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部分性发作癫痫相关SCN1A基因M145fsX148突变体的构建及亚细胞定位
目的 构建部分性发作癫痫SCN1A基因M145fsX148突变体与黄色荧光蛋白(YFP)融合基因表达载体pCMV-YFP-MuSCN1A,观察其在人类神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞中的亚细胞定位.方法 应用基因重组技术,构建YFP与部分性癫痫SCN1A基因M145fsX148融合表达质粒载体,脂质体法转染技术将其与荧光真核表达载体pECFP-ER共转入SH-SY5Y细胞,采用激光扫描共聚焦显微镜观察其亚细胞定位情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序分析证实构建成功,激光扫描共聚焦显微镜显示重组真核表达载体pCMV-YFP-MuSCN1A主要在SH-SY5Y细胞胞质中表达.结论 成功构建部分性发作癫痫相关SCN1A基因M145fsX148突变体与YFP融合基因质粒载体,实验显示其在SH-SY5Y细胞胞质中表达,为该突变基因的进一步研究奠定了基础.
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重组pIRES-AD7c-NTP质粒的构建表达及其对PC12细胞凋亡的影响
目的 构建重组pIRES-AD7c-NTP质粒,探究其对PC12细胞凋亡的影响.方法 构建pIRES-AD7c-NTP重组质粒,通过脂质体体外转染至PC12细胞内,RT-PCR检测凋亡相关蛋白bcl-2和bax的mRNA表达变化含量变化.结果 成功构建pIRES-AD7c-NTP重组质粒并转染至PC12细胞内;重组质粒转染组出现了明显的细胞凋亡,流式细胞仪检测出典型凋亡峰;重组质粒转染组中bcl-2表达低于对照组,bax表达高于对照组.结论 AD7c-NTP重组质粒转染组PC12细胞内bcl-2/bax表达异常,说明AD7c-NTP增加凋亡促进蛋白的表达、同时减少凋亡抑制蛋白的表达,可见AD7c-NTP可导致神经细胞发生凋亡,为后续研究提供实验基础.
关键词： 阿尔茨海默病相关神经丝蛋白 质粒构建 PC12细胞 凋亡 -
PAK4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
目的:构建PAK4基因RNAi慢病毒载体,并对其在涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83细胞中干扰效率进行鉴定.方法:针对PAK4基因RNAi有效靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoRⅠ酶切后的pGCsil-GFP载体连接产生shPAK4i-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用shPAK4i-LV载体、pHelper1.0载体和pHelper 2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度.结果:PCR扩增出插入片段,测序证实成功构建了PAK4-shRNA慢病毒载体shPAK4i-LV.包装并浓缩慢病毒,滴度为2E+9 TU·mL-1.将病毒感染SACC-83细胞,real-time PCR检测PAK4的mRNA表达下调70％以上.结论:成功构建了shPAK4i-LV病毒载体并建立了SACC-83-shPAK4i细胞模型,为PAK4在肿瘤信号转导诵路中的研究提供工作基础.
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心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的CREG蛋白表达载体的构建及鉴定
目的:构建心肌特异性α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)启动子启动E1A基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合的真核表达载体.绿色荧光蛋白作为报告基因,方便在心肌细胞中直接观察CREG蛋白的表达,为心肌特异性转CREG基因动物模型制备提供载体.方法:用BamH I和EcoR I双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1中,构建pCREG-EGFP-Nl;根据Genebank中公布的α-MHC基因的启动子序列,人工合成pUC57-α-MHC启动子基因序列,经AseI和NheI双酶切得到启动子α-MHC,亚克隆入pCREG-EGFP-N1中替代原CMV启动子,构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1,测序鉴定.用脂质体法将该质粒转染体外培养的小鼠原代心肌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达.结果:成功构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1质粒,酶切及测序结果正确;成功转染入原代培养小鼠心肌细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达.结论:重组质粒pα-MHC-CREG-EGFP-N1体外转染入原代培养小鼠心肌细胞后,目的基因能够在心肌细胞中有效表达,检测方法简便可靠,为下一步建立心肌细胞特异性表达CREG的过表达转基因小鼠、深入探讨CREG在心肌疾病发生中的生物学功能研究奠定了基础.
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小鼠DLL1真核表达载体的构建及其在肿瘤细胞中的表达
目的:构建带绿色荧光蛋白的小鼠DLL1全长基因真核表达栽体,并在肿瘤细胞中表达.方法:利用PCR特异性引物扩增出DLL1基因全长,将克隆的基因片段插入带绿色荧光蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP质粒中.然后利用脂质体将重组质粒pIRES2-EGFP-DLL1转染进小鼠B16黑色素瘤细胞中,并通过G418筛选后选取生长良好、荧光强度高的三株单克隆进行mRNA水平DLL1表达的鏊定.结果:成功扩增小鼠DLL1的全长基因.克隆入质粒栽体后,通过DNA序列测定证实其序列正确.将构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒转染小鼠B16黑色素瘤细胞,经过G418筛选和荧光显微镜观察后,挑选得到GFP阳性率90%以上的稳定转染细胞株.RT-PCR检测稳定转染细胞的mDLL1的表达显著增加,进一步证实了pIRES2-EGFP-DLL1的表达效能.结论:成功构建了小鼠DLL1基因的真核表达质粒,证实其在真核细胞B16中可以表达.
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人乳头状瘤病毒癌蛋白E6和E7双标记质粒的构建及应用
目的:构建人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)-16 E6、E7癌蛋白及其突变型的双筛选标记质粒并筛选出稳定表达HPV-16癌蛋白的肺癌A549细胞株.方法:以携带新霉素抗性基因neo的pEGFP质粒(pEGFP-N1)为空载体,在EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点间插入HPV-16 E6、E7及其突变型基因.新构建的质粒鉴定后转染A549细胞并用G418筛选,多次挑取单克隆后用流式细胞仪分选带荧光的细胞.结果:PCR、双酶切鉴定结果及DNA序列测定结果均证实质粒构建正确；PCR扩增结果显示细胞中存在目的基因；流式细胞术结果显示细胞阳性率高；Western blotting结果显示细胞能表达HPV-16 E6、HPV-16 E7蛋白.结论:成功构建pEGFP-E6、E7质粒并筛选出稳定表达E6和E7癌蛋白的A549细胞株,为进一步研究HPV对肺癌的影响奠定了基础；同时发现G418筛选结合流式细胞仪分选可提高稳定转染细胞的阳性率.
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人三叶因子1大肠杆菌及毕赤酵母表达载体的构建与鉴定
目的:构建人三叶因子1(hTFF1)的大肠杆菌及毕赤酵母表达载体.方法:从人胃窦部提取总RNA,经RT-PCR得到hTFF1 cDNA,用PCR方法扩增hTFF1基因,并将其分别克隆到大肠杆菌的表达载体pET32α及毕赤酵母的表达载体pGAPZαA中,构建原核及真核重组表达质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1.结果:通过双酶切和基因序列分析确定插入pET32α和pGAPZαA中的片段为hTFF1基因片段.结论:重组质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1成功构建,为在比较原核和真核细胞中hTFF1高效表达的情况及下一步的功能研究奠定了基础.
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外分泌型的乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗的构建与体外表达
目的:构建含有组织型纤溶酶原激活剂(tPA)信号肽的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)核酸疫苗.方法 将HBcAg基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入pJW4303载体中获得相应的核酸疫苗,经筛选鉴定后,用上述核1酸疫苗与野生型HBcAg核酸疫苗及空载体质粒pJW4303分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测核心抗原的表达.结果 成功构建以pJW4303为载体的含tPA信号肽的HBcAg核酸疫苗,体外表达证实含tPA信号肽的HBcAg在293T细胞胞内和胞外均能表达,含tPA信号肽的HBcAg核酸疫苗的核心抗原表达水平较高.结论 以pJW4303为载体的含tPA信号肽的HBcAg核酸疫苗能够将细胞内的HBcAg分泌到细胞外,为进一步研究其免疫原性打下了基础.
关键词： 乙型肝炎病毒核心抗原 组织纤溶酶原激活剂 质粒构建 核酸疫苗 -
外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化
目的:构建人Nkx2-5基因融合绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,探讨外源性Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化的作用.方法:以真核表达质粒pEFSA-HA-Nkx2-5为模板,PCR扩增得到人Nkx2-5基因,将目的片段亚克隆到pEGFP-N1载体,鉴定正确.将重组质粒pEGFP-N1-Nkx2-5以脂质体法转染P19细胞,G418筛选2周,聚集4d,贴壁培养16d.以免疫细胞化学检测desmin、α-sarcomeric actin和cardiac Troponin T(cTnT)的表达.结果:将Nkx2-5基因正确插入pEGFP-N1载体,外源表达Nkx2-5基因可使P19细胞在无诱导剂、聚集条件下表达desmin、α-sarcomeric actin和cTnT蛋白.结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化.
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针对ATM基因RNA干扰质粒的构建及鉴定
目的:构建针对ATM基因的RNA干扰表达质粒pRiATM,并观察其抑制SPCA1人肺癌细胞ATM表达的效果.方法:构建针对ATM基因的短发夹状小干扰RNA真核表达载体pRiATM,并短暂转染SPCA1细胞,采用荧光定量RT-PCR和Western blotting观察其抑制SPCA1细胞ATM表达的效果.结果:pRiATM1和pRiATM2转染SPCA1细胞后,与转染pRiGFP非特异性对照组相比,ATM mRNA水平分别下降86.4%和77.6%(两组均P＜0.01).与转染pRiGFP对照组相比,pRiATM1组和pRiATM2组ATM蛋白表达水平分别是对照组的4.3%和10.6%(均P＜0.01),以pRiATM1抑制ATM表达效果显著.结论: pRiATM质粒构建成功,转染SPCA1细胞后可以明显抑制ATM基因的表达.
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靶向人端粒酶反转录酶RNA干扰载体质粒的构建与筛选
目的:设计靶向人端粒酶反转录酶的RNAi序列,构建shRNA表达载体质粒和hTERT真核表达质粒,采用共转染工具细胞筛选出有效靶点.方法:首先以EASYMsiRNA软件针对hTERT设计5个靶点siRNA序列和1条通用阴性对照序列,合成shRNA oligo表达框架,将其分别连接至经酶切消化的载体质粒、pGCsi-U6/Neo/GFP、pGCL-GFP,重组质粒转化1)H5α,阳性克隆进行PCR与测序鉴定;然后从cDNA文库中利用PCR钓取hTERT基因片段,与表达载体pEGFP-C1分别进行双酶切、纯化及定向连接、重组、转化,阳性克隆行PCR与测序鉴定,荧光镜检GFP表达;后上述2个质粒系统共转染293T细胞,Western印迹检测hTERT蛋白表达水平,筛选有效序列.应用SPSS16.0软件包对所得数据进行单因素方差分析.结果:BLAST检索5条hTERT siRNA序列均能100%命中,且不与其他基因同源:PCR鉴定及阳性克隆测序验证shRNA oligo与载体质粒成功连接、重组.hTERT基因PCR钓取片段产物大小1.4 Kp,经酶切与质粒连接,形成pEGFP-C1-hTERT表达载体,阳性克隆PCR、测序鉴定确定成功重组;转染293T细胞48h时荧光镜F可观察到GFP标记的hTERT融合蛋白.hTERT表达质粒和shRNA载体质粒共转染293T细胞,48h时Western印迹榆测结果显示:实验各组hTERT蛋白量均有不同程度减少,而内参对照B-aetin和GAPDH尤明显变化.经β-actin校正,得到各组hTERT蛋向相对表达量:KD No.1-5实验组与NC组相比,hTERT基因表达均得到不同程度的敲减(54.61%～76.84%.P＜0.05),其中No.4敲减效能高.结论:5条RNAi设计序列均可有效、特异性地沉默hTERT基因的转录和表达水平,其中以5'-GCAAGTTGCAAAGCArrGGAA-3'敲减效能优;构建外源基因的过表达载体质粒转染工具细胞,可作为RNAi敲减效率筛选的验绩标靶.
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人共刺激分子4-1BBL表达载体的构建及转染Tca8113细胞的研究
目的:克隆人肿瘤坏死因子配体超家族(tumor necrosis factor superfamily,TNFSF)成员4-1BBL基因,构建其真核表达载体,并检测4-1BBL基凶在Tea8113中的表达.方法:从淋巴细胞中提取RNA.用RT-PCR方法将4-1BBL的编码序列cDNA扩增.然后将该基因的编码序列插入真核荧光蛋白载体pEGFP-Cl质粒中.构建成终的表达载体pEGFP-Cl-4-1BBL.运用脂质体方法将pEGFP-Cl-4-1BBL转染Tea8113细胞.转染24h后,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR和免疫印迹检测4-1BBL在该细胞中的表达.经G418筛选后.用有限稀释法建立稳定高表达的带有4-1BBL基因的Tca8113细胞系.结果:从淋巴细胞中提取的RNA经RT-PCR扩增出目的基因4-1BBL,其全长大小为768bp.测序鉴定该序列与GenBank中的序列丰廿同.转染pEGFP-Cl-4-1BBL载体的靶细胞Tca8113中,荧光显微镜下可见其表达绿色荧光蛋白,RT-PCR方法检测到目的基因4-1BBL的768bp大小的cDNA扩增产物.裂解的4-1BBL/Tea8113基因转染细胞膜蛋白中相对分子质量约27.5Kd的特异性条带.结论:转染4-1BBL基因细胞株的建立,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础.
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中国汉族人IgE重链恒定区CH2、CH3及CH4亚基cDNA的克隆
人血清中高水平的IgE是哮喘、过敏性鼻炎、慢性荨麻疹等过敏性疾病的标志,而IgE与效应细胞上IgE高亲和力受体(FcεRⅠ)的相互作用则是这些Ⅰ型变态反应的重要调节步骤[1].很长时间以来,找到抑制它们结合从而治疗过敏性疾病的方法,一直是过敏性疾病研究的重点,所以了解这两个蛋白相互识别的方式以及结合的位点是极为重要的.
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中国汉族人IgE重链恒定区CH2-CH4 cDNA的克隆
人血清中高水平的IgE是哮喘、过敏性鼻炎、慢性荨麻疹等过敏性疾病的标志,而IgE与效应细胞上的IgE高亲和力受体(FcεRⅠ)结合则是这些Ⅰ型变态反应的关键步骤[1].
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GRP78基因过表达载体的构建及在人脐静脉内皮细胞的表达
目的 构建葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因过表达质粒,体外转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)并观察其表达和定位.方法 根据PubMed数据库中GRP78基因信息,设计引物,采用PCR扩增其基因片段;运用基因重组方法双酶切目的基因,并分别将其克隆至含有绿色荧光蛋白(GFP)的pLVX-IRES-ZsGreen1载体以及含有Flag标签的CMV-10载体,经酶切、测序对重组质粒进行鉴定.转染成功构建的质粒至HUVECs,免疫荧光染色法观察蛋白表达和定位,Western blotting验证蛋白过表达情况.结果 酶切和测序鉴定表明成功构建pLVX-GRP78-IRES-ZsGreen1以及CMV-Flag-GRP78的基因重组质粒;将成功构建的pLVX-GRP78质粒转染至HUVECs,可观察到大量绿色荧光表达;将成功构建的Flag-GRP78质粒转染至HUVECs,免疫荧光检测表明Flag-GRP78蛋白表达定位于内质网;Western blotting证实pLVX-GRP78和Flag-GRP78成功过表达.结论 成功构建pLVX-GRP78、Flag-GRP78重组质粒,转染HUVECs并观察到其内质网定位.
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人纤溶酶原Kringle 5区的基因克隆的表达及纯化
目的克隆人纤溶酶原Kringle5(K5)区基因,并进行重组蛋白的表达纯化及活性鉴定.方法用PCR方法从正常成人肝cDNA库扩增出人纤溶酶原K5区基因,构建K5的原核表达载体pET-22b(+)-K5-6×His,IPTG诱导蛋白表达后经Ni+-树脂亲和层析进行纯化,通过血管内皮细胞增殖抑制试验检测蛋白活性.结果经PCR成功扩增出了243 bp的K5区基因,测序正确后克隆进大肠杆菌分泌型表达载体pET-22b(+),重组质粒在BL21中成功表达出分子量为14 000的蛋白质,纯化后的蛋白纯度达95%,具有抑制血管内皮细胞增殖活性的功能,K5蛋白浓度为4 μg/mL时抑制率达50%.结论纤溶酶原K5的成功克隆、表达及纯化可能在肿瘤和动脉粥样硬化的抗血管生成治疗中具有一定作用.
关键词： 人纤溶酶原Kringle5 质粒构建 蛋白纯化 -
含Ⅲ型纤连蛋白域蛋白5真核表达载体的构建及初步功能研究
目的 构建含小鼠FNDC5基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-FNDC5,并初步探索其对C2C12肌细胞的线粒体能量代谢的影响.方法 应用反转录-聚合酶链反应法从小鼠腓肠肌和心脏组织中扩增出两端带有HindⅢ和EcoR Ⅰ酶切位点的FNDC5编码片段,经回收、纯化酶切后,依次连接到质粒PMD19-T和pEGFP-C3上,获得过表达载体后转染至C2C12肌细胞,48 h后以激光共聚焦显微镜拍摄线粒体荧光强度,以荧光定量PCR检测与线粒体能量代谢相关的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表达情况.结果 PCR及测序结果表明:重组质粒pEGFP-C3含有FNDC5段,方向及大小正确,过表达FNDC5可以增强线粒体荧光强度,并增加线粒体能量代谢相关的基因PGC-1β、ATPase6、ND1和ND6的表达.结论 成功构建了小鼠真核表达载体pEGFP-C3-FNDC5,过表达FNDC5可以增强线粒体能量代谢.
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人基质金属蛋白酶组织抑制剂1腺相关病毒表达质粒的构建及检测
目的 构建含人基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1, TIMP1)的腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)表达质粒并观察其在人胚肾293(HEK293)细胞中的表达,为进一步逆转椎间盘退变提供依据.方法 以含有人TIMP1基因序列的质粒pBLAST49-hTIMP1为模板,通过PCR的方法扩增出TIMP1基因,再采用分子克隆的方法,把TIMP1克隆到AAV表达质粒pSNAV2.0构建重组质粒pSNAV2-TIMP1.把重组质粒转染HEK293细胞,用免疫荧光和Western blot的方法对重组质粒的表达进行研究,ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP1蛋白的含量.结果 PCR、酶切、DNA测序等方法均证实成功构建了含有完全正确的TIMP1基因序列的AAV表达质粒pSNAV2-TIMP1.体外成功转染入HEK293细胞,免疫荧光、Western blot及ELISA的结果表明重组质粒能够高表达TIMP1蛋白.结论 成功构建了表达TIMP1的重组质粒pSNAV2-TIMP1,并证实在蛋白质水平获得了表达,为进一步逆转椎间盘退变研究奠定了基础.
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pEGFP-N1-HBsAg-ROP2多基因重组表达质粒的构建及表达鉴定
目的 构建pEGFP-N1-HBsAg-ROP2重组质粒,并转染HEK293T细胞进行表达鉴定,为弓形虫病核酸疫苗的研制奠定基础.方法 根据HBsAg基因序列和pcDNA3-p30-ROP2重组质粒酶切位点设计引物,PCR扩增HBsAg基因,经酶切、连接、转化,利用HBsAg基因替换p30基因,构建pcDNA3-HBsAg-ROP2重组质粒;经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,将HBsAg-ROP2片段与pEGFP-N1真核表达载体相连,构建pEGFP-N1-HBsAg-ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞,观察其蛋白表达水平.结果 HBsAg片段PCR产物约700 bp,与理论值相符;构建pcDNA3-HBsAg-ROP2重组质粒,双酶切电泳后得到约5.4 kb和1.9 kb的两条带,与预期结果相符.pEGFP-N1-HBsAg-ROP2双酶切后产生约4.7 kb和1.9 kb的条带,经测序鉴定,与GenBank发表的序列同源性为99.84%.目的基因已成功转染入HEK293T细胞中,且正确表达,蛋白浓度为3.08 mg/ml.结论 成功构建pEGFP-N1-HBsAg-ROP2重组表达质粒,转染HEK293T细胞能正确表达.
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DNA疫苗的研究进展
近十年的研究证明DNA疫苗在众多的鼠和灵长类动物模型中,能同时诱发体液免疫和细胞免疫.同时,DNA疫苗具有众多传统疫苗无法比拟的优点,因而成为目前疫苗研究中的焦点.文章综述了DNA疫苗的发展、免疫机制、质粒构建、接种途径和方式.DNA疫苗既可用于预防,亦可用于治疗,可应用于感染性疾病,肿瘤及婴幼儿免疫.
