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急性脑缺血大鼠鼻腔给予rhEPO治疗后脑组织中Ngb和TNF-α的表达
目的 鼻腔给予脑缺血大鼠重组人促红细胞生成素(rhEPO),通过分析脑组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和神经球蛋白(Ngb)的表达情况,探讨其对急性脑缺血的神经保护作用及机制.方法 将54只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、rhEPO治疗组,每组18只.采用Zea-Longa改良线栓法[1]制备大鼠永久性局灶性脑缺血(pMCAO)模型.rhEPO治疗组在缺血1 h鼻腔给予小剂量rhEPO(48 U/40 μL),模型组和对照组在缺血1 h鼻腔给予等量的生理盐水.缺血24 h后断头处死大鼠,取出完整脑组织,分别用干湿质量法计算脑组织含水量,TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)法测量脑梗死体积,免疫组织化学方法测定TNF-α与Ngb的表达.结果 模型组与对照组相比,脑含水量明显增加,Ngb与TNF-α的表达增加,差异有统计学意义(P＜0.05).rhEPO治疗组与模型组相比,脑含水量下降,梗死面体减小,TNF-α的表达下降,Ngb的表达增加,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 鼻腔给予rhEPO是一种有效的给药途径,其可能通过降低TNF-α的表达和促进Ngb的表达来发挥神经保护作用.
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亚砷酸钠对大鼠小脑颗粒细胞凋亡和神经球蛋白mRNA表达的影响
目的 观察亚砷酸钠(NaAsO2)对原代培养大鼠小脑颗粒细胞凋亡和神经球蛋白mRNA表达的影响.方法 选取出生后7～8d的Wistar大鼠20只,断头取小脑皮层,制备颗粒细胞悬液,以4×109个/m2的密度接种于培养液,采用不同浓度NaAsO2[0(对照)、2、5、10 μmol/L]进行染毒.培养24 h时,采用激光共聚焦法检测细胞内活性氧(ROS)和细胞凋亡;培养24、48 h时,采用实时荧光定量PCR法检测细胞内神经球蛋白mRNA表达.结果 培养24h时,对照和2、5、10 μmol/L染砷组ROS荧光强度分别为421.32±5352、1 082.09±321.58、2 223.02±1 011.37、1 366.87±102.14,组间比较差异有统计学意义(F=5.873,P＜0.05);细胞凋亡率分别为(8.91±5.63)％、(26.46±1.77)％、(43.65±14.45)％、(56.04±6.95)％,组间比较差异有统计学意义(F=18.369,P＜ 0.05).培养24 h时,对照和2、5、10μmol/L染砷组神经球蛋白mRNA表达分别为1.00±0.06、0.77±0.22、0.43±0.18、0.42±0.14,组间比较差异有统计学意义(F=18.235,P＜0.05);培养48 h时,神经球蛋白mRNA表达分别为1.00±0.01、0.89±0.09、0.60±0.16、0.08±0.02,组间比较差异有统计学意义(F=80.843,P＜0.05).结论 随着NaAsO2浓度升高,ROS和凋亡水平升高,而神经球蛋白mRNA表达明显降低,表明机体受到刺激后,产生的保护性蛋白可能被消耗,推测砷所诱导的神经球蛋白的表达在一定程度上与砷所导致的神经损伤有关.
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神经球蛋白在砷致神经系统损伤中的保护作用
神经球蛋白是一个与氧有高亲和性且多表达于脊椎动物脑组织的单体球蛋白.许多研究证实,神经球蛋白在缺血缺氧等致神经系统损伤的过程中发生表达变化,可能起到保护作用.神经球蛋白的作用机制主要包括清除自由基、对抗氧化应激、对抗细胞凋亡,还可以作为信号转导物质促进下游磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol-3-kinase/protein serine threonine kinase,PI3K/AKT)信号的激活而增加细胞活性.砷暴露导致氧化应激及凋亡的发生,因此,神经球蛋白可能在砷暴露导致的神经系统损伤中起到保护作用.文中总结了神经球蛋白在神经系统的表达变化及保护作用,展望神经球蛋白在地方性砷中毒导致的神经系统损伤中的保护作用.
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丙泊酚或依托咪酯对大鼠空间学习记忆能力的影响
目的 观察丙泊酚或依托咪酯对大鼠空间学习记忆能力的影响.方法 雄性SD大鼠45只,4周龄,随机均分为对照组、丙泊酚组和依托咪酯组.Morris水迷宫测试大鼠空间学习记忆能力,半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测大鼠海马组织中神经球蛋白(Ngb)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)mRNA的表达.结果 与第1天比较,三组大鼠第2、3、4、5天逃避潜伏期均逐渐缩短(P＜0.05)；与对照组比较,丙泊酚组和依托咪酯组第4、5天逃避潜伏期延长(P＜0.05).各组大鼠Ngb的表达量差异无统计学意义,而丙泊酚组和依托咪酯组bFGF和CaMKⅡ的表达量明显少于对照组(P＜0.05).结论 丙泊酚或依托咪酯可使幼年大鼠的空间学习记忆能力降低,其机制可能与降低海马bFGF和CaMKⅡ的表达有关.
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神经球蛋白对慢性高眼压小鼠视网膜神经节细胞损伤的保护作用
背景 神经球蛋白(Ngb)是2000年发现的球蛋白,可以在缺氧或氧化应激的环境中保护细胞.Ngb在视网膜神经元中呈高表达,提示视网膜很可能是Ngb发挥其功能的重要场所. 目的 研究Ngb对小鼠高眼压所致视网膜神经节细胞(RGCs)损伤的保护作用及作用机制. 方法 本研究分为体外实验和体内实验两部分.将体外纯化培养的成年野生型(WT)小鼠和本实验室培育的Ngb转基因(Ngb-Tg)新生小鼠RGCs用不同浓度的谷氨酸作用3d后,以dead/live双染试剂盒染色计算RGCs的存活率,比较Ngb对不同浓度谷氨酸环境下培养的RGCs存活率的影响.将聚苯乙烯荧光微球注入WT和Ngb-Tg小鼠前房内以制备小鼠慢性高眼压模型,将小鼠分为WT小鼠对照组(n=18)、Ngb-Tg小鼠对照组(n=18)、WT小鼠微球单次注射组(n=38)、Ngb-Tg小鼠微球单次注射组(n=38)、WT小鼠微球2次注射组(n=6)及Ngb-Tg小鼠微球2次注射组(n=6).另设WT小鼠PBS注射组(n=6)、Ngb-Tg小鼠PBS注射组(n=6)观察PBS前房注射对眼压的影响.分别于前房注射微球后即刻(对照组),3d及1、4、8周处死小鼠,用实时荧光定量PCR、Western blot和免疫组织化学法定量分析Ngb mRNA及其蛋白在视网膜中的表达变化和RGCs的存活率,并对比两种小鼠视网膜中过氧化物和ATP表达水平. 结果 5.0、7.5、10.0 mmol/L谷氨酸处理后Ngb小鼠RGCs存活率均明显高于WT小鼠,差异均有统计学意义(t=2.810、3.020、3.110,P＜0.01).WT小鼠微球单次注射组及Ngb-Tg小鼠微球单次注射组小鼠眼压均明显高于WT小鼠对照组及WT小鼠PBS注射组,高眼压状态持续至4周,2次微球注射后眼压复升,高眼压可维持至8周.WT小鼠微球单次注射组第3天视网膜中Ngb含量明显上调,而Ngb-Tg小鼠视网膜中Ngb呈持续高表达.与Ngb-Tg小鼠相比,WT小鼠RGCs凋亡率在前房注射微球后第1、4、8周均逐渐升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).1周时,Ngb-Tg小鼠微球单次注射组视网膜中DHE含量明显低于WT小鼠微球单次注射组(t=3.212,P=0.008),而ATP的含量则明显高于WT小鼠微球单次注射组(t=2.864,P＜0.01). 结论 Ngb可能是青光眼损伤的内源性神经保护因子,对高眼压所致RGCs损伤有保护作用,其机制可能是通过降低氧化应激和改善线粒体功能实现的.
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脑红蛋白的新研究进展
长期以来,血红蛋白和肌红蛋白被认为是脊椎动物仅有的2种携氧球蛋白.但是,在2000年,德国科学家Burmester在
上首次报道,在人和小鼠脑内存在一类新的球蛋白,基于它先在神经系统表达,我们叫它神经球蛋白(neuroglobin,NGB),又叫脑红蛋白[1].在过去的9年里,各国科学家掀起了一股研究脑红蛋白的热潮,尽管提出了大量各种假设,然而它的功能还是不能确定.目前研究主要集中在脑红蛋白作为一种新型的携氧载体实现血氧向组织的运输,缺血缺氧性损伤中对神经元的保护作用,去除活性氧和一氧化氮(NO),抑制细胞凋亡等方面.毫无疑问,脑红蛋白是一种新型、非常重要、功能多样的球蛋白. -
大鼠神经球蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
目的 克隆Wistar大鼠神经球蛋白(NGB)基因,通过原核表达制备其多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序证明该基因序列正确后,亚克隆人pET-28a(+)载体中,通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确.转化大肠杆菌BL21菌株,获得可溶性表达产物,经鉴定、纯化后免疫新西兰兔,分离血清,ELISA法测定抗体效价.结果 神经球蛋白多克隆抗体效价达1:100 000,此多抗可以与293细胞内表达的重组蛋白发生很好的抗原抗体反应.结论 成功制备了兔抗NGB的多抗,为后续研究提供了重要的实验材料.
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重组质粒pCDNA3.1(+)/Ngb对局灶性脑缺血大鼠脑保护作用的研究
目的 研究重组神经球蛋白表达质粒pCDNA3.1(+)/Ngb对缺血中的脑保护作用.方法 54只雄性大鼠按随机数字表法分为生理盐水组、空质粒组和重组神经球蛋白组,每组18只分别于皮质区两部位注射生理盐水、质粒pCDNA3.1(+)和重组质粒pCDNA3.1(+)/Ngb,并于注射后24 h采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血24 h模型.采用TTC染色、原位细胞凋亡检测、间接免疫荧光法和Western blot检测各组大鼠脑梗死面积,神经细胞凋亡状况和bcl-2蛋白表达变化.结果 经重组质粒pCDNA3.1(+)/Ngb处理的大鼠,其脑梗死面积和注射处缺血半暗带凋亡细胞数较其他两组显著减少(P＜0.01),注射处缺血半暗带bcl-2阳性细胞面积百分比显著增高(P＜0.01),bcl-2蛋白的表达上升约40%～50%.结论 质粒pCDNA3.1(+)介导大鼠神经球蛋白基因转入脑内可通过上调bcl-2蛋白表达抑制局灶性脑缺血神经细胞凋亡,起到局灶性脑缺血脑保护作用.
