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小鼠白细胞介素5真核表达质粒pVAX1-mIL-5的构建及其体外表达
目的构建能表达小鼠白细胞介素5(mIL-5)的质粒并鉴定其蛋白的体外瞬时表达. 方法以含有mIL-5cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得小鼠IL-5基因片段后,定向插入真核表达载体pVAX1中,获得重组表达质粒pVAX1-mIL-5.通过双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定.采用间接免疫荧光技术检测pVAX1-mIL-5在HeLa细胞的瞬时表达.结果酶切、PCR及测序鉴定证实,插入片段正确,间接免疫荧光检测表明其可以在HeLa细胞中瞬时表达. 结论构建的真核表达质粒pVAX1-mIL-5可以在HeLa细胞中瞬时表达小鼠IL-5的蛋白,为下一步利用IL-5作为DNA疫苗黏膜免疫佐剂研究奠定了基础.
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pcDNA3.1(+)-NPM1真核表达质粒构建
目的 构建pcDNA3.1(+)-NPM1真核表达质粒,体外转染人膀胱移行细胞癌pumc-91细胞并观察其表达情况.方法 设计引物,采用PCR扩增核仁磷蛋白1(Nucleophosmin,npm1)基因编码序列;运用基因重组方法对其进行双酶切,插入pcDNA3.1(+)载体,经菌液PCR、测序对重组质粒进行鉴定.将成功构建的质粒经脂质体介导转染至pumc-91细胞,Western blot验证蛋白表达情况.结果 经菌液PCR、测序鉴定表明成功构建pcDNA3.1(+)-NPM1质粒,将成功构建的质粒转染至pumc-91细胞,Western blot证实转染pcDNA3.1(+)-NPM1表达质粒的pumc-91细胞npm1蛋白过表达.结论 成功构建pcDNA3.1(+)-NPM1重组质粒,为进一步研究NPM1蛋白的功能奠定基础.
关键词： 核仁磷蛋白1 质粒构建 pcDNA3.1(+) -
pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒的构建及其在MCF-7细胞中的表达
目的 构建低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒,并在MCF-7细胞中进行功能验证.方法 利用RT-PCR扩增带有Xba Ⅰ和HindⅢ酶切位点的HIF-1α编码基因,插入T载体测序正确后,克隆入pcDNA3真核表达载体,然后将其转染MCF-7细胞.Western blot和双荧光素酶报告基因法分别检测HIF-1α表达及其DNA结合活性;实时定量PCR检测HIF-1α对低氧诱导基因C-MET mRNA表达的影响;Caspase3/7活性检测来初步判断HIF-1α对低氧MCF-7细胞凋亡的影响.结果 酶切及测序结果 证明pcDNA3-HIF-1α表达质粒的DNA序列完全正确.将此质粒转染MCF-7细胞后,HIF-1α蛋白表达明显增加,它不仅增强了pGL3-EPO-HRE报告基因活性而且促进了C-MET mRNA的表达,同时还降低了低氧MCF-7细胞中Caspase3/7的水平.结论 pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒构建成功,它不但具有很强的DNA结合和诱导活性,而且在细胞低氧过程中具有一定的抗凋亡作用.
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pGL3-EPO-HRE报告基因质粒的构建及功能鉴定
目的 构建串联低氧反应元件(HRE)报告质粒pGL3-EPO-HRE并进行功能验证.方法 按照人促红细胞生成素(EPO)基因3'末端HRE增强子序列,人工设计合成首尾2段3'末端部分互补的单链DNA,然后通过退火及延伸合成两端带有Mlu I和BglⅡ酶切位点的包含3个串联排布的HRE的双链DNA,克隆到T载体测序正确后,将其插入到pGL3-promoter报告载体.构建好的pGL3-EPO-HRE分别与pcDNA3-HIF-1α和pcDNA3共转染MCF-7细胞,经氯化钴(CoCl2)作用24h后测定报告基因的活性.结果 质粒测序及酶切结果正确,瞬时转染实验显示,在常氧条件下,CoCl2及pcDNA3-HIF-1α可以使pGL3-EPO-HRE报告基因的活性增高约10倍(P＜0.01),而且两者共同作用可以使报告基因的活性进一步增高约30倍(P＜0.01).结论 pGL3-EPO-HRE可以与低氧诱导因子-1(HIF-1)结合并被激活,可以用来鉴定和检测细胞中HIF-1的表达及蛋白活性.
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上调分子伴侣 mortalin 经由 MAPK-ERK 信号转导通路促进卵巢癌细胞增殖
目的：通过获得稳定表达mortalin的卵巢癌细胞株（A2780、A2780/cis），检测mortalin与卵巢癌细胞增殖的关系及可能机制。方法 CCK-8实验检测mortalin过表达组和对照组细胞增殖的变化；通过流式细胞术检测mortalin过表达对卵巢癌细胞周期的影响；Western blotting检测mortalin上调表达后，卵巢癌细胞中MAPK/ERK和JNK/SAPK信号通路蛋白的变化。结果 Mortalin 上调表达促进卵巢癌细胞 A2780和 A2780/cis 的增殖。Mortalin通过加快卵巢癌细胞由G1期快速过渡到G2/M期，促进细胞增殖，且MAPK/ERK信号通路参与该过程。结论 Mortalin上调表达促进了卵巢癌细胞的增殖，与其对MAPK-ERK信号通路的激活有关。
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HCV NS2对细胞凋亡及DNA损伤应答信号的影响
目的 构建HCV NS2的真核表达质粒,了解HCV NS2蛋白对细胞凋亡及DNA损伤应答信号的影响. 方法 以pCMV-tag2B为载体,采用双酶切法构建HCV NS2基因重组载体pCMV-tag2B-NS2,进行酶切分析和DNA测序鉴定;在Huh7细胞中转染相应质粒,分别采用Western blot和DAPI染色分析CPT处理或未处理时NS2对DNA损伤应答信号和凋亡的影响,采用流式细胞术检测NS2蛋白对细胞周期的影响. 结果 酶切和DNA测序证实pCMV-tag2B-NS2重组质粒构建成功,HCV NS2蛋白可在Huh7细胞中正确表达并且活化DNA损伤应答信号,但不影响细胞周期进程;DAPI染色检查,NS2转染组和空载体转染组细胞凋亡率分别为(15.33±0.88)％和(4.66土0.88)％,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 成功构建了真核表达载体pCMV-tag2B-NS2,其表达产物HCV NS2蛋白可诱导DNA损伤应答通路的活化并且促进Huh7细胞凋亡.
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重组膜联蛋白Ⅱ表达载体构建及其促纤溶特性研究
膜联蛋白Ⅱ(annexinⅡ)是纤溶酶原和组织型纤溶原激活物的共同受体.本研究旨在探讨annexinⅡ引起急性白血病及其它肿瘤患者原发性纤溶亢进的分子病理机制,阐明annexinⅡ促纤溶活性,为探讨annexinⅡ在凝血障碍中的作用提供理想的载体模型.用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增annexinⅡ基因片段,经纯化及连接,用脂质体转染入HL-60细胞中表达;用多光子激发的共聚焦显微镜观察其表达产物的胞内分布及结构特性;用流式细胞术及Western印迹对转染的细胞表达进行定量及定性分析,并揭示其对纤溶酶活性的影响.结果显示:成功地构建了pZeoSV2(+)/ANNⅡ真核表达质粒,经转染HL-60细胞后,可表达annexinⅡ活性蛋白,荧光检测显示其表达蛋白分布在转染细胞的膜表面;FCM检测annexinⅡ在转染后48小时呈高表达;annexinⅡ可显著增加纤溶酶的活性,且瞬时表达及稳定表达具有相同的结果.annexinⅡ反义寡核苷酸与单抗均可显著抑制annexinⅡ的促纤溶活性(P＜0.01).结论:annexinⅡ在纤维蛋白溶解中具有重要作用,用本研究构建的annexinⅡ重组载体可为今后的相关研究提供实验基础,并为防治出血及血栓性疾病研究有可能提供新的思路和开辟新的途径.
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pEGFP-restin重组质粒的构建及其在BGC-803胃癌细胞中的表达
目的:构建一种含人肿瘤休眠蛋白基因(restin)的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在胃癌细胞中的表达,为探讨其抗肿瘤作用的分子机制打下基础.方法:从人胚肾组织中,以RT-PCR方法扩增restin基因片段,将restin片段和增强型绿色荧光表达质粒pEGFP-C1酶切、纯化、连接、转化、筛选,构建pEGFP-restin重组质粒,转染胃癌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,并对表达产物进行Western blot鉴定.结果:RT-PCR产物经琼脂糖电泳,在预期位置(600 bp)处阳性条带表达;重组载体经酶切分析,插入片段表达restin基因;pEGFP-restin重组质粒成功转染胃癌细胞,在荧光显微镜下强绿色荧光蛋白表达,Western blot鉴定结果显示pEGFP-restin上的restin基因在BGC-803细胞中正确表达.结论:成功构建了pEGFP-restin重组质粒,为进一步研究restin的功能提供了重要的实验材料.
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miRNA干扰质粒的构建及其对肝癌HepG2细胞IGF-Ⅱ表达的抑制作用
目的:研究miRNA干扰质粒对胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)在肝细胞癌表达的抑制作用,探讨IGF-Ⅱ在肝细胞癌治疗中的价值.方法:以人IGF-Ⅱ基因序列设计并合成4条miRNA,将miRNAA插入质粒构建pcDNA<'TA>6.2-GW/EmGFP miR 1-4干扰载体;筛选、转染HepG2细胞,以荧光定量PCR分析靶向肝癌IGF-Ⅱ基因表达的干扰效果;以XELISA法比较转染前后IGF-Ⅱ蛋白表达水平.结果:测序证实,成功构建了真核IGF-Ⅱ干扰质粒MR-IGF-Ⅱ-1-4,将干扰质粒转染至HepG2细胞,镜下显示转染效率50%;经荧光定量PCR扩增,沉默IGF-Ⅱ基因表达效率MR.IGF-Ⅱ-1为33%、MR-IGF-Ⅱ.2为43%、MR-IGF-Ⅱ-3为0%、MR-IGF-Ⅱ-4为3%.将其中MR-IGF-Ⅱ-2转染:EHepG2细胞,在转录和蛋白水平上对IGF-Ⅱ具有较高干扰效率,分别达43.0%和43.5%.结论:成功构建了人miRNA干扰质粒,他能有效抑制HepG2胞IGF-Ⅱ的表达.
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串联亲和纯化标记的HMGB1细胞因子诱导片段1融合表达载体构建和蛋白纯化及其功能初步探讨
目的:构建高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中细胞因子诱导片段1(CIF1)与串联亲和纯化(TAP)系统中纯化标签链霉亲和素结合肽(SBP)和钙调蛋白结合肽(CBP)序列相融合的原核表达载体,观察重组蛋白对小鼠单核/巨噬细胞白血病细胞释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响,为HMGB1参与炎症反应作用机制的研究以及CIF1结构域细胞膜表面受体蛋白的获得和鉴定奠定基础.方法:采用PCR方法分别扩增出CBP-SBP和CIF1的编码序列,构建表达质粒pET-14b/CBP-SBP-CIF.利用Ni-NTA亲和树脂纯化融合蛋白,纯度达85%以上.采用纯化后的蛋白诱导小鼠单核/巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7,利用LiquiChip液相蛋白芯片系统检测RAW264.7细胞释放TNF-α的水平变化.结果:表达载体构建正确,CIF1重组蛋白表达量高,纯度好.当蛋白浓度大于0.5 ng/μl时,CIF1重组蛋白诱导细胞TNF-α的分泌量与对照组相比差异具有显著性(P<0.05),并且在CIF1蛋白浓度0～2.5 ng/μl范围内,TNF-α的分泌量与CIF1重组蛋白的浓度呈显著的剂量依赖关系.结论:原核表达纯化了His-CBP-SBP-CIF1融合蛋白,该融合蛋白可以有效地作用于巨噬样细胞内的信号转导过程,介导了炎症因子TNF-α的分泌表达.
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构建含有小鼠CD40-IgG2aFc-IRS-GFP融合基因腺病毒并体外检测
目的 构建载有小鼠CD40-IgG2aFc-IRS-GFP融合基因片段的腺病毒载体,并检测其转染293细胞后的融合蛋白表达及出毒情况.方法 提取小鼠CD40、IgG2aFc基因片段构建PDC316-IgG2aFc-GFP质粒,测序成功后包装构建Ad5-PDC316-CD40-IgG2aFc-GFP,转染293细胞.出毒后大量复制病毒并纯化,测定病毒滴度,体外感染细胞观察病毒复制及分泌目的 蛋白情况并检测目的 蛋白表达量.结果 成功构建了质粒及病毒,体外感染显示该病毒能有效的感染细胞并表达蛋白(荧光显示),检测目的 蛋白表达量随时间点及浓度增加而增加.当病毒浓度增加到一定程度时目的 蛋白表达趋于无明显差异性.结论 构建小鼠融合基因片段并成功转入细胞内,分泌表达目的 蛋白是可行的,为进一步研究该病毒在大鼠体内感染及表达CD40Ig、大鼠肝移植模型免疫耐受及其机制的研究奠定了基础.
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基因1b型不同准种株HCV核心蛋白原核表达质粒pTrc-CKS构建及诱导表达
目的 为研究与不同准种HCV 核心蛋白(Core)相互作用的细胞蛋白质组,构建并表达基因1b型的不同准种Core的原核表达质粒pTrc-CKS.方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增并获得等长度片段的基因1b型的不同准种株丙型肝炎病毒(HCV)Core基因,氨基酸(aa)长度分别为癌中心株(T):1～172 aa、癌旁株(NT):1～172 aa及C191(HCV-J6):1～172 aa.扩增产物用Bam HⅠ及Eco RⅠ双酶切后插入到原核表达质粒pTrc-CKS中.阳性克隆转化到大肠埃希菌Top 10F'中,异丙基-β-D-S-代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得融合蛋白CKS-Core-His,经Ni2+10F'柱纯化并经Western blot验证.结果 PCR及双酶切验证表明3个基因为1b型的不同准种Core基因成功构建到原核质粒pTrc-CKS中,体外诱导并获得了相应的融合蛋白.结论 构建不同准种Core基因的原核表达质粒获得成功,体外诱导表达并纯化获得了CKS-Core-His融合蛋白,为后续研究与Core相互作用的细胞蛋白质组奠定了基础.
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靶向活化T细胞核因子1基因的shRNA质粒表达载体的构建
目的 利用pRNAT-U6.1/Neo质粒构建靶向NFAT1基因的3个shRNA,为下一步探索肺癌基因治疗的RNA干扰途径奠定基础.方法 设计3对shRNA(NFAT1-sh-1、NFAT1-sh-2、NFAT1-sh-3),以人类基因同源性差的无关序列(NFAT1-sh-NC)作为阴性对照.筛选与人类其他基因同源性小、特异性针对目的基因的siRNA.合成并克隆至带有U6启动子的pRNAT -U6.1/Neo质粒中,构建质粒表达载体,通过凝胶电泳鉴定后转化至大肠杆菌中进行培养,并提取质粒进行DNA测序鉴定.结果 成功构建和筛选出靶向NFAT1基因的3对shRNA质粒表达载体,GC比例为40％～55％.结论 构建的3个靶向NFAT1基因shRNA质粒表达载体有助于肺癌靶向基因治疗RNA干扰的研究.为筛选有效的基因干扰载体,以及对荷瘤肺癌裸鼠靶向RNAi抗肿瘤细胞生长的研究鉴定了基础.
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人类血管内皮生长因子受体VEGF-R3胞外区1-3环cDNA基因的研究
目的 将VEGF-R3(FIT-4)基因片断插入克隆载体并进行分子生物学鉴定,对肿瘤细胞通过淋巴管转移到局部淋巴结的机制进行研究.方法 用T-A克隆的方法 将RT-PCR产物克隆入质粒载体PGEM-T Easy,转染大肠杆菌JM109,进行蓝白斑筛选,获取重组体单酶切电泳图谱.结果 经过RT-PCR扩增,得到VEGF-R3的cDNA,琼脂糖凝胶电泳显示为一条带,经蓝白斑筛选获得基因VEGF-R3的白色克隆,重组质粒单酶切电泳结果 与预期结果 一致.结论 RT-PCR产物可采用T-A克隆,获得的阳性重组体可用于进一步基因表达及基因治疗等研究.
关键词： 血管内皮生长因子受体3 质粒构建 逆转录聚合酶链反应 T-A克隆 蓝白斑筛选 -
定向敲除牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA的重组质粒构建
目的 构建定向敲除牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)菌毛蛋白FimA基因的质粒pPHU281_A_Spec_B,用于后续构建菌毛蛋白FimA缺陷型Pg,为研究FimA的功能奠定分子基础.方法 厌氧培养PgATCC33277,提取基因组DNA,聚合酶链反应扩增PgFimA基因一定长度的上游A片段及下游B片段,并在扩增片段两端添加合适的酶切位点；利用定向克隆技术将A和B 基因插入到载体自杀质粒pPHU281中,并添加大观霉素抗性基因片段,重组的pPHU281 _A_Spec_B 在大肠杆菌DH-5α内扩增后酶切电泳鉴定并进行DNA测序.结果 通过对重组质粒pPHU281_A_Spec_B进行酶切鉴定以及DNA序列测定分析,证明重组质粒pPHU281_A_Spec_B构建成功.结论 成功构建了质粒pPHU281_A_Spec_B,有利于菌毛蛋白FimA缺陷型Pg的构建,为深入研究FimA的作用机制奠定了基础.
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结核病Mtb8.4基因疫苗构建、表达及诱导的细胞免疫应答
目的制备结核病Mtb8.4基因疫苗,并研究其免疫原性.方法克隆结核杆菌新抗原Mtb8.4基因,导入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Mtb8.4,转染COS-7细胞后,用RT-PCR检测Mtb8.4基因在细胞内正确表达.将Mtb8.4基因疫苗肌肉注射免疫C57BL/6N小鼠,第3次DNA免疫后4周,处死小鼠,制备免疫小鼠脾细胞,脾细胞培养上清检测细胞因子水平;并按效、靶比例分别为100:1、50:1、10:1进行CTL杀伤检测.结果Mtb8.4基因疫苗组免疫小鼠脾细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素2(IL-2)含量分别为787.317±45.586pg/ml和319.953±57.978pg/ml,BCG组分别为1 486.540±39.600pg/ml和767.043±50.269pg/ml,BCG组IL-4的含量为90.580±10.998pg/ml,明显高于其他各组(P＜0.01).效靶比为100:1、50:1、10:1时,Mtb8.4基因疫苗组的CTL活性分别为55.3%、35.7%、9.2%,BCG组分别为28.9%、21.4%、9.8%.Mtb8.4基因疫苗主要使抗原特异性Th1型细胞免疫应答增强,细胞因子IFN-γ和IL-2分泌增加,IL-4分泌减少,CTL活性增加;而BCG使IFN-γ、IL-2和IL-4分泌均增加.结论结核病Mtb8.4基因疫苗能诱导较强的Th1型细胞免疫应答,可作为结核病的候选疫苗.
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电离辐射致线粒体DNA 4977 bp缺失质粒构建及其鉴定
目的建立电离辐射诱导的人线粒体DNA(mtDNA)4977 bp缺失片段和对照DNA片段的稳定质粒,用于线粒体基因组相关研究.方法对无mtDNA 4977 bp缺失的正常人外周血进行离体照射10 Gy60Co γ射线,提取细胞总DNA,用巢式PCR扩增mtDNA 4977 bp缺失片段,普通PCR扩增对照ND1基因片段.PCR产物经纯化后构建质粒;提取质粒DNA,DNA样品经酶切、纯化后测序,将测序结果进行BLAST分析.结果PCR扩增的跨mtDNA 4977 bp缺失的DNA片段和ND1基因片段大小与预期值是吻合的.对制备的质粒DNA样品进行测序,结果经BLAST分析,两种质粒DNA与人线粒体序列同源性在99%以上.结论本研究中所构建的质粒是成功的,可以用于人mtDNA4977 bp缺失的定性或定量研究.
关键词： 电离辐射 线粒体DNA 4977bp缺失 质粒构建 -
pGL3-EPO-α-MHC启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及缺氧调控功能考察
目的 考察EPO-α-MHC启动子在缺氧条件下的调控表达作用.方法 构建pGL3-EPO-α-MHC启动子编码荧光素酶报告基因的质粒,以含pGL3-EPO-α-MHC和pGL3-CMV启动子的质粒分别转染缺氧和常氧的心肌细胞(H9C2),检测荧光素酶的表达.结果 pGL3-CMV启动子质粒在缺氧条件下的报告基因表达与常氧条件相比显著下降(P < 0.05),而pGL3-EPO-α-MHC启动子在缺氧条件下能够显著上调报告基因的表达4.3倍(P < 0.01).结论 EPO-α-MHC启动子具有缺氧调控功能.
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hSesn1基因真核表达载体构建及蛋白的表达和定位
目的 构建人源的Sesn1真核表达载体同时检测融合蛋白在COS-7细胞系内的表达和定位.方法 提取工具细胞系HeLa的mRNA,进而反转录成为cDNA.聚合酶链反应方法扩增人源Sesn1基因的cDNA全长片段,将其克隆于pEGFP-C1真核表达载体中.进一步将已构建好的重组表达载体进行双酶切以及测序鉴定,继而转染到工具细胞系COS-7中,进行Western blot方法检测.后应用激光共聚焦扫描显微镜方法来观察pEGFP-hSesn1在COS-7细胞中的定位情况.结果 hSesn1基因cDNA全长片段克隆至pEGFP-C1真核表达载体中,酶切鉴定片段大小为1479bp,测序证实成功.Western blot方法检测出GFP-hSesn1融合蛋白的成功表达,分子质量(Mr)约为80kDa.pEGFP-hSesn1在COS-7于细胞中主要定位在细胞质及核周.结论 成功构建了pEGFP-hSesn1真核表达载体,进而检测到融合蛋白的表达,并且在COS-7细胞中主要定位于核周及细胞质.
关键词： hSesn1 Western blot 绿色荧光蛋白 质粒构建 -
下调人质膜型唾液酸酶对前列腺癌PC-3细胞增殖、侵袭能力的影响及其机制
目的 探讨人质膜型唾液酸酶(Neu3)表达降低对前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响.方法 构建pGCsi-Neu3质粒,从GeneBank中寻找符合Neu3 mRNA特异的靶序列,合成siRNA模板链后与载体相连接,转入感受态细胞,测序鉴定.应用真核细胞转染技术转染前列腺癌PC-3细胞,利用荧光显微镜检测转染效率;细胞增殖实验检测pGCsi-Neu3质粒对细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡的改变;Transwell迁移、侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力的变化.结果 针对Neu3基因设计了siRNA序列并成功构建pGCsi-Neu3质粒,pGCsi-Neu3-3质粒对基因Neu3的抑制为有效.与对照组比较,pGCsi-Neu3-3质粒可有效抑制肿瘤细胞增殖(P＜0.01);pGCsi-Neu3-3质粒可引起前列腺癌PC-3细胞凋亡,凋亡率明显高于空白对照组(MOCK组),差异有统计学意义(P＜0.05);pGCsi-Neu3-3质粒可使前列腺癌PC-3细胞增殖细胞核抗原表达明显下降;pGCsi-Neu3-3质粒可抑制前列腺癌PC-3细胞迁移、侵袭能力,且与对照组比较,差异有高度统计学意义(P＜0.01).结论 针对Neu3基因siRNA表达质粒的构建、鉴定和初始研究,为Neu3对前列腺癌细胞生长、转移发挥作用机制的研究奠定实验基础.
