首页 > 文献资料
-
胃癌相关基因GCRG224的克隆及其在大肠杆菌中的表达
目的:利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG224.方法:采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG224 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102/D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.结果:高效表达出相对分子量约16 800的重组融合蛋白.薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的22.3%.结论:在大肠杆菌中成功表达了GCRG224重组融合蛋白.
-
表达幽门螺杆菌热休克蛋白60克隆的构建
目的:构建含Hp热休克蛋白60(Hsp60)基因的重组载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究Hsp60的佐剂功能和免疫原性奠定基础.方法:提取Hp染色体基因,用PCR方法扩增Hsp60基因,将其克隆至表达载体pET-22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并通过免疫印迹实验研究其免疫原性.结果:分离得到了1.6kb的Hsp60基因片段,并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达,在37℃诱导表达3 h后,表达产物占细菌总蛋白的27.2%.表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,其中主要是包涵体的形式,目的蛋白占不溶性蛋白的76.6%.经免疫印迹证实该重组蛋白可以被Hp感染患者血清所识别.结论:成功地克隆并表达Hp Hsp60基因,为Hp疫苗的研制打下了基础.
-
幽门螺杆菌HspA与大肠杆菌LTB基因融合及表达
目的:构建和表达人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A亚单位(HspA)与E. coli不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的重组融合蛋白,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究.方法:采用PCR技术从人H pylori染色体DNA中扩增出354 bp的HspA基因,并克隆至pPLtB载体中与1tB基因融合,形成含有1tB-H spA融合基因的原核表达载体pPLH,并在工程菌E.coli JM109中诱导表达.结果:经序列分析,1tB-HspA融合基因由684个碱基组成,为编码228个氨基酸残基的多肽.SDS-PAGE和Westernblotting检测发现,融合蛋白的Mr 25×103,并与Hpylori感染的阳性血清发生抗原抗体反应,ELISA检测显示融合蛋白中存在LTB组分,并保持与LT受体-神经节苷脂GM1结合的活性.结论:LTB-HspA融合蛋白有可能用于Hpylori基因工程疫苗的研究.
-
幽门螺杆菌vacA毒性片段与hpaA融合基因的原核表达
目的:构建幽门螺杆菌vacA毒性片段(v)与hpaA融合基因的原核表达载体,并诱导表达,为制备具有治疗与预防作用的疫苗奠定基础.方法:通过设计带有编码IL-3N端12个氨基酸引物,用PCR技术从pQE30-V质粒扩增出有接头的v基因,克隆至质粒pTrc99A-HpaA中与hpaA融合.将融合基因插入原核表达载体pQE30,再将pQE30-V-HpaA转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达结果,Western blotting鉴定其抗原性.结果:融合蛋白的相对分子量约为65 000,能与幽门螺杆菌感染的人阳性血清发生抗原抗体反应.结论:重组表达质粒pQE30-V-HpaA表达成功,为进一步研究其免疫学活性及制备疫苗提供了材料.
-
环氧化酶-2表达与老年人非小细胞肺癌临床病理特征的关系
非甾体类抗炎药(NSAIDs)作用靶点为环氧化酶,环氧化酶是催化花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶.目前已被证实至少有2种同工酶COX-1和COX-2.COX-2被认为是诱导型反应基因,在正常组织中表达低下或者不能检出,但可被细胞因子、癌基因等诱导表达,并参与肿瘤的发生、发展[1].我们对44例老年人非小细胞肺癌组织中COX-2表达进行检测,探究其与老年人肺癌浸润、转移及其预后的关系.
-
神经生长因子与创伤性颅脑损伤
神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是早发现和典型的神经营养因子(neurotrophicfactors,NTFs),具有促进神经元分化、保护效应神经元、诱导神经纤维定向生长和再生等多种效应.许多研究表明创伤性颅脑损伤(traumatic braininiury,TBI)能触发损伤组织中多种营养因子的表达,其中NGF能被多种损伤因素所诱导表达,本文就NGF与TBI的研究进展作一综述.
-
NSAIDs及选择性COX-2抑制剂对骨、肌腱、韧带愈合影响的研究进展
非甾体抗炎药(Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs, NSAIDs)可通过降低环氧合酶活性抑制前列腺素(prostaglandin,PGs)的合成,从而降低组织的炎症反应程度,并减轻患者的疼痛反应。其中,环氧合酶是催化花生四烯酸转换为PGs和相关化合物的限速酶。目前已知的环氧合酶有3种:COX-1、COX-2、COX-3。其中,COX-1属于“管家基因”,可在全身大部分组织中持续表达,调节生理性 PGs的合成;COX-2是“诱导型基因”,在人体大部分组织中为诱导性表达,常在炎症、创伤及疼痛情况下由促炎性因子诱导表达;而COX-3则是近年在狗和大鼠实验中发现,可能与吲哚美辛诱导的低温麻醉及痛觉缺失有关的一种COX的新亚型[1-2]。
-
诱导表达人IFITM3的293细胞株的建立及其对H1N1型流感病毒侵染作用
目的 建立诱导表达IFITM3蛋白的293细胞株,为进一步研究人IFITM3对H1N1型流感病毒侵染的作用及其分子机制提供细胞模型.方法 构建IFITM3/pcDNA5/FRT/TO expression vector质粒及诱导表达细胞株,建立H1N1型流感病毒假病毒评价系统,利用蛋白印迹(Western blot)和荧光素酶报告基因对筛选的诱导表达细胞株功能进行检测.结果 建立的293诱导表达细胞株能够很好表达目的蛋白,且诱导表达出来的IFITM3蛋白使H1N1型流感假病毒感染率下降97%(t=38.08、P<0.001),使水泡性口炎假病毒(VSVpp)感染率下降68%(t=54.56、P<0.001),而阴性对照组小鼠白血病假病毒(MLVpp)感染率(t=1.282、P=0.2208)和拉沙假病毒(LASVpp)感染率(t=0.4814、P=0.6377)无显著影响.结论 IFITM3蛋白诱导表达细胞株可以显著抑制H1N1型流感病毒感染,为进一步深入研究IFITM3抑制流感病毒感染的作用机制和分子机理提供了细胞模型和实验基础.
关键词: 干扰素诱导跨膜蛋白3 H1N1型流感病毒 假病毒 诱导表达 防御分子 -
嗜麦芽寡养单胞菌Ⅰ类整合酶基因检测及定位表达研究
目的:检测临床分离多药耐药嗜麦芽寡养单胞菌的整合酶基因分型与定位表达,研究嗜麦芽寡养单胞菌整合酶介导多药耐药机制,为开发新药物奠定基础。方法筛选2010-2012年下呼吸道医院感染患者中通过VITEK‐IMS系统分离的73株多药耐药嗜麦芽寡养单胞菌为试验菌株;应用RT‐PCR、DNA菌落与印迹杂交、质粒接合试验对多药耐药嗜麦芽寡养单胞菌,进行Ⅰ类整合酶基因检测、同源性分析及定位表达检测。结果Ⅰ类整合酶基因检出31株,检出率42.4%,Ⅱ类整合酶基因检出8株,检出率10.9%,5株同时带有Ⅰ+Ⅱ类整合酶基因,检出率为6.8%;Ⅰ类整合酶阳性菌株质粒接合试验阴性,染色体DNA印迹杂交试验阳性。结论Ⅰ类整合酶基因是嗜麦芽寡养单胞菌多药耐药的主要因素,推测Ⅰ类整合酶基因可位于染色体上。
-
关键词:
-
人谷胱甘肽硫转移酶Pi基因的克隆及表达
目的克隆并表达人谷胱甘肽硫转移酶Pi(GSTPi)基因,为毒理学、遗传药理学及肿瘤的化学预防研究提供应用基础.方法用RT-PCR技术从人胎盘/肺脏组织获取GSTPi基因的cDNA序列,将其扩增产物GSTPi基因插入到原核表达载体pMAL-c2x中,鉴定重组表达质粒,并进行诱导表达.结果构建了原核表达载体pMAL-c2x-GSTPi,通过诱导,在85kDa的表达量约达到35%.结论实现了解毒酶基因GSTPi的克隆和高效表达菌株的构建.
关键词: 人谷胱甘肽硫转移酶Pi(GSTPi) RT-PCR 克隆 诱导表达 -
大蒜素对肺癌A549细胞株β防御素表达的影响
目的 β防御素(human beta defensins,HBD)是人体产生的天然抗菌物质,本研究通过大蒜素对β防御素表达的影响,探讨大蒜素的免疫调节机制.方法 采用含大蒜素的细胞培养液处理人肺癌A549细胞,观察其对A549细胞不同种类β防御素mRNA表达水平的影响.结果 含5 μg/mL的大蒜素细胞培养液可使HBD3 mRNA的表达上调,而对HBD2和HBD1的表达无显著影响.结论 大蒜素可以使A549细胞HBD3的表达升高,这可能是大蒜素参与人体免疫调节,提高机体免疫力的机制之一.大蒜素处理后HBD3升高而HBD2水平,不变进一步证实了HBD3与HBD2的诱导表达途径不同.
-
人血管内皮细胞生长因子在大肠杆菌中的表达
应用DNA重组技术,将编码人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的基因插入到原核表达载体pET32M中,与载体中的硫氧还蛋白(相对分子质量约1.4万)基因融合.经双酶切鉴定、序列测定及工程菌初步表达分析,表明该重组质粒在大肠杆菌BL21中有明显表达.表达的硫氧还蛋白-VEGF融合蛋白的相对分子质量约为3.2万,主要以包涵体形式存在,也有少量重组蛋白为可溶性蛋白,Western印迹实验和生物活性分析证实可溶性的重组蛋白具有hVEGF的抗原性和促血管生长活性.
关键词: 血管内皮细胞生长因子 融合蛋白 诱导表达 -
MT启动子控制的GFP基因在CHO细胞中的诱导表达
用羊金属硫蛋白(MT)启动子构建含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的真核表达载体,经脂质体介导在培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行诱导性表达.结果:构建的GFP基因表达载体能在CHO细胞中进行表达,用硫酸锌诱导可提高GFP的表达量.
-
内质网氨肽酶与银屑病研究进展
内质网氨肽酶1(ERAP1)及其异构体内质网氨肽酶2(ERAP2)都属于锌指金属基质肽酶M1家族中的“缩宫素酶亚家族”,在人类细胞均由IFN-γ和TNF-α诱导表达[1,2].参与许多生化过程:在细胞内质网中参与内源性抗原肽的修饰及递呈,被认为是内质网中参与内源性抗原肽修饰的关键酶[3].ERAP1还参与细胞因子受体(如促进肿瘤坏死因子受体1(TNFR1),IL-6α受体和IL-1β受体胞外结构域)的脱落,使之成为可溶性受体.
-
工程菌发酵培养浅析
利用微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物是目前工业化生产基因工程药物的主要方法.工程菌发酵培养主要包括育种技术、发酵过程的优化等.其中良好的生产菌种是发酵工作的中心环节.在传统的发酵工业中,菌种的诱变和筛选工作起着非常重要的作用.在七·五期间,国家发展高技术产业确定后,基因工程技术(重组DNA技术)为发酵工程开辟了广阔的领域.生物技术产品作为优先开发的领域之一,给我国生命科学领域带来了一场深刻的革命,科学家们利用基因操作技术克隆出目的基因,然后将其组装入表达质粒,转染到宿主细胞中,经过发酵诱导表达目的产物以及纯化等一系列程序生产出所需要的目的产物.特别是医疗用蛋白、多肽类治疗药物的研制和开发在全国已蓬勃兴起,时至今日,已有多种蛋白、多肽类药物研制成功并应用于临床.诸如重组大肠杆菌表达生产人干扰素,白细胞介素和人生长激素以及集落刺激因子等.然而要实现基因工程工业化生产,除了要构建高效的载体-宿主系统外,基因工程菌的发酵过程控制也是十分重要的.
-
丹参Pht1基因家族的挖掘、鉴定及其特征性分析
目的 对丹参Salvia miltiorrhiza基因组中存在的Pht1基因家族成员进行挖掘、鉴定和功能预测分析,为进一步研究和利用Pht1这一功能基因家族奠定基础.方法 基于丹参基因组数据库及NCBI数据库,借助生物信息学方法,首先筛选获得丹参Pht1家族候选基因的序列,进而对其进行多重序列比对、保守结构查找及系统进化树构建,后完成其特征性分析和生物学功能预测.结果 从丹参基因组中共挖掘出了12个新的Pht1候选基因,加上已报道的Smpht1,共13个Pht1成员,其同源性高达74.34%,并对9个成员提供了比较可靠的功能注释.该家族基因中,Smpht1&Sm1、Sm4&Sm6、Sm5&Sm11这3对成员可能属于彼此协同进化的同功能基因;Smpht1、Sm1、Sm3、Sm5、Sm7及Sm11这6个成员在丹参根部表达,除了受缺磷特异性诱导表达的Sm7和不受磷素供缺因素所影响的Sm3以外,其余4个均有可能属于缺磷诱导增强表达型基因,进而对丹参磷素吸收起着重要作用;另外,Sm7与Sm16还有可能在丹参花器官中表达而参与植株花期磷素平衡的调节;Sm14则很有可能是一个菌根诱导特异性表达的磷转运基因.结论 首次系统地从丹参基因组中挖掘筛选出Pht1基因家族,并发现了具有特征性生物学功能的成员,这将为进一步阐明Pht1在丹参生长发育和药效成分代谢中所起作用的相关研究提供背景支持和思路参考.
-
热适应诱导大鼠下丘脑基因的差异显示
机体经过一段时间的热环境锻炼后均能获得一定的热适应能力,但它的形成机制目前还不清楚.细胞水平的研究表明热休克蛋白的表达增加是细胞热适应(cellular heat adaptation)的重要原因和标志,但是人体在实现热适应的过程中是否有基因表达方面的改变以及是否存在一种方法可以促使相关基因的表达以帮助机体快速实现热适应等问题尚无明确答案.差异显示技术自从1992年创立以来,就不断被用于基因差异表达方面的研究,陆续发现了如苯丙胺调控转录的大鼠脑基因,人胚胎癌细胞分化为神经细胞所诱导表达的MAL基因等诸多重要基因.本实验旨在运用差异显示技术探求热适应大鼠下丘脑的差异表达基因,希望初步解决上述问题.
-
大鼠局灶性脑缺血-再灌注后caspase-8和caspase-9 mRNA及蛋白质表达
1994年MacManus等[1]首先报告大鼠全脑缺血后存在神经元凋亡.近10年来,关于脑缺血后细胞凋亡机制的研究取得了巨大进展.已知脑缺血后可有多种基因被诱导表达,这些基因编码的蛋白质产物直接或间接参与了凋亡的调控.天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族(cysteinyl aspartate specific protease,caspase),是细胞凋亡过程中重要的蛋白酶,细胞凋亡的后实施是通过caspase的激活而实现的[2].
-
金黄色葡萄球菌血浆凝固酶克隆、表达、纯化及其生物活性研究
[目的]克隆表达金黄色葡萄球菌血浆凝固酶,获取重组血浆凝固酶并分析其生物学活性,探讨其在口腔术后止血方面的应用前景.[方法]提取金黄色葡萄球菌基因组,以此为模板,利用PCR技术扩增出编码血浆凝固酶(coagulase,Coa)的基因,通过分子生物学方法构建表达带有his标签血浆凝固酶的pET21a(+)-hiS-coagulase重组质粒.经PCR分析、酶切分析和测序鉴定后,转化至大肠杆菌BL21内.经IPTG诱导表达目的蛋白,采用SDS-PAGE法分析重组蛋白的表达水平情况并经his柱纯化,获取血浆凝固酶重组蛋白,测定其对兔血浆及人血浆的凝固作用.[结果]PCR结果和酶切分析显示,得到了 2 100 bp左右的核酸片段,与his-coagulase片段大小一致,测序结果也与预先设计序列一致;重组质粒经诱导表达后获得相对分子质量为 78 × 103左右蛋白条带,纯化目的蛋白经测定具有促兔血浆及人血浆凝固活性.[结论]本研究成功构建了表达血浆凝固酶的重组质粒,获得了相应的工程菌株,以及具有促凝活性的重组血浆凝固酶,为口腔手术术后止血提供了新的方向.