而致使肝细胞膜上MRP2表达代偿性改变.MRP2外排通路可能在iAs3+代谢径路中发挥重要作用.肝脏MRP2与不同价态砷甲基化产物的负荷或水平密切相关.
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色素上皮衍生因子参与砷诱导的血管内皮细胞功能失调
目的 探讨色素上皮衍生因子(PEDF)对亚砷酸钠诱导的血管内皮细胞功能失调的作用.方法 以人脐静脉内皮细胞系EA.hy926作为研究对象,设置0(对照)、1、2、5、10、20、50 μmol/L亚砷酸钠组,处理细胞24h,CCK8法检测细胞活力,比色法检测细胞培养物上清诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养物上清中PEDF含量,流式细胞术检测细胞内一氧化氮(NO)含量.结果 20、50μmol/L组细胞活力[(80.69±7.95)％、(69.87±10.54)％]明显低于对照组[(101.08±3.22)％,P均＜0.05].10、20、50 μmol/L组细胞培养物上清中iNOS活性、PEDF含量[(829.1±68.2)、(772.3±37.1)、(874.6±43.5)U/L,(12.06±0.55)、(11.97±0.39)、(13.89±0.26)mg/L]均高于对照组[(397.5±43.5)U/L,(10.70±0.35)mg/L,P均＜0.01],50 μmol/L组细胞培养物上清中PEDF含量高.50μmol/L组细胞内NO含量(11 558.99±397.43)明显低于对照组(14 131.49±262.61,P＜ 0.01).结论 PEDF参与砷诱导的血管内皮细胞功能失调.
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转录因子ETS-1介导亚砷酸钠对人正常肝细胞微小RNA-21表达的诱导作用
目的 了解转录因子ETS-1介导亚砷酸钠(NaAsO2)对人正常肝细胞L-02的微小RNA (miRNA,miR)-21表达的影响.方法 量-效关系研究:采用不同剂量NaAsO2[0.0(对照)、2.5,5.0,10.0,20.0,40.0 μmol/L]作用L-)2细胞24 h(n=6).时-效关系研究:采用0(对照)、20 μmol/L NaAsO2作用L-02细胞12、24、36、48 h(n=6).分别采用ETS-1短发夹RNA(shRNA)和miR-21 inhibitor对ETS-1和miR-21的表达进行干预.ETS-1 shRNA(100 nmol/L)处理分为4组:①ETS-1 shRNA对照(NC)处理组;②ETS-1 shRNA NC联合NaAsO2(20 μmol/L)处理组;③ETS-1 shRNA处理组;④ETS-1 shRNA联合NaAsO2(20 μmol/L)处理组.miR-21 inhibitor(100 nmol/L)处理分为4组:①miR-21 inhibitor NC处理组;②miR-21 inhibitor NC联合NaAsO2(20 μmol/L)处理组;③miR-21inhibitor处理组;④miR-21 inhibitor联合NaAsO2(20 μmol/L)处理组.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测各组L-02细胞ETS-1 mRNA、miR-21表达;蛋白免疫印迹法检测ETS-1蛋白表达.结果 量-效关系研究:0.0(对照)、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L组ETS-1 mRNA表达分别为1.008±0.028、1.552±0.029、1.697±0.050、1.842±0.077、2.233±0.096、2.235±0.092;miR-21表达分别为1.025±0.094、1.552±0.072、1.683±0.066、1.915±0.171、2.337±0.195、2.592±0.177;ETS-1蛋白表达分别为1.060±0.045、1.267±0.160、1.386±0.087、1.723±0.196、2.208±0.122、2.284±0.224,组间比较差异有统计学意义(F=47.797、8.959、65.748,P均＜0.05),其中各染砷组均明显高于对照组(P均＜0.05),且呈剂量-效应关系.时-效关系研究:染砷L-02细胞12、24、36、48 h时ETS-1 mRNA表达分别为1.253±0.175、1.623±0.220、1.771±0.324、1.913±0.251;miR-21表达分别为1.502±0.111、1.716±0.113、1.979±0.186、2.452±0.304;ETS-1蛋白表达分别为1.196±0.105、1.502±0.076、1.651±0.074、1.839±0.139,组间比较差异有统计学意义(F=14.936、39.180、39.441,P均＜0.05),其中各时间染砷组均明显高于相同时间点对照组(1.044±0.115、1.044±0.124、1.108±0.088、1.053±0.061;1.092±0.061、1.096±0.169、1.024±0.111、1.057±0.146;1.020±0.017、1.049±0.121、1.024±0.089、1.031±0.124,P均＜0.05),呈时间-效应关系.ETS-1 shRNA联合NaAsO2处理组与ETS-1 shRNA NC联合NaAsO2处理组比较,ETS-1 mRNA和miR-21表达明显下调(0.912±0.238比1.641±0.225,1.313±0.334比2.363±0.252,P均＜0.05);miR-21 inhibitor联合NaAsO2处理组与miR-21 inhibitor NC联合NaAsO2处理组比较,ETS-1mRNA表达(1.580±0.077比1.576±0.065)差异无统计学意义(P＞0.05).结论 L-02细胞中ETS-1、miR-21可应答NaAsO2暴露呈高表达状态,ETS-1介导了NaAsO2引起的miR-21高表达,可能是砷致人肝脏miRNAs表达改变及肝损伤的重要分子机制之一.
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叔丁基对苯二酚对亚砷酸钠致细胞毒性和氧化损伤的拮抗作用
目的 探讨叔丁基对苯二酚(tBHQ)对亚砷酸钠(NaAsO2)致细胞毒性和氧化损伤的拮抗作用。方法 Chang肝细胞用tBHQ[0(对照)、5、25μmol/L]预处理24h,再用5 μmol/L tBHQ和NaAsO2[0(对照)、30、40、50、60 μmol/L]共同作用24h,采用刃天青钠(Alamar blue)还原法检测细胞活力，结果用实验组Alamar blue还原率与对照组Alamar blue还原率的相对比值表示；Chang肝细胞用tBHQ[0(对照)、5、25 μmol/L]预处理24h,再用5μmol/L tBHQ和NaAso2[0(对照)、40、50 μmol/L]共同作用24h，采用荧光探针2′，7′-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)的生成，结果用实验组平均荧光强度与对照组平均荧光强度的相对比值表示。结果 30、40、50、60 μmol/L的NaAsO2暴露能够显著降低细胞活力，而tBHQ预处理(5、25 μmol/L)则可明显恢复细胞活力,NaAsO2和tBHQ两因素的主效应及其交互作用均有统计学意义（F值分别为566.57、55.09、14.50，P均＜0.05）；5、25 μmol/L tBHQ预处理的30、40、50、60 μmol/LNaAsO2组细胞活力(0.75±0.02、0.70±0.04、0.59±0.03、0.43±0.03和0.75±0.02、0.73±0.03、0.65±0.02、0.50±0.02)较相应NaAsO2单独作用组(0.70±0.03、0.64±0.03、0.43±0.03、0.33±0.01)显著升高（P均＜0.05），25 μmol/L tBHQ 预处理的50、60μmol/L NaAsO2组细胞活力高于相应5μmol/L tBHQ预处理组（P均＜0.05）。40、50 μmol/L的NaAsO2能显著诱导Chang肝细胞内ROS的产生，而tBHQ预处理(5、25 μmol/L)则可使NaAsO2诱导产生的细胞内ROS水平显著下降，NaAsO2和tBHQ两因素的主效应及其交互作用均有统计学意义（F值分别为181.78、60.55、4.93，P均＜0.05）;5、25 μmol/L tBHQ预处理的40、50 μmol/L NaAsO2组细胞内ROS水平(1.87±0.09、1.80±0.07和1.36±0.11、1.44±0.12)较相应NaAsO2单独作用组(2.30±0.18、2.18±0.17)显著降低(P 均＜ 0.05)，25 μmol/L tBHQ预处理的40、50 μmol/L NaAsO2组细胞内ROS水平低于相应5μmol/L tBHQ预处理组（P均＜ 0.05）。结论 tBHQ对NaAsO2诱导的细胞毒性和氧化损伤具有一定的拮抗作用。
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亚砷酸钠对大鼠小脑颗粒细胞凋亡和神经球蛋白mRNA表达的影响
目的 观察亚砷酸钠(NaAsO2)对原代培养大鼠小脑颗粒细胞凋亡和神经球蛋白mRNA表达的影响.方法 选取出生后7～8d的Wistar大鼠20只,断头取小脑皮层,制备颗粒细胞悬液,以4×109个/m2的密度接种于培养液,采用不同浓度NaAsO2[0(对照)、2、5、10 μmol/L]进行染毒.培养24 h时,采用激光共聚焦法检测细胞内活性氧(ROS)和细胞凋亡;培养24、48 h时,采用实时荧光定量PCR法检测细胞内神经球蛋白mRNA表达.结果 培养24h时,对照和2、5、10 μmol/L染砷组ROS荧光强度分别为421.32±5352、1 082.09±321.58、2 223.02±1 011.37、1 366.87±102.14,组间比较差异有统计学意义(F=5.873,P＜0.05);细胞凋亡率分别为(8.91±5.63)％、(26.46±1.77)％、(43.65±14.45)％、(56.04±6.95)％,组间比较差异有统计学意义(F=18.369,P＜ 0.05).培养24 h时,对照和2、5、10μmol/L染砷组神经球蛋白mRNA表达分别为1.00±0.06、0.77±0.22、0.43±0.18、0.42±0.14,组间比较差异有统计学意义(F=18.235,P＜0.05);培养48 h时,神经球蛋白mRNA表达分别为1.00±0.01、0.89±0.09、0.60±0.16、0.08±0.02,组间比较差异有统计学意义(F=80.843,P＜0.05).结论 随着NaAsO2浓度升高,ROS和凋亡水平升高,而神经球蛋白mRNA表达明显降低,表明机体受到刺激后,产生的保护性蛋白可能被消耗,推测砷所诱导的神经球蛋白的表达在一定程度上与砷所导致的神经损伤有关.
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亚砷酸钠诱导人膀胱上皮永生化细胞氧化损伤作用观察
目的 观察亚砷酸钠(NaAsO2)诱导人膀胱上皮永生化细胞(SV-HUC-1)氧化损伤作用.方法 以不同浓度NaAsO2[0(对照)、1、2、4、8、10μmol/L]对SV-HUC-1细胞染砷24 h,利用流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平,采用酶联免疫吸附实验(EHSA法)检测细胞内硝基酪氨酸(NT)含量和细胞培养液中8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷(8-OHdG)水平.结果 1、2、4、8、10 μmol/L染砷组SV-HUC-1细胞ROS水平(81.76±4.91、95.23±2.17、126.61±17.95、126.74±27.77、114.18±9.65)明显高于对照组(69.84±1.28,P＜ 0.05或＜ 0.01),ROS水平与染砷剂量呈显著正相关(r=0.818,P＜ 0.01).10 μmol/L染砷组SV-HUC-1细胞内NT含量[ (919.66±206.33)μg/L]显著高于对照组[(238.19±38.28) μg/L,P＜ 0.01],NT含量与染砷剂量呈显著正相关(r=0.617,P＜0.01).各组细胞培养液中8-OHdG含量比较,差异无统计学意义(F=2.127,P＞0.05).结论 NaAsO2能够引起SV-HUC-1细胞氧化损伤.
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氟砷联合暴露对大鼠骨组织骨形态发生蛋白2和骨形成相关因子Runt转录因子2 基因转录表达的影响
目的 观察慢性氟砷联合暴露对大鼠骨组织骨形态发生蛋白2(BMP-2)和骨形成相关因子Runt转录因子2(Runx2)基因转录表达的影响及交互作用.方法 选取160只8周龄清洁级Wistar大鼠作为研究对象,体重为(200±50)g,根据2×4析因实验设计按体重采用随机数字表法分成16组,每组10只,雌雄各半.用氟化钠(NaF:空白对照0.0 mg/kg、低氟5.0 mg/kg、中氟10.0 mg/kg、高氟20.0 mg/kg)和亚砷酸钠(NaAsO2:空白对照0.0 mg/kg、低砷2.5 mg/kg、中砷5.0 mg/kg、高砷10.0 mg/kg)灌胃,每周连续灌胃6 d,停灌1 d,共连续灌胃6个月.依据上述因素将大鼠分为对照组(F0.0As0.0)、低氟组(F5.0As0.0)、中氟组(F10.0As0.0)、高氟组(F20.0As0.0)、低砷组(F0.0As2.5)、中砷组(F0.0As5.0)、高砷组(F0.0As10.0)、低氟低砷组(F5.0As2.5)、低氟中砷组(F5.0As5.0)、低氟高砷组(F5.0As10.0)、中氟低砷组(F10.0As2.5)、中氟中砷组(F10.0As5.0)、中氟高砷组(F10.0As10.0)、高氟低砷组(F20.0As2.5)、高氟中砷组(F20.0As5.0)、高氟高砷组(F20.0As10.0).采用氟离子选择电极法检测尿氟(UF),原子荧光光谱法检测尿砷(UAs),实时荧光定量PCR法检测BMP-2及Runx2 mRNA表达水平.结果 F0.0As0.0组、F0.0As2.5组、F0.0As5.0组、F0.0As10.0组均无氟斑牙出现,其余各组均出现不同程度氟斑牙.氟斑牙的发生与染氟剂量存在剂量-反应关系,在高氟(20.0 mg/kg)剂量下,随染砷剂量增加氟斑牙损伤程度增加(χ2=9.124,P<0.05).与F0.0As0.0组(0.99±0.08、0.99±0.07)比较,F5.0As0.0、F10.0As0.0、F20.0As0.0组骨组织BMP-2 mRNA水平(1.01±0.07、1.06±0.06、1.21±0.05)及Runx2 mRNA水平(1.03±0.04、1.24±0.03、1.33±0.10)随染氟剂量的升高均有升高趋势.氟对BMP-2及Runx2 mRNA表达有主效应(F=3.067、2.927,P均<0.05);氟砷联合对BMP-2及Runx2 mRNA表达存在交互作用(F=3.817、4.802,P均<0.05).结论 氟砷联合暴露对大鼠骨组织BMP-2及Runx2 mRNA表达作用主要表现为氟的主效应,砷间接参与氟致骨毒性过程,氟砷联合对BMP-2及Runx2 mRNA表达的交互作用主要表现为拮抗作用.
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亚砷酸钠对人正常肝细胞L-02活性氧含量和细胞凋亡的影响
目的 研究不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)对人正常肝细胞L-02存活情况、细胞内活性氧(ROS)水平及细胞凋亡的影响.方法 用0(对照组)、50、100、150 μmol/L NaAsO2作用L-02肝细胞24h后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTr)法检测L-02肝细胞存活率,流式细胞仪检测L-02肝细胞内ROS水平和细胞早期(Q4期)、晚期(Q2期)凋亡程度.结果 细胞存活率检测:不同浓度NaAsO2组细胞存活率比较,差异有统计学意义(F=350.51,P＜0.05),其中50、100、150μmol/L NaAsO2组细胞存活率[(87.30±3.74)％、(49.03±4.72)％、(13.44±4.01)％]显著低于对照组[(100.00±0.00)％,P均＜0.05];与50 μmol/L NaAsO2组比较,100、150μmol/L NaAsO2组细胞存活率显著下降(P均＜0.05);与100 μmol/L NaAsO2组比较,150 μmol/L NaAsO2组细胞存活率显著下降(P＜0.05).ROS水平检测:不同浓度NaAsO2组细胞内ROS水平比较,差异有统计学意义(F =407.78,P＜0.05),其中100、150 μmol/LNaAsO2组细胞内ROS水平(3 212.00±22193、5 521.33±179.63)显著高于对照组(1 691.67±73.98,P均＜0.05);与50 μmol/L NaAsO2组(1 927.67±62.45)比较,100、150μmol/L NaAsO2组细胞内ROS水平显著增加(P均＜0.05);与100 μmol/NaAsO2组比较,150 μmol/L NaAsO2组细胞内ROS水平显著增加(P＜0.05).细胞凋亡检测:不同浓度NaAsO2组Q2期(晚期凋亡细胞)、Q4期(早期凋亡细胞)、Q2+ Q4期(总凋亡细胞)细胞凋亡率比较,差异均有统计学意义(F=256.84、26.53、63.89,P均＜0.05),除50 μmol/L NaAsO2组Q4期[(5.43±0.57)％]外,50 μmol/LNaAsO2组[Q2期:(5.67±021)％,Q2+ Q4期:(11.10±0.40)％]、100 μmol/L NaAsO2组[Q2期:(13.60±0.79)％,Q4期:(7.37±2.01)％,Q2+Q4期:(20.97±2.38)％]、150 μmol/L NaAsO2组[Q2期:(13.47±0.78)％,Q4期:(16.97±3.45)％,Q2+Q4期:(30.43±3.84)％]细胞凋亡率均显著高于对照组[Q2期:(3.47±0.12)％,Q4期:(2.90±0.90)％,Q2+Q4期:(6.37±1.00)％,P均＜0.05];与50 μmol/L NaAsO2组比较,100、150 μmol/L NaAsO2组Q2、Q4、Q2+ Q4期凋亡细胞增加,除100 μmol/L NaAsO2组Q4期外,差异有统计学意义(P均＜0.05);与100 μmol/L NaAsO2组比较,150 μmol/L NaAsO2组Q4、Q2+Q4期凋亡细胞均显著增加,差异有统计学意义(P均＜0.05).结论 NaAsO2可以诱导L-02肝细胞内ROS含量增加,推测NaAsO2可通过氧化损伤作用进一步诱导L-02肝细胞发生早期和晚期凋亡,从而抑制L-02肝细胞的生长.
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H3K36me3调控O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因与砷致人皮肤角质形成细胞DNA损伤的关系
目的 了解亚砷酸钠(NaAsO2)对人皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞)组蛋白H3第36位赖氨酸三甲基化(H3K36me3)修饰水平、O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)基因mRNA转录水平的影响,探讨H3K36me3调控MGMT基因转录与砷致DNA损伤的关系,为砷中毒预防和治疗提供新思路和科学依据.方法 1.25、2.50、5.00、10.00 μmol/L NaAsO2处理HaCaT细胞24 h,10.00 μmol/LNaAsO2处理HaCaT细胞6、12、24h,剂量以0.00μmol/L、时间以0h为对照组.采用单细胞凝胶电泳法检测HaCaT细胞DNA损伤情况;免疫印迹法检测H3K36me3总体修饰水平;实时荧光定量PCR检测MGMT基因mRNA表达水平;定量染色质免疫沉淀技术检测MGMT基因编码区(ChIP1、ChIP2区域)H3K36me3修饰水平.结果 ①DNA损伤检测结果:2.50、5.00、10.00 μmol/L染砷组HaCaT细胞彗星尾部DNA百分含量(Tail DNA％,11.83±1.15、16.85±2.52、24.23±2.75)、彗星尾矩(Olive tail moment,OTM,10.90±1.13、16.19±2.26、23.83±2.79)明显高于对照组(0.00 μmol/L,2.40±0.51、2.26±0.40,P均＜0.05);10.00 μmol/L NaAsO2处理HaCaT细胞12、24h,TailDNA％(15.51±1.92、24.18±2.42)、OTM(13.58±2.04、23.14±2.11)明显高于对照组(0 h,3.66±1.02、3.38±1.00,P均＜0.05).②H3K36me3总体修饰水平检测结果:与对照组(0.00μmol/L,100.00±0.00)比较,2.50、5.00、10.00μmol/L染砷组H3K36me3总体修饰水平(60.59±9.75、57.82±11.28、39.45±7.09)降低(P均＜0.05);与对照组(0 h,100.00±0.00)比较,12、24 h染砷组H3K36me3总体修饰水平(48.47±9.67、47.75±6.98)亦降低(P均＜0.05).③不同剂量染砷组HaCaT细胞H3K36me3总体修饰水平与Tail DNA％、OTM均呈负相关关系(r=-0.897、-0.903,P均＜0.05).④MGMT基因mRNA表达水平检测结果:与对照组(0.00 μmol/L,100.00±0.00)比较,2.50、5.00、10.00μmol/L染砷组MGMT基因mRNA表达水平(78.20±3.50、61.40±2.60、49.15±4.70)降低(P均＜0.05).⑤MGMT基因编码区H3K36me3修饰水平检测结果:各剂量染砷组MGMT基因编码区ChIP1、ChIP2区域未观察到组蛋白H3K36me3的富集规律(P均＞0.05).结论 砷诱导的HaCaT细胞DNA损伤可能受H3K36me3的调控;砷可导致HaCaT细胞MGMT基因mRNA转录抑制,但H3K36me3调控MGMT基因mRNA转录抑制与砷致DNA损伤关系不密切.
关键词： 亚砷酸盐类 组蛋白类 O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶 DNA损伤 -
骨保护素、核因子-κB受体活化因子配基在氟砷联合染毒大鼠骨骼毒性中的调控作用
目的 探讨骨保护素(OPG)与核因子-κB受体活化因子配基(RANKL)在氟砷联合染毒大鼠骨骼毒性中的调控作用.方法 选取192只8周龄清洁级Wistar大鼠,体重为(200±50)g,根据2×4析因实验设计按体重采用随机数字表法分成16组,每组12只,雌雄各半.用氟化钠(NaF,空白对照0.0 mg/kg、低氟5.0mg/kg、中氟10.0 mg/kg、高氟20.0 mg/kg)和亚砷酸钠(NaAs02,空白对照0.0 mg/kg、低砷2.5 mg/kg、中砷5.0mg/kg、高砷10.0 mg/kg)灌胃染毒6个月.依据上述处理因素将大鼠分为对照组(F0As0)、低氟组(F5.0As0)、中氟组(F10.0As0)、高氟组(F20.0As0)、低砷组(F0As2.5)、中砷组(F0As5.0)、高砷组(F0As100)、低氟低砷组(F5.0As2.5)、低氟中砷组(F5.0As5.0)、低氟高砷组(F5.0As100)、中氟低砷组(F10.0As2.5)、中氟中砷组(F10.0As5.0)、中氟高砷组(F10.0As10.0)、高氟低砷组(F200As2.5)、高氟中砷组(F20.0As5.0)、高氟高砷组(F20.0As10.0).采用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)检测大鼠骨组织中OPG及RANKL蛋白表达水平,实时荧光定量PCR法检测OPG及RANKL mRNA表达水平.结果 与F0As0组[(2.678±0.136)ng/mg、(29.658±0.662)pg/mg]比较,F5.0As0、F10.0As0、F20.0As0组骨组织中OPG[(2.857±0.162)、(2.983±0.272)、(3.117±0.143)ng/mg]、RANKL[(32.533±0.999)、(32.698±1.932)、(33.331±1.140)pg/mg]蛋白表达水平随染氟剂量的升高均有升高趋势;与F0As0组比较,F0As2.5、F0As5.0、F0As10.0组骨组织RANKL蛋白水平[(32.348±2.838)、(31.589±1.359)、(28.843±1.908)pg/mg]随染砷剂量的升高而先升高后下降(P均＜ 0.05).与F0As0组(0.83±0.19、0.92±0.23)比较,F5.0As0、F10.0As0、F20As0组骨组织OPG(1.14±0.27、1.33±0.39、1.69±0.77)、RANKL mRNA水平(1.02±0.21、1.17±0.15、1.25±0.31)随染氟剂量的升高均有升高趋势.氟对OPG、RANKL蛋白和mRNA的表达有主效应(F=11.530、21.765、6.320、3.543,P均＜ 0.05),氟砷联合对RANKL蛋白和mRNA、OPG蛋白表达存在交互拮抗作用(F=9.496、2.217、3.375,P均＜ 0.05).结论 氟砷联合染毒对大鼠骨组织RANKL及OPG的影响中氟起主导作用,砷间接参与了氟致大鼠骨骼毒性作用,氟砷联合对OPG及RANKL表达的交互作用主要表现为拮抗作用.
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亚砷酸钠对人正常肝细胞L-02细胞周期蛋白D1和细胞周期依赖激酶4的影响
目的 研究亚砷酸钠(NaAsO2)对人正常肝细胞L-02细胞周期蛋白D1 (Cyclin D1)和细胞周期依赖激酶4(CDK4)表达的影响.方法 以0(对照)、50、100、150 μmol/L NaAsO2处理L-02细胞24 h,采用流式细胞仪检测细胞周期变化,采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测Cyclin D1、CDK4 mRNA和蛋白表达水平.结果 细胞周期检测:与对照组G0-G1期[(60.33±0.40)％]比较,除50 μmol/L NaAsO2组细胞比例[(54.58±0.40)％]减少外,100、150 μmol/L NaAsO2组细胞比例[(64.60±0.62)％、(83.13±0.25)％]显著增加,差异均有统计学意义(P均＜ 0.05);对照组,50、100、150 μmol/L NaAsO2组S期细胞比例逐渐减少[(34.35±0.30)％、(29.89±0.32)％、(29.50±0.44)％、(11.93±0.12)％],差异均有统计学意义(P均＜0.05);对照组,50、100、150 μmol/L NaAsO2组G2-M期细胞比例[(5.32±0.11)％、(15.54±0.14)％、(5.90±0.20)％、(4.93±0.15)％]比较,差异有统计学意义(F=908.359,P＜0.05).Cyclin D1和CDK4检测:对照组,50、100、150 μmol/NaAsO2组Cyclin D1 mRNA(0.48±0.17、1.00±0.31、1.00±0.21、2.06±0.53)和蛋白(0.65±0.02、0.64±0.05、0.71±0.10、0.84±0.05)表达水平比较,差异均有统计学意义(F=167.886、46.575,P均＜0.05);对照组,50、100、150 μmol/L NaAsO2组CDK4 mRNA(1.04±0.19、1.00±0.21、1.29±0.22、231±0.31)和蛋白(0.67±0.04、0.74±0.03、0.83±0.07、0.94±0.04)表达水平比较,差异均有统计学意义(F=95.171、145.848,P均＜0.05).结论 NaAsO2通过改变细胞周期调控因子Cyclin D1、CDK4 mRNA和蛋白表达水平,使L-02肝细胞的生长周期阻滞于G0-G1期,终导致细胞损害的发生.
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亚砷酸钠对人皮肤永生化角质形成细胞角化相关基因和核转录因子红系相关因子2mRNA表达的影响
目的 观察不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)对人皮肤永生化角质形成细胞(HaCaT)角化相关基因和核转录因子红系相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)mRNA表达的影响.方法 用0.00(对照)、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、75.00、100.00 μmol/L NaAsO2处理HaCaT细胞48h,采用2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(CCK-8)法检测细胞增殖率.根据细胞增殖率检测结果,选择0.00(对照)、6.25、12.50、25.00μmol/L NaAsO2处理HaCaT细胞48 h,采用实时荧光定量PCR法检测HaCaT细胞角蛋白1(Keratin1,K-1)、角蛋白10(Keratin10,K-10)、总苞蛋白(Involurin,Inv)、兜甲蛋白(Loricrin,Lor)和Nr2的mRNA表达.结果 与对照组(100.05％)比较,6.25、12.50、25.00、50.00、75.00、100.00 μmol/L NaAsO2组HaCaT细胞增殖率(83.06％、51.04％、39.52％、24.51％、16.99％、9.04％)明显降低,半数致死量为12.38 μmoL/L.与对照组(1.06±0.28、1.00±0.12、1.00±0.08)比较,6.25、12.50、25.00 μmol/L NaAsO2组HaCaT细胞K-1、Inv、Lor mRNA表达(0.08±0.04、0.13±0.12、0.05±0.03,0.47±0.11、0.21±0.09、0.10±0.15,0.50±0.27、0.31±0.10、0.57±0.23)明显降低(P均＜0.05),但K-10 mRNA表达呈现升高趋势,其中6.25μmol/L NaAsO2组(1.83±0.45)明显高于对照组(1.07±0.14,P＜ 0.05);而12.50、25.00 μmol/L NaAsO2组Nrf2 mRNA表达(0.13±0.07、0.69±0.33)明显低于对照组(1.00±0.09,P均＜0.05).结论 NaAsO2 可通过影响细胞角化相关基因和Nrf-2 mRNA表达,抑制HaCaT细胞增殖与角化.
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亚砷酸钠诱导人膀胱上皮细胞环氧化酶2和前列腺素E2表达的实验观察
目的 观察不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)对人膀胱上皮细胞(SV-HUC-1)环氧化酶2(COX-2)和前列腺素E2(PGE2)表达的诱导作用.方法 不同浓度NaAsO2[0(对照)、1、2、4、8、10 μmol/L]作用于SV-HUC-1细胞24h后,应用实时定量(RT)-PCR法检测SV-HUC-1细胞内COX-2 mRNA表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞培养液中PGE2含量.结果 与对照组(1.00±0.00)比较,2、4、8、10μmol/L NaAsO2 组SV-HUC-1细胞内COX-2 mRNA表达(1.73±0.25、245±0.23、1.94±0.71、1.75±0.43)明显升高(P均＜0.05),并且4μmol/L NaAsO2组SV-HUC-1细胞内COX-2 mRNA表达达到高；随NaAsO2浓度的增高,细胞培养液中PGE2含量呈升高趋势,表现为剂量反应关系,其中4、8、10 μmol/L NaAsO2组细胞培养液中PGE2含量[(9.59±1.27)、(10.40±2.19)、(12.93±1.33)ng/g]明显高于对照组[(6.64±1.46)ng/g,P均＜0.05].结论 NaAsO2能够诱导SV-HUC-1细胞COX-2 mRNA表达和PGE2分泌.
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卵磷脂对砷染毒非洲绿猴肾细胞细胞膜损伤的作用
目的 观察卵磷脂对亚砷酸钠(NaAsO2)染毒非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞膜损伤的作用.方法 将体外培养Vero细胞分为4组:对照组(生理盐水)、砷模型组(2.20 mg/L NaAsO2)、卵磷脂高剂量+砷干预组(53.33 mg/L卵磷脂+2.20 mg/L NaAsO2)、卵磷脂低剂量+砷干预组(13.32 mg/L卵磷脂+2.20 mg/L NaAsO2),每组6瓶细胞,每2天换液1次,培养120 h.采用分光光度法测定细胞膜Na+,K+-ATP酶活性,高效液相法测定细胞膜磷脂组分磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)和神经鞘磷脂(SM).结果 对照组、砷模型组、卵磷脂高剂量+砷干预组、卵磷脂低剂量+砷干预组细胞膜Na+,K+-ATP酶活性分别为(O.962 ±0.081)×106、(0.544±0.037)×106、(0.647±0.043)×106、(0.550±0.020)× 106 U·kg-1·h-1,各组间比较,差异有统计学意义(F=43.58,P<0.01).与对照组比较,其他3组细胞膜Na+,K+-ATP酶活性明显降低(P均<0.05);与砷模型组比较,卵磷脂高剂量+砷干预组明显增高(P<0.05),而卵磷脂低剂量+砷十预组未见明显改变(P>0.05).与对照组[(0.087±0.003)、(0.127±0.053)、(0.588±0.105)、(0.07l±0.029)g/L]比较,砷模型组PS、PE、PC、SM水平[(0.051±0.018)、(0.073±0.030)、(0.240 4-0.038)、(0.047±0.121)g/L]均明显降低(P均<0.05);卵磷脂高剂量+砷干预组PS、PE、PCI(0.084±0.011)、(0.109±0.363)、(0.591±0.476)g/L]未见明显改变(P均>0.05),而SM[(0.057±0.004)g/L]明显降低(P<0.05);卵磷脂低剂量+砷干预组PS、PE、SM[(0.058±0.020)、(0.086±0.177)、(0.048±0.103)g/L]明显降低(P均<0.05),而PCI(0.521±0.098)g/L]未见明显改变(P>0.05).与砷模型组比较,卵磷脂高剂量+砷干预组PS、PE、PC、SM明显增高(P均<0.05);卵磷脂低剂量+砷干预组PS、PE、SM未见明显改变(P均>0.05),PC明显增高(P<0.05).结论 高剂量卵磷脂对砷染毒Vero细胞膜损伤具有一定的保护作用.
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长期低剂量亚砷酸钠对永生化人皮肤角质形成细胞凋亡的影响
目的 观察1.0 μmol/L亚砷酸钠(NaAsO2)长期作用于永生化人皮肤角质形成细胞(HaCaT)时,细胞凋亡及凋亡相关蛋白的动态变化.方法 用1.0 μmol/L NaAsO2长期作用HaCaT细胞成功建立恶性转化模型,收集细胞恶性转化模型建立过程中0、1、7、14、21、28、35代细胞.采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白,包括活化的半胱氨酸蛋白酶3、8(cleaved-caspase-3、8)、转录因子C/EBP的同源蛋白(Chop)、淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax).结果 随着染砷代数的增加,细胞凋亡率呈明显的下降趋势,各代数间比较差异有统计学意义(F=26.770,P＜0.05),其中染砷第7、14、21、28、35代细胞的凋亡率(0.307±0.049、0.213±0.055、0.163±0.057、0.147±0.035、0.053±0.012)低于对照组0代(0.393±0.021,P均＜0.05).染砷组促凋亡的cleaved-caspase-3、Chop、Bax蛋白和抗凋亡的Bcl-2蛋白表达各代间比较,差异有统计学意义(cleaved-caspase-3;1.000±0.000、1.030±0.027、1.104±0.069、1.016±0.087、0.838±0.075、0.753±0.082、0.677±0.073;Chop:1.000±0.000、1.059±0.018、0.934±0.095、0.976±0.216、0.793±0.136、0.651±0.042、0.564±0.056;Bax:1.000±0.000、1.069±0.037、1.028±0.042、0.954±0.118、0.641±0.135、0.531±0.132、0.429±0.085;Bcl-2:1.000±0.000、1.072±0.023、1.249±0.134、1.334±0.143、1.633±0.221、1.507±0.152、1.461±0.145,F=7.730、7.355、27.802、12.438,P均＜0.05),且21代及以后与对照组0代(1.000±0.000)和同代对照组(1.000±0.000)比较,差异有统计学意义(P均＜0.05);而cleaved-caspase-8蛋白各代间比较,差异无统计学意义(F=0.832,P＞0.05).结论 低剂量NaAsO2可能通过作用于线粒体和内质网凋亡通路抑制HaCaT细胞的正常凋亡而使其发生恶性转化.
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不同剂量亚砷酸钠染毒大鼠唾液砷水平及其与血砷、尿砷间关系研究
目的 探讨不同剂量砷暴露大鼠唾液中含砷量变化及其与血砷、尿砷间的关系.方法 将32只雄性SD大鼠按体质量随机分为4组,分别为对照组(生理盐水)及低(0.2 mg/kg)、中(2.0 mg/kg)、高(20.0mg/kg)剂量亚砷酸钠染毒组,每组8只.采用经口灌胃染毒方法,隔日1次,连续2周后收集唾液、血液、尿液及脏器,计算脏器系数,应用原子荧光分光光度计(AFS-230)检测血砷、尿砷,应用电感耦合-等离子体质谱(ICP-MS)检测唾液砷.结果 亚砷酸钠染毒组大鼠体质量增长值均低于对照组,其中高剂量组[(76.13±17.19)g]与对照组[(103.00±12.31)g]比较,差异有统计学意义(P＜0.05).高剂量组大鼠肝脏及肾脏脏器系数[(3.92±0.54)％、(0.96±0.15)％]与对照组[(3.27±0.35)％、(0.76±0.05)％]比较,差异有统计学意义(P＜0.05或＜0.01).低、中、高染毒组大鼠唾液砷[(0.044±0.019)、(0.211±0.071)、(1.128±0.380)mg/L]、血砷[(11.832±1.887)、(45.032±7.216)、(121.839±17.323)mg/L]及尿砷[(0.138±0.085)、(0.874±0.328)、(8.843±1.754)mg/L]与对照组[(0.018±0.014)、(2.267±0.370)、(0.025±0.011)mg/L]比较,差异有统计学意义(P均＜ 0.05),且各染毒组之间比较差异有统计学意义(P均＜0.05).大鼠唾液砷与血砷、尿砷之间存在显著正相关,相关系数分别为0.934、0.960(P均＜0.01).结论 高砷暴露可抑制大鼠体质量增长,并对肝脏及肾脏有较强毒性.砷在唾液中存在良好的剂量-反应关系,且唾液砷与血砷、尿砷间存在明显的正相关关系,提示唾液砷也是一种良好的砷暴露标志物.
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全反式维甲酸对亚砷酸钠致人肝细胞损伤保护性作用的研究
目的 观察全反式维甲酸(ATRA)对亚砷酸钠致人肝细胞系(HHL)-5细胞损伤的保护性作用,探讨可能机制.方法 采用细胞培养方法,体外培养HHL-5细胞48 h后进行实验,实验分为4组:正常组、ATRA组、亚砷酸钠组、ATRA+亚砷酸钠组.用细胞增殖实验(WST)观察HHL-5细胞的活力；生物化学方法测定各组HHL-5细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肤过氧化物酶(GSH-Px)的活力及丙二醛(MDA)的含量和细胞培养液中谷草转氨酶(AST)的活力；透射电镜观察各组细胞超微结构的变化.结果 亚砷酸钠组HHL-5细胞活力(0.57±0.02)与正常组(0.70±0.01)比较,差异有统计学意义(P＜ 0.05)；SOD、GSH-Px、MDA、AST [(153.84±2.35 )U/mg Prot、(0.08±0.02)U/mg Prot、(4.15±0.50)nmol/mg Prot、(265.43±4.62)×103 U/L]与正常组[(237.41±18.30) U/mg Prot、(0.93±0.02)U/mg Prot、(2.26±0.40)nmol/mg Prot、(177±9.85)×103 U/L]比较,差异有统计学意义(P均.＜0.05).ATRA+亚砷酸钠组HHL-5细胞活力(0.65±0.04)与亚砷酸钠组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；SOD、GSH-Px、MDA、AST[(286.85±3.39)U/mg Prot、(0.56±0.09)U/mg Prot、(3.36±0.37)nmol/mg Prot、(220.02±1.07)×103 U/L]与亚砷酸钠组比较,差异有统计学意义(P均＜ 0.05).电镜结果显示,亚砷酸钠组同正常组及ATRA组比较,细胞表面微绒毛减少,双层核膜结构不清,胞质内可见空泡样变,肝糖原凝集；ATRA+亚砷酸钠组上述损伤程度减轻.结论 ATRA通过提高HHL-5细胞内抗氧化酶的活力,清除或者减少氧自由基对细胞的损伤,从而发挥保护作用.
