首页 > 文献资料
-
结核分枝杆菌S1蛋白的原核表达条件优化
目的 对结核分枝杆菌S1蛋白的表达质粒进行表达条件优化.方法 将构建的表达质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白,对细菌浓度、IPTG终浓度、诱导温度和诱导时间进行筛选,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测不同表达条件的细菌培养上清中目的蛋白的表达量.结果 SDS-PAGE检测中,在细菌浓度OD600为0.8,IPTG的终浓度为0.5 mM,诱导表达的温度为25℃,诱导16 h的条件下,S1蛋白的条带灰度值和相对占比为本体系下佳.结论 建立了S1蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中诱导表达的佳条件.
-
龋病替代疗法中乙醇脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达
目的在成功构建运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因(adhB)置换变链乳酸脱氢酶基因(ldh)重组质粒pMDLA的基础上,构建表达载体pET-28a-adhB,在大肠杆菌中进行目的基因的诱导表达.方法应用DNA重组技术构建表达载体,通过SDS-SAGE和乙醛指示平板鉴定目的基因的表达效率.结果成功构建了表达载体pET-28a-adhB,通过SDS-PAGE检测可见特异性蛋白表达条带,在乙醛指示平板上可见阳性菌落.结论根据测序及大肠杆菌表达结果,可确定该重组质粒中adhB已完全替换ldh,为下一步构建乳酸脱氢酶活性缺陷的变链突变株奠定基础.
-
热休克蛋白70与妇产科疾病
热休克蛋白(Heat-shock protein ,HSP)普遍存于在生物细胞中,是一组具有重要生理功能、高度保守的蛋白质分子.应激状态下可被诱导表达,故又称应激蛋白.根据分子量大小可分为:HSP110、HSP70、HSP60、小分子2HSP及泛素等几个家族[1];其中HSP70在细胞生长、发育、分化、基因转变等方面发挥着重要作用.其生物学功能主要表现在应激状态下保护细胞生命活动、维持细胞的生存.HSP70与多种蛋白源形成复合体,并通过其结合和解离调节靶蛋白的活性与功能,但自身不参与靶蛋白的组成,又称伴侣蛋白.HSP70在一些增生性疾病中有过度表达,如肿瘤形成过程中,肿瘤细胞不断增殖,合成代谢增强,需要大量HSP70来调节和稳定这一异常增殖过程[2].正常细胞中,HSP70的表达也受细胞周期调控,而肿瘤细胞中突变或异常蛋白质的存在刺激了HSP70的合成,使其呈现持续的高诱导表达状态[3].本文主要综述HSP70在妇产科学特别是肿瘤方面的一些研究进展.
-
诱生型一氧化氮合酶与狼疮肾炎
诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)是体内合成内源性一氧化氮(nitric oxide,NO)的三种同工酶之一,在某些细胞受到免疫或致炎因子刺激时被诱导表达,其催化合成的NO量多且维持时间较长,在参与机体免疫防御的同时可能对组织细胞造成一定的免疫损伤.近年来许多研究表明,iNOS及其催化合成的NO在狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)的发生、发展中发挥着某些重要作用.本文拟对这方面的研究作一简要综述.
-
系统性红斑狼疮相关新基因IFTT3的功能研究及其意义
探索新基因IFTT3的功能、分子作用机制及其在SLE致病机制中的意义,为SLE的发病机制和治疗策略研究提供新的思路.检测了67例SLE患者及23名正常对照外周血白细胞中IFTT3的表达,并与患者临床特征行统计学分析.采用Realtime PcR法检测IFTT3在NZB/W F1狼疮鼠多脏器中的表达,并应用原位杂交的方法观察IFTT3在狼疮鼠肾脏组织中的定位,同时,使用干扰素(IFN)-α及Poly(I:C)、LPS、R848、CpG DNA等多种Toll样受体(TLR)刺激剂研究IFTT3的诱导表达,探讨狼疮中IFTT3诱导上调的可能机制.
-
变形链球菌表面蛋白可变区(V+)基因克隆与表达
目的分离变形链球菌表面蛋白可变区(V+)基因,构建V+表达克隆.方法用PCR从sr基因中扩增目的基因片段V(+),亚克隆入中间载体pCR2.1和表达载体pET21a(+).对重组体进行诱导表达并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析.结果 PCR扩增产物为1.16kb的DNA带,亚克隆入载体,获得重组克隆pCVf和重组表达克隆pSRVf,表达产物为43kDa抗原,可以被抗Ⅰ/Ⅱ抗体特异性地识别.结论本试验成功地构建了携带V+基因片段的表达克隆pSRVf.
-
犬黑皮质素受体3原核表达载体的构建与表达
背景:近年黑皮质素受体家族在体内能量平衡中的作用越来越受到重视.黑皮质素受体3基因突变是引起体质量增加的重要因素之一,但是目前对黑皮质素受体3的深入研究很少,且未见在蛋白水平上检测其表达的单克隆抗体.目的:构建犬黑皮质素受体3基因编码区的原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达.方法:以Beagle犬基因组DNA为模板,设计特异性引物,经PCR技术扩增目的片段后,克隆到pMD18-T载体上,双酶切鉴定以后将目的基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coli DH5α,筛选阳性克隆,DNA测序检测插入序列的正确性.将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC3R转化到E.coli BL21内,经IPTG诱导后,利用Western blot检测犬黑皮质素受体3融合蛋白的表达.结果及结论:成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC3R,经DNA测序证实插入序列与Genebank上公布的序列一致.此重组体经诱导后能在E. coli BL21内表达犬黑皮质素受体3融合蛋白,为进一步获取犬黑皮质素受体3的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究大黑皮质素受体3蛋白的结构和生理功能提供帮助.
-
CD4+CD25+调节性T细胞与母胎耐受的研究进展
在正常妊娠时,胎儿作为"半同种移植物"不被母体排斥即母胎免疫耐受机制一直受到人们的关注.多年的研究结果表明母胎耐受的建立和维持涉及到多种机制的参与,如:妊娠早期胎儿滋养层细胞MHCI表达与母体子宫NK(uNK)细胞的相互作用、胎盘分泌的白血病抑制因子(LIF)及保护抗体、外周免疫无反应性、滋养层细胞和子宫巨噬细胞表达的吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)通过分解色氨酸来抑制T细胞的活性、滋养层细胞表达FasL诱导表达Fas的活化T细胞的凋亡、补体调节蛋白的表达等因素.
-
OX40/OX40L信号与自身免疫性疾病
1 OX40/OX40L在免疫应答中的作用1.1 OX40与OX40L的生物学特征 OX40(CD134)是TNFR超家族成员之一,为Ⅰ型跨膜糖蛋白,相对分子质量约为48~50 kD[1].人的OX40基因位于第1号染色体上,并与其他TNF受体家族成员如CD30、4-1BB、TNFR-Ⅱ和DR3成簇排列在人染色体lp36的远侧带.不同于CD28的组成性表达,OX40属活化后诱导表达,即只表达于活化的T细胞表面,且主要是CD4+ T细胞,CD8+ T细胞表面有少量表达.OX40的表达时相较晚且短暂,未致敏T细胞在TCR和MHC-肽复合物结合24~48小时后OX40表达高峰,由于内在化的下调机制,72~96小时开始下降,至120小时降至原表达水平,而效应T细胞表达OX40要迅速得多,在抗原刺激后4小时即可表达.
-
核蛋白1在肿瘤发展过程中的作用及相关研究进展
核蛋白1(NUPR1),又称为p8、com1,是在大鼠胰腺炎模型中首先鉴定得到的小分子核蛋白,其在急性胰腺炎的发展过程中,可被强烈而迅速地诱导表达[1]。在应激条件下,NUPR1表达通常呈上调趋势,说明NUPR1可以被宿主体内的微环境所影响。在非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌及前列腺癌等多种肿瘤细胞中, NUPR1存在差异表达,并通过影响细胞的生长、凋亡及转移等过程参与肿瘤的发生、发展。因此,针对NUPR1的研究有助于在肿瘤治疗过程中发掘新的潜在的治疗手段。本文就核蛋白1在肿瘤发展过程中的作用作一综述。
-
COX-2在乳腺癌组织的表达及其临床病理意义
环氧合酶(Cyclooxygenase,COX)是催化花生四烯酸转化为前列腺素的重要限速酶,它有2种同工酶:COX-1和COX-2.COX-1在大多数组织中均有表达,参与机体正常的生理功能,如保护胃黏膜,控制血小板聚集等; COX-2静息时并不表达,但在细胞因子、生长因子、癌基因等刺激因子的作用下可被诱导表达.
-
链球菌溶血素与真菌果胶酶融合表达及纯化条件的优化
目的 优化链球菌溶血素(streptolysin O,SLO)与真菌果胶酶(pectin lyase,PL)的融合表达及纯化条件.方法 将活化培养的工程菌以2%接种量接种于发酵液体培养基中,于37℃,200 r/min培养至不同生长期(A600值分别为0.6、0.8和1.0),分别于不同温度(10、15、20、25、30、35和37℃)及加入不同终浓度IPTG(0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8和1.0 mmol/L)条件下诱导表达不同时间(6、12、20、24、36、48和60 h).将诱导表达的融合蛋白进行Ni离子亲和层析纯化,对纯化中的上样缓冲液(binding buffer,分别含0、5、10、15、20、25、30 mmol/L咪唑)、清洗缓冲液(washing buffer,分别含0、5、10、20、30、40、50、60 mmol/L咪唑)及洗脱缓冲液(elution buffer,分别含100、200、500、1 000 mmol/L咪唑)的咪唑浓度进行优化.结果 佳诱导表达条件为:工程菌培养至A600为0.8时,加入0.4 mmol/L IPTG,于20℃诱导24 h,目的蛋白的相对分子质量约91 500,占全菌总蛋白的38.6%,溶血活性可达4.0×107U/ml.佳纯化条件为:binding buffer和washing buffer佳咪唑浓度为5和60 mmol/L,elution buffer 分别使用200和500 mmol/L咪唑进行阶段性梯度洗脱,纯化产物纯度可达95%.结论 成功优化了SLO与PL融合蛋白的表达及纯化条件,纯化后获得了纯度较高的融合蛋白,为进一步研究SLO蛋白的性质及应用奠定了基础.
-
HIV-1 Gag蛋白酵母工程菌表达条件的优化
为了探索构建的表达HIV-1核心蛋白Gag酵母工程菌GS115/pPICGAG的佳表达条件,我们将该酵母工程菌分别在不同条件下进行诱导表达,通过ELISA检测培养上清中目的蛋白的表达量来分析佳表达条件,并分析了浓缩上清时适硫酸铵饱和度.
-
鹿茸富脯氨酸多肽-APRP基因融合表达载体的构建及表达
目的:构建鹿茸富脯氨酸多肽(APRP)基因融合表达载体,并诱导表达融合蛋白GST-APRP.方法:以鹿茸顶端组织总cDNA为模板,PCR方法扩增目的片段,连接pMDTM18-T载体,转化E.coli DH5α进行TA克隆.酶切与测序鉴定合格后,将目的片段与pGEX-6P-1质粒连接,完成pGEX-6P-1-APRP融合表达载体的构建.利用原核表达系统进行初步诱导表达.SDS-PAGE蛋白电泳检测蛋白表达情况.结果:PCR成功扩增出目的基因片段,目的基因片段大小为216 bp.提取表达载体质粒经酶切及测序分析证实pGEX-6P-1-APRR融合表达载体构建成功.利用终浓度为0.5 mMIPTG诱导,融合蛋白成功表达,分子量为35 kDa.结论:目前利用基因工程技术获得特定的鹿茸多肽的报道很少.本研究结果表明,利用原核表达系统可在体外对鹿茸富脯氨酸多肽基因(APRP)进行融合表达,并且融合蛋白GST-APRP以可溶形式表达,有利于进一步研究APRP.这也为研究其他鹿茸多肽单体成分提供重要参考.
-
诱导表达p27对HEK293细胞生长代谢的影响
目的:研究诱导表达p27对HEK293细胞生长和代谢的影响.方法:将pTet-on载体和响应于Dox的p27诱导表达载体共转染HEK293细胞,随机挑选单克隆细胞株.以细胞周期分布和活细胞密度为主要观察指标,考察稳定转染的细胞在Dox诱导下的细胞生长;以Qglc、Qlac和Qgln为主要观察指标,考察转染细胞在Dox诱导下的细胞代谢.结果:p27基因的表达使HEK293细胞的增殖速度显著降低,G1期细胞比例显著升高,葡萄糖消耗和乳酸生产减少.结论:诱导表达p27基因是对HEK293细胞进行G1期阻滞的一种有效策略.
-
HPV16L1重组蛋白在甲醇营养型酵母菌中的诱导表达及鉴定
目的 HPV16L1重组蛋白的表达为研制HPV16L1预防性蛋白疫苗及诊断试剂盒打下基础.方法 pPIC3.5-HPV16L1/GS115阳性菌株,经0.5%甲醇诱导,运用SDS-PAGE电泳检测L1蛋白;用鼠抗HPV16L1单克隆抗体,经Western Blotting检测蛋白的特异性;在透射电镜下观察类病毒颗粒(VLPs).结果 SDS-PAGE检测结果表明,在55KD处有诱导蛋白带的出现;经Western Blotting验证,该蛋白能与HPV16L1单克隆抗体特异结合,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白;电镜下见到了直径约为50nm、形态结构与天然病毒颗粒极其相似的VLPs.结论 pAIC3.5-HPV16L1重组质粒在甲醇营养型酵母菌中可经甲醇诱导产生HPV16L1晚期蛋白,该蛋白在酵母菌中可自我组装成VLPs.
-
人类β-防御素-2的研究进展
防御素(defensins)是已知发现的内源性抗生素肽家族中大的亚家族,是一类重要的抗菌肽分子[1],它普遍存在于动物、植物、昆虫及人类体内,分子结构相对稳定,且又具有较为强力广谱抗菌、抗病毒、抗螺旋体及肿瘤等生物学活性.目前研究已经发现的人类β-防御素(HBD-1~6)中,β-防御素-2(HBD-2)广泛表达于皮肤和黏膜上皮细胞中,其诱导表达高、作用特点强、抗菌活性广.它在参与机体皮肤及黏膜免疫中发挥重要作用,β-防御素-2被认为是人体内环境对外来病原微生物免疫的第一道防线[2].现对其研究进展作一综述.
-
phoP/phoQ激活的启动子应用于以减毒沙门菌为载体的疫苗系统
phoP/phoQ为沙门菌的双成分调节子,phoQ可感受巨噬细胞中一些因子的改变,显示组氨酸激酶活性,使phoP氨基端特定的残基磷酸化,磷酸化后的phoP结合于特定的启动子,诱导或抑制一系列基因的表达.受phoP/phoQ激活的pagC基因的启动子ppagC能有效地驱动外源基因在鼠伤寒杆菌中的表达,激发宿主抗该外源蛋白的抗体.使用ppagC可克服在减毒沙门菌中因外源基因的组成性表达而带来的低表达和表达质粒不稳定的问题.因此,ppagC在以减毒沙门菌为载体的疫苗研制中具有很好的应用前景.
-
金属硫蛋白的诱导表达及其与肝纤维化的关系研究
金属硫蛋白(MT)是一类金属含量高、富含半胱氨酸、缺乏芳香族氨基酸、组氨酸含量极少的低分子量金属结合蛋白.目前MT在心肌纤维化、肾纤维化中的作用研究较多,尤其是糖尿病性心肌病中报道较多,而在肝纤维化过程中的具体作用机制尚不十分清楚.由于MT是一种可在多种条件下诱导表达的物质,部分中药制剂也可诱导其产生从而发挥治疗作用[1],因此我们设计本实验,研究在四氯化碳(CCl4)中毒性肝纤维化大鼠模型中,抗肝纤维化中药制剂丹芍化纤胶囊能否诱导肝组织中MT的表达,并进一步探讨MT与肝纤维化之间的可能联系.
-
环氧合酶-2抑制剂尼美舒利对大鼠肝纤维化的影响
环氧合酶-2(COX-2)是一种诱导酶,在大部分正常组织中无表达,可在炎性介质等的作用下诱导表达[1].Nanji等[2]在肝纤维化的研究中发现,COX-2的表达与肝内炎症有关.本实验应用选择性COX-2抑制剂尼美舒利(NS)观察其对大鼠肝纤维化的影响.γ-干扰素(IFN)具有抗肝纤维化的作用已成共识,故以其作疗效对照.